激酶检测：PKC蛋白激酶活性检测实验服务案例

丙酮酸激酶检测试剂盒测定原理一、概述在生命科学研究中，分子生物学领域的检测试剂盒广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物筛选等方面。

丙酮酸激酶检测试剂盒是一种用来测定丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase，简称PK）活性的试剂盒。

本文将从以下几个方面介绍丙酮酸激酶检测试剂盒的测定原理：•丙酮酸激酶简介•丙酮酸激酶检测试剂盒组成•丙酮酸激酶检测试剂盒测定原理二、丙酮酸激酶简介丙酮酸激酶是一种在糖酵解过程中起关键作用的酶，它能够催化丙酮酸与磷酸化物（如ADP）反应生成磷酸丙酮酸和ATP。

丙酮酸激酶广泛存在于真核生物和原核生物的细胞质中，是细胞能量代谢的重要调控因子。

三、丙酮酸激酶检测试剂盒组成一般来说，丙酮酸激酶检测试剂盒由以下几个组分组成： 1. 丙酮酸激酶底物：一种特定的丙酮酸底物。

2. 辅酶：用于促进丙酮酸激酶的催化活性。

3. PK反应缓冲液：用于维持反应环境的稳定性。

4. 酶标试剂：用于测定反应终点的标记试剂。

5. 正样品：已知浓度的丙酮酸激酶样品，用于构建标准曲线。

四、丙酮酸激酶检测试剂盒测定原理丙酮酸激酶检测试剂盒测定原理基于丙酮酸激酶催化丙酮酸与磷酸化物反应的特性。

具体步骤如下：1. 样品制备将需要测定丙酮酸激酶活性的样品收集，并通过离心等方法，将样品从细胞或组织中提取出来，得到纯化的丙酮酸激酶。

2. 反应体系配置按照试剂盒说明书中的配方，将丙酮酸底物、辅酶和PK反应缓冲液按一定比例混合，制备反应底物液。

3. 样品处理将制备好的样品与反应底物液按照一定比例混合，使得反应体系达到相应的浓度。

4. 反应过程将混合好的反应物置于适当的温度下孵育一段时间，使丙酮酸激酶催化底物发生反应，生成磷酸丙酮酸和ATP。

5. 酶标反应将反应终止或稀释后的样品取出，加入酶标试剂，进行酶标反应。

酶标试剂中的特定物质与ATP反应，产生荧光或颜色信号。

6. 信号测定使用合适的光谱仪或读板仪器，测定酶标反应后的荧光或颜色信号的强度。

激酶活性测定方法
激酶活性测定方法是用来测量生物体内激酶酶活性的实验方法。

激酶是一种能够催化底物分子转化为产物的酶，通常通过磷酸化底物来进行催化反应。

常见的激酶活性测定方法包括：
1. 放射性测定：将激酶反应体系中的底物标记上放射性同位素，通过测量反应产生的放射性底物酶解产物，来确定激酶的活性。

2. 荧光测定：利用荧光标记的底物，通过测量反应产生的荧光强度变化来测定激酶的活性。

常见的方法有荧光共振能量转移（FRET）和荧光极化。

3. 酶促颜色反应：将激酶反应体系中的底物溶液与某种荧光标记的酶结合，通过测量荧光强度的变化来测定激酶活性。

4. 无标记测定：利用质谱等无标记技术，通过测量激酶反应产物与底物的质量比，来确定激酶的活性。

需要注意的是，选择合适的激酶活性测定方法需要考虑到底物特性、实验操作的可行性和灵敏度等因素，并且需要与其他实验数据进行比较与分析，从而得出准确可靠的结果。

激酶检测方法的最新研究进展刘杨;邹笑然;李琛琛;张春阳【摘要】Kinases are a class of enZymes that catalyZe the transfer of a phosphate group from a high-energy molecule to their substrates ( i.e., phosphorylation ).Kinase-induced intracellular phosphorylation plays important roles in a variety of cellular processes including metabolism, cell signaling, protein regulation, DNA replication and repair.Consequently, kinases have become potential biomarkers for disease diagnosis and drug discovery, and the development of simple and sensitive methods for kinase assay is highly desirable.In this review, we summariZe the recent advances in kinase assays with protein kinase A (PKA), casein kinase-2( CKⅡ) and T4 polynucleotide kinase ( T4 PNK) as the models.We focus on the newly emerging methods for kinase assays including fluorescent, single-molecule detection, colorimetric, chemiluminescent, bioluminescent, and electrochemical and photoelectrochemical methods.Furthermore, we give a new insight into the future direction of kinase assays.%激酶是生物体内一类重要的磷酸转移酶,能够催化磷酸基团由高能磷酸基团供体分子(如ATP)向特定底物分子转移.激酶不但在新陈代谢、细胞信号传导、蛋白质调控、细胞传输等过程中起着关键作用,而且在临床诊断、药物研发及疾病靶向治疗等方面也发挥着重要作用.因此,发展灵敏度高、特异性好的激酶检测方法十分必要.本文以蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)、酪蛋白激酶(Casein kinase-2,CKⅡ)、T4多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)为例,对近年来发展的激酶检测方法进行了综述,着重介绍了荧光分析法、单分子检测、比色法、化学发光和生物发光分析法、电化学和光电化学分析法,并对激酶检测方法的发展方向进行了展望.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2018(046)001【总页数】9页(P11-19)【关键词】激酶;灵敏检测;分析方法;评述【作者】刘杨;邹笑然;李琛琛;张春阳【作者单位】山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250014;山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250014;山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250014;山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250014【正文语种】中文激酶(Kinase)是生物体内一类催化磷酸基团由高能磷酸基团供体分子(如ATP)向特定底物分子转移的酶，其催化的磷酸基团转移过程亦称磷酸化。

