间接法Elisa汇总

Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常见的免疫检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。

Elisa的操作方法和常见问题对于熟练进行实验和解决实验中的问题都至关重要。

以下是Elisa的常见类型、实验标准操作方法以及常见问题的详细介绍。

一、常见类型：1. 间接Elisa：该方法利用抗体的特异性结合性质来检测特定抗原。

首先，在官网上涂上反应性抗原的试样，然后添加能与抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的二抗和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。

2. 直接Elisa：该方法利用特异性抗体与抗原的结合性质来检测特定抗原。

在官网上涂上反应性抗原的试样，然后加入能与抗原结合的标记抗体和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。

二、实验标准操作方法：1.样品制备：收集要检测的样品，并进行必要的处理和制备，如离心、稀释等。

2.官网涂布：将样品或标准物质涂在官网上，并在适当的温度条件下孵育一段时间，使其抗原完全吸附到官网上。

3.阻断：用适当的阻断缓冲液或血清阻止非特异性结合。

4.添加（初级）抗体：加入特异性的初级抗体，让其与官网上的抗原结合。

5.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的初级抗体。

6.添加（二级）抗体：加入特异性的二级抗体，使其与初级抗体结合，并将标记物引入实验系统。

7.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的二级抗体。

8.底物添加：加入含有底物的溶液，使底物被标记物催化，产生颜色反应。

9.反应终止：加入适当的溶液将反应停止。

10.测定：通过检测底物催化反应产生的颜色变化，使用酶标仪等设备测量并分析光密度。

三、常见问题：1.如何选择合适的抗体和标记物？2.如何优化实验条件？在实验过程中，可以通过优化浓度和孵育时间等条件来提高实验的敏感性和特异性。

可以尝试不同浓度的抗体和试剂，并对孵育时间和温度进行调整。

3.如何处理实验结果？实验结果通常会通过测量光密度来表示。

典型的Elisa实验结果可以使用标准曲线进行定量，或者通过比较样品和对照组的光密度差异来进行定性判断。

Indirect ELISA for Monoclonal Antibodies using Peroxidase Conjugated Secondary AntibodyREAGENTS1. Phosphate buffered saline (PBS): 10 mM phosphate buffer pH 7.4, 150 mM NaCl (Tablet,Sigma Product No. P4417) and 15 mM sodium azide (Sigma Product No. S2002).2. Carbonate-Bicarbonate buffer capsule, pH 9.6 (Sigma Product No. C3041).3. Washing buffer (PBS-T): 10 mM phosphate buffer pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20(Sigma Product No. P3563).4. Monoclonal primary antibody.5. Isotype-matched, non-specific mouse immunoglobulin (Mouse Myeloma Proteins).6. Peroxidase conjugated secondary antibody.7. Substrate: SIGMA FAST TM OPD tablets (Sigma Product No. P9187).8. Stopping reagent: 3 M HCl or 3 M H2SO4 (Optional).PROCEDUREAntigen Coating1. Prepare an antigen solution of approximately 2 u g/ml in carbonate-bicarbonate buffer orPBS.2. Pipette 0.2 ml of the above solution to each well of the microtiter plate.3. Incubate at 37°C for 30 min., or incubate (covered) overnight at 4°C.4. Remove the coating solution. Wash three times with PBS-T.Note: If problems with non-specific binding occur, an additional blocking step (30 min. 5% BSA-PBS) may be required. For further information see: Vogt, R.F., et al., J. Immunol. Meth., 101, 43 (1987).Primary Antibody Reaction1. Dilute the monoclonal primary antibodies in PBS-T. The optimal dilution should bepredetermined using a titration assay.2. Add 0.2 ml of the diluted monoclonal antibody to each well. Negative control should beisotype-matched, non- specific mouse immunoglobulin dilutes in PBS-T.3. Incubate at room temperature for 2 hours.4. Wash as in step 4 of Antigen Coating.Application of Secondary Antibody1. Dilute the peroxidase conjugated secondary antibody in PBS-T. Add 0.2 ml of this solution toeach well. The optimal dilution should be predetermined using a titration assay.2. Incubate at room temperature for 2 hours.3. Wash as in step 4 of Antigen Coating.Substrate Preparation1. During the last incubation and immediately before use,dissolve one OPD Tablet and oneUrea Hydrogen Peroxide/Buffer Tablet supplied with SIGMA FAST TM OPD in 20 ml deionized water.Development1. Add 0.2 ml of the freshly prepared substrate to each well.2. Orange-yellow color should develop in positive wells after 30 minutes.3.Plate may be read directly at 450 nm in a microplate reader - or - stop reaction with 50 u l perwell of preferred stopping reagent and read at 492 nm in a microplate reader.。