香烟烟雾提取物通过蛋白激酶 C-核因子相关因子2调节大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶1表达江刚;张卫东【摘要】目的：探讨蛋白激酶C（PKC）-红系衍生的核因子相关因子2（Nrf2）对香烟烟雾提取物（CSE）诱导的大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶1（HO-1）表达的影响。

方法：通过CSE刺激雄性SD大鼠气道上皮细胞，使用PKC抑制剂RO318220和Nrf2 siRNA，将细胞分为对照组、CSE 3 h组、RO318220组、Nrf2 siRNA组和RO318220＋Nrf2 siRNA组，用Western blotting法分别检测HO-1、Nrf2和p-PKC蛋白表达，免疫细胞化学法观察HO-1蛋白表达，逆转录-聚合酶链反应（ RT-PCR）法检测HO-1 mRNA表达，免疫荧光法检测Nrf2蛋白定位，测定HO-1活性。

结果：暴露CSE 3 h后，Nrf2蛋白主要表达在胞核，胞核蛋白表达增强，p-PKC蛋白、HO-1的mRNA和蛋白高表达， HO-1活性增强。

预先给予RO318220，PKC蛋白、Nrf2胞浆和胞核蛋白、HO-1的mRNA 和蛋白表达均明显减弱， HO-1活性显著降低。

预先用siRNA沉默Nrf2，胞浆和胞核的Nrf2蛋白表达均减弱，HO-1活性、mRNA和蛋白水平明显降低。

RO318220联合Nrf2 siRNA处理后，PKC蛋白、Nrf2胞浆和胞核蛋白、HO-1 mRNA和蛋白表达均明显降低，HO-1活性明显降低。

结论：CSE通过PKC激活Nrf2，诱导Nrf2核转位，从而上调HO-1的表达水平。

%[ABSTRACT]AIM:Toobservetheeffectofthesignalingpathwayofprotein kinaseC(PKC)-nuclearfactor-ery-throid 2-related factor 2 (Nrf2) on the expression of heme oxygenase-1 (HO-1) induced by cigarette smoke extract (CSE) in the rat airway epithelial cells .METHODS:After exposed to CSE , the airway epithelial cells of male SD rats were di-vided into controlgroup , CSE3 group, RO318220 group, Nrf2 siRNA group andRO318220+Nrf2 siRNA group.The pro-tein levels of HO-1, Nrf2 and PKC were semi-quantified by Western blotting .The protein expression of HO-1 was assessed by immunocytochemistry .The mRNA expression of HO-1 was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) .Nrf2 protein location was observed by immunofluorescence staining .HO-1 activity was also determined .RE-SULTS:After exposure to CSE for 3 h, the Nrf2 protein was mainly located in the nucleus , and the expression level of Nrf2 protein in the nucleus was stronger than that in the control cells .CSE also significantly enhanced the levels of p-PKC protein, and HO-1 mRNA, protein and activity .Pretreatment withRO318220 significantly decreased the levels of PKC pro-tein, Nrf2 protein, and HO-1 mRNA, protein and activity.Meanwhile, Nrf2 protein significantly decreased , and the activ-ity, mRNA and protein levels of HO-1 were also significantly attenuated by pretreatment with siRNA to knock down Nrf2. Pretreatment with RO318220 and Nrf2 siRNA significantly decreased the PKC protein , Nrf2 protein, and HO-1 mRNA, protein andactivity .CONCLUSION:CSE up-regulates the HO-1 expression through PKC-induced nuclear translocation of Nrf2 in the rat airway epithelial cells .【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2014(000)008【总页数】6页(P1483-1488)【关键词】香烟烟雾提取物;蛋白激酶C;红系衍生的核因子相关因子2;血红素加氧酶1【作者】江刚;张卫东【作者单位】湖南省人民医院呼吸内科，湖南长沙410005;湖南省人民医院呼吸内科，湖南长沙410005【正文语种】中文【中图分类】R563.3氧化应激机制是引起慢性阻塞性肺疾病(chro-nic obstructive pulmonary disease，COPD)的主要发病机制之一。