间接elisa原理一、引言酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种广泛应用于生物学、医学等领域的分析方法。

其中，间接ELISA是其中一种常用的方法。

它通过特定的抗体与抗原相互作用，利用酶做标记来检测样品中是否存在目标物质。

本文将详细介绍间接ELISA的原理。

二、实验步骤1.涂布：将待测物质（如蛋白质）溶液加入到微孔板中，使其在孔壁上均匀地吸附。

2.阻断：在孔壁上添加非特异性蛋白（如牛血清白蛋白），以避免后续步骤中非特异性结合。

3.加入第一层抗体：加入与待测物质相对应的第一层抗体，并与待测物质结合形成复合物。

4.加入第二层抗体：加入与第一层抗体相对应的酶标记二抗，并与第一层抗体结合形成复合物。

5.加入底物：加入底物，使酶催化反应产生可检测的信号。

6.测定：利用光密度计等设备测定底物反应产生的吸光度，从而判断待测物质是否存在。

三、原理解析1.抗原-抗体反应间接ELISA是基于抗原-抗体反应的原理。

在实验中，待测物质（如蛋白质）被吸附到微孔板上，并与第一层特异性抗体结合形成复合物。

此时，如果样品中存在与待测物质相对应的第二层抗体，则第二层抗体会与复合物结合形成更大的复合物。

这种特异性的结合反应是ELISA检测方法的核心。

2.酶标记在间接ELISA中，酶标记是检测结果可视化的关键。

在实验中，第二层抗体被标记上酶（如辣根过氧化物酶），当底物被加入时，酶催化底物产生可检测的信号（如荧光、发光、颜色变化等）。

这种信号可以通过吸光度计等仪器来检测和量化。

3.非特异性结合在实验中，非特异性结合是需要避免的。

为了避免非特异性结合，实验中会加入一定量的阻断剂（如牛血清白蛋白），以防止非特异性蛋白质与抗体结合。

4.优缺点间接ELISA具有以下优点：（1）灵敏度高：ELISA可以检测极低浓度的物质，通常可以检测到纳克/毫升级别的物质。

（2）特异性强：ELISA可以区分不同种类的物质，因为它是基于抗原-抗体反应的原理。

间接法ELISA SOP一、包被1．抗原包被量为20μg/板。

2．例如：抗原浓度为0.8mg/ml。

3．取25μl抗原与20mlCBS（抗原包被液）混匀，100μl/孔。

4．包被完毕后，4℃过夜。

二、封闭1．从4℃冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。

2．加封闭液，200μl/孔。

3．37℃孵育2h。

4．甩干，洗板（3次）。

5．用干燥的自封袋4℃保存。

【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200μl -300μl洗板液，静置2min，甩出，将板拍在干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。

三、一抗1．可洗板一次。

2．阳性对照：1μl阳性血清加入1ml抗原稀释液中，做1：1000稀释（第一孔）。

3．阴性对照：做1：2万稀释。

用1μl阴性血清加入100μl抗原稀释液中，先做1：100稀释。

再从此液取出5μl加入995μl的抗原稀释液中，最终稀释为1：2万。

4．空白对照：只加抗原稀释液。

5．除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100μl抗原稀释液。

6．第一孔加100μl（1：1000）的阳性对照。

7．第二孔加100μl（1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100μl加到3号孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。

1：10001：20001：40001：80001：160001：32000阴性对照（1：2万）空白对照8．将酶标板37℃孵育1h，洗板3次。

【注】：①通常在第一次做Elisa时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数(一般认为吸光值小于0.1的阴性稀释倍数为易)。

②更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。

③在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。

四、二抗本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG1．用0.01MPBS做1：5000稀释（现用现配）。

2．100μl/孔。

3．酶标板37℃孵育30min, 洗板3次。

【注】：采用的二抗的所抗的物种应当与一抗的来源相一致，例如一抗是兔多抗，那么二抗就应该选择羊抗兔或者是其他种属抗兔的酶标二抗。

ELISA六种方法类型及原理ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定抗原或抗体的存在和浓度。

它的原理基于抗原和抗体之间的专一结合，利用酶标记的抗体或抗原来检测并定量目标物。

ELISA有多种不同的方法类型，以下将对其中六种方法类型及其原理进行详细介绍。

1.直接ELISA：直接ELISA是最简单和最常用的ELISA方法，适用于寻找目标抗原。

在这种方法中，被测抗原直接吸附在固相或表面上，然后与特异性酶标记的抗原特异性结合。

最后，通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。

2.间接ELISA：间接ELISA也是常用的方法，适用于寻找目标抗体。

首先，将被测抗原吸附在固相或表面上，然后加入待测抗体。

之后，特异性结合的第二抗体（酶标记的）被加入用于识别和检测第一抗体。

最后通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。

3.竞争ELISA：竞争ELISA用于检测样品中的特定抗原或抗体。

在这种方法中，特异性酶标记的抗原或抗体与待测样品中的抗原或抗体竞争结合。

通过测定酶标记物的信号强度，可以确定待测样品中目标物的含量。

4.间接竞争ELISA：间接竞争ELISA是一种用于定量测定目标抗原的方法。

首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入特异性抗体。

该抗体与样品中的目标物竞争结合。

接着，再加入另一特异性抗体，该抗体与前面结合的抗体有竞争关系。

最后通过测定酶标记物的信号强度，可以确定目标物的浓度。

5.间接夹心ELISA：间接夹心ELISA用于寻找样品中的特定抗体。

首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入待测抗体。

随后，特异性酶标记的第二抗体被加入，用于识别和检测待测抗体。

最后通过测定酶标记物的信号强度，可以定量测定目标抗体的浓度。

6.双抗体ELISA：双抗体ELISA常用于寻找特定抗原。

首先，在固相或表面上吸附被测特异性抗体，然后加入样品。

目标抗原与抗体特异性结合。

接着，酶标记的第二抗体被加入，该抗体与目标抗原结合。

间接ELISA 一实验材料1.96孔酶标板2.TMB 二实验试剂1. 包被液（pH9.6）：Na2CO30.17g，NaHCO30.28g，加蒸馏水至100ml。

4℃保存。

2.洗涤液(PBST):KH2PO40.2g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，Tween-20 0.5ml，加去离子水至1000ml，调pH至7.2-7.4。

3.底物反应液:(1)底物缓冲液:柠檬酸 0.51g，Na2HPO4·12H2O 1.84g，加蒸馏水至100ml，充分溶解，置4℃保存备用。

(2)底物反应液:a.OPD显色：称5mg OPD，避光下加入10ml底物缓冲液，一般现配现用，用时5ml+8ul 30%H2O 2。

b.TMB显色：预先配置10mg TMB/1ml DMSO溶液5ml，避光4℃保存，用时9.9ml底物缓冲液+100ul TMB/DMSO溶液+10ul 3%H2O2避光,现配现用)4.羊抗小鼠IgG-HRP三实验步骤（1）包被：取抗原用包被液稀释至适合的包被浓度,根据所需的孔计算出所需的包被液的量, 每孔加100ul，37℃作用1h后4℃过夜，此步骤是将特异性抗原与固相载体联结。

（2）封闭：次日取出酶标板用PBST加满各孔洗涤3次每次五分钟，每次充分拍干。

然后每孔加入200ul的封闭液（1%BSA或者5%脱脂乳），37℃作用2h，PBST洗涤3次。

（3）加一抗：按一定比例稀释相应的一抗，每孔加100ul稀释液。

设置阴性对照和空白对照， 37℃作用1h，PBST洗涤3次。

此步骤是加稀释受检血清，使血清中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

（4）加二抗：将相对应的二抗以1：5000稀释，每孔100ul，37℃作用1h，PBST洗涤3次。

间接法ELISA SOP一、包被1．抗原包被量为20µg/板。

2．例如：抗原浓度为0.8mg/ml。

3．取25µl抗原与20mlCBS（抗原包被液）混匀，100µl/孔。

4．包被完毕后，4℃过夜。

二、封闭1．从4℃冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。

2．加封闭液，200µl/孔。

3．37℃孵育2h。

4．甩干，洗板（3次）。

5．用干燥的自封袋4℃保存。

【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200µl -300µl洗板液，静置2min，甩出，将板拍在干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。

三、一抗1．可洗板一次。

2．阳性对照：1µl阳性血清加入1ml抗原稀释液中，做1：1000稀释（第一孔）。

3．阴性对照：做1：2万稀释。

用1µl阴性血清加入100µl抗原稀释液中，先做1：100稀释。

再从此液取出5µl加入995µl的抗原稀释液中，最终稀释为1：2万。

4．空白对照：只加抗原稀释液。

5．除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100µl抗原稀释液。

6．第一孔加100µl（1：1000）的阳性对照。

7．第二孔加100µl（1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100µl加到3号孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。

1：10001：20001：40001：80001：160001：32000阴性对照（1：2万）空白对照8．将酶标板37℃孵育1h，洗板3次。

【注】：①通常在第一次做Elisa时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数(一般认为吸光值小于0.1的阴性稀释倍数为易)。

②更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。

③在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。

四、二抗本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG1．用0.01MPBS做1：5000稀释（现用现配）。

间接ELISA的原理及应用1. 什么是间接ELISA间接ELISA全称为酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用的免疫学检测方法。

它依靠特定抗原和抗体之间的高度专一性反应，通过酶标记抗体或抗原的相互作用来检测目标物质的存在和浓度。

2. 间接ELISA的原理间接ELISA的原理是将待测物与特定抗原偶联到固定在微孔板上的抗原表面上。

然后引入与待测物特异性结合的酶标记抗体，使其与待测物结合。

接下来，通过添加底物，酶标记抗体催化底物的变色反应，从而间接检测出待测物的存在。

间接ELISA的步骤如下：1.固相涂布：将抗原溶液均匀涂布在微孔板上，使其在孔壁上固定。

2.阻断：加入一定浓度的非特异性抗体，使其与未吸附的表面结合，防止非特异性的结合。

3.加入待测物：将待测物标本加入到微孔板中与固相抗原发生特异结合。

4.加入检测抗体：加入配有酶标记的抗体，该抗体有望与待测物结合形成夹心免疫复合物。

5.洗涤：洗涤微孔板以去除未结合的物质。

6.加入底物：加入含有底物的试剂，底物受到酶催化产生变色反应。

7.阅读测量：使用酶标仪对底物反应产生的颜色进行定量检测。

3. 间接ELISA的应用间接ELISA广泛用于医学、生命科学研究、生物制药和农业领域。

以下是间接ELISA在不同领域的应用：3.1 医学领域间接ELISA在医学领域的应用非常广泛，主要用于以下几个方面：•临床诊断：可以用于检测疾病的早期诊断，如艾滋病、肝炎、结核病等。

•药物监测：可以测定药物的浓度，监测药物治疗的疗效和剂量。

•免疫学研究：可用于研究免疫系统的功能和疾病发生机制。

3.2 生命科学研究间接ELISA在生命科学研究中也有广泛的应用，主要用于以下方面：•蛋白质检测：可以用于检测目标蛋白质在细胞或生物体中的表达量。

•抗体研究：可以用于检测抗体在细胞或液体中的浓度，了解免疫应答和抗体产生的情况。

•基因表达：可以用于检测转基因植物或动物中目标基因的表达水平。

间接ELISA检测植物病毒一实验目的酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）是常用的检测病毒的方法，ELISA法有多种，本实验介绍最简便和常用的间接ELISA法，以加深对间接ELISA 试验原理和步骤的了解，掌握试验结果判断方法。

二实验原理间接ELISA的原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-抗体复合物，再用酶标二抗(如羊抗兔IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗原。

三实验结果判断（1）酶标仪读数判断方法：当样品OD490值≥阴性对照OD490值的2倍，样品判断为阳性；（2）目测判断方法：当样品的颜色与阳性对照颜色一致或深于阳性对照，样品判断为阳性。

四检测材料CMV抗血清；系统感染病毒的植株（学生自己采的疑似感染病毒症状的样品，一人采一个样品）；设置阳性和阴性及空白对照。

酶联板；洗瓶；微量取液器(40－200 μl可调，1000ul可调，20ul可调）；包被缓冲液；洗涤缓冲液；IgG稀释缓冲液；底物溶液；邻苯二胺(OPD）；过氧化氢（H2O2 ）；2M硫酸。

五. 配制缓冲液(1)抗原包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6) ：Na2C03 1.59g；NaHCO3 2.93g；蒸馏水加至1升。

(2).洗涤缓冲液(0.02MPBS-吐温缓冲液，PBST，pH7.4)：NaCl 8.0g ；Na2HPO4 '12H2O 2.93g；KH2PO4 0.2g；KCl 0.2g；蒸馏水加至1升后加Tween-20 0.5ml.(3).CMV抗血清稀释缓冲液(0.02MPBST，牛血清白蛋白溶液)取0.1g牛血清白蛋白溶于用灭菌蒸馏水配制的PBST缓冲液100ml中即成。

(4).底物溶液(邻苯二胺溶液)pH5.0柠檬酸2.55g ; Na2HPO4 .12H2O 9.2g加蒸馏水500ml称取40mg邻苯二胺(OPD)，溶解后加上述缓冲液至100ml，临用前加30％H2O20.15ml 即成(注意邻苯二胺需现配现用).六实验步骤（1）加抗原用包被缓冲液将阳性对照、阴性对照及待测样品按一定比例进行稀释后，在酶标板上每孔加100μl，并设空白对照，于4 ℃冰箱中保湿过夜。

ELISA原理和几种方法ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）是一种基于免疫学原理的广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的试验方法。

其原理是利用酶标记的抗体特异性结合待检测样品中的抗原，通过酶的催化作用可产生可测量的信号，从而得到待检测物质的含量或者存在与否。

1.直接和间接ELISA直接ELISA方法利用抗体的特异性与待测抗原结合，然后使用酶标记的二抗与抗体结合，最后通过酶促反应产生可测量的信号。

这种方法的优势是快速、简便、灵敏，但可能会受到待测样品中其他成分对结果影响。

间接ELISA方法在抗原检测过程中引入第二抗体，即先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，然后再添加酶标记的二抗，最后通过酶促反应产生可测量的信号。

间接ELISA方法具有较高的灵敏性和特异性。

2.竞争ELISA竞争ELISA方法主要用于检测待测样品中含有的抗原或者小分子的结合物。

这种方法将标记好的抗原和样品中的抗原同时参与竞争与抗体结合，通过比较信号减弱程度来推断待测样品中的抗原含量。

竞争ELISA方法适用于测定一些药物、激素、多肽等小分子物质。

3.夹心ELISA夹心ELISA方法与间接ELISA类似，不同之处在于在固定的抗原上添加待测物和酶标记的抗体，形成“抗原-待测物-抗体-酶标记抗体”的夹心结构。

夹心ELISA方法可以检测血清中的抗体或者病原微生物，具有高灵敏度、高特异性的优点。

4.反应速率ELISA反应速率ELISA方法是通过等量连续添加底物，通过酶催化反应的速率来测定待检测物质的含量。

这种方法通常更加灵敏，并且可以测定底物转化的程度，可以应用于药物浓度测定和代谢物鉴定等领域。

总之，ELISA方法是一种非常重要的生物学检测技术，可以快速、简便地检测待测物质的含量或者存在与否。

不同的ELISA方法适用于不同的检测对象和目的，在生物医学研究和临床诊断中起到了重要的作用。