蛋白激酶c 氧化应激-概述说明以及解释1.引言1.1 概述蛋白激酶C (protein kinase C, PKC) 是一类具有酶活性的蛋白质，在细胞内发挥着重要的调控功能。

它参与多种信号转导途径，可以调节细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程。

氧化应激是指细胞内产生过多的活性氧物质，导致细胞内氧化还原平衡失调，从而引发一系列的细胞损伤和病理变化。

在氧化应激过程中，蛋白激酶C扮演着重要的角色。

本文旨在探讨蛋白激酶C在氧化应激中的作用机制以及与氧化应激相关疾病的关系。

首先，我们将介绍蛋白激酶C的定义与功能，包括它作为一种酶的特点和它所参与的信号转导通路。

接着，我们将详细阐述氧化应激的概念与机制，包括引起氧化应激的活性氧物质及其生成途径。

随后，我们将着重讨论蛋白激酶C在氧化应激中的作用机制，包括其在细胞内的定位与激活方式等。

此外，我们还将对蛋白激酶C与氧化应激相关疾病的研究进展进行综述。

近年来，许多研究表明，蛋白激酶C在氧化应激过程中的异常表达和功能异常与多种疾病的发生和发展密切相关。

例如，某些癌症、心血管疾病以及神经退行性疾病等都与蛋白激酶C的活性失调和氧化应激的增加有关。

最后，我们将总结蛋白激酶C在氧化应激中的作用和意义，并讨论当前研究存在的问题和展望。

通过对蛋白激酶C氧化应激的深入理解，我们有望为相关疾病的防治提供新的思路和策略。

综上所述，本文将全面探讨蛋白激酶C在氧化应激中的作用机制及其与相关疾病的关联，旨在深化对氧化应激生物学的认识，并为相关疾病的研究和治疗提供理论依据。

1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：文章结构这一部分主要介绍了整篇文章的组织结构和各个章节的内容概述，读者可以通过这一部分对整个文章的框架有一个清晰的认识。

2.正文部分分为四个章节，分别是蛋白激酶c的定义与功能、氧化应激的概念与机制、蛋白激酶c在氧化应激中的作用以及蛋白激酶c与氧化应激相关疾病的研究进展。

2.1 蛋白激酶c的定义与功能部分将介绍蛋白激酶c的基本定义和功能，包括其结构、酶活性以及在细胞信号转导中的作用。

实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。

操作步骤：1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。

2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。

3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。

用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。

4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。

随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。

5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。

6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5×Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。

在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。

阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。

标准PKC检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5X Solution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul样品 9ul去离子水使终体积为 25ulPKC阳性对照检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ulProtein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer） 4ul去离子水使终体积为 25ulPKC阴性对照检测（不加PKC）PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul去离子水使终体积为 25ul（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）。

乳腺癌细胞的趋化运动和黏附能力1万五洲，张宁北京大学化学与分子工程学院化学生物学系，北京(100871)E-mail: nzhangchina@摘要：目的研究蛋白激酶 C ζ (PKCζ) 降低表达对乳腺癌细胞趋化运动和黏附能力的影响。

方法利用RNA干扰技术特异性降低PKCζ蛋白在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达，通过滤膜小室法 (Mircro-Boyden Chamber) 检测细胞的趋化运动能力，通过细胞黏附实验检测细胞的黏附能力。

结果 RNA干扰有效的降低了乳腺癌MDA-MB-231细胞中PKCζ蛋白的表达。

在表皮生长因子受体 (EGFR) 诱导下，与参照细胞相比，PKCζ降低表达后的细胞趋化运动能力和黏附能力都显著下降。

结论 PKCζ降低表达削弱了乳腺癌细胞的趋化运动能力和黏附能力。

关键词：蛋白激酶C ζ，表皮生长因子受体，乳腺癌，趋化运动，黏附中图分类号：R7371.引言PKCζ是蛋白激酶C (PKC) 家族的成员之一，属于非典型性PKC；与经典型PKC和新型PKC不同，PKCζ的激活不依赖于钙离子 (Ca2+) 或二酯酰甘油 (DAG)[1]。

研究表明，PKCζ在细胞的凋亡、极化及黏附过程中都发挥着重要作用：在人Caco-2细胞中，PKCζ可以抑制胶原蛋白依赖性及不依赖性的细胞增殖，促进细胞凋亡[2]；在星形胶质细胞的迁移过程中，PKCζ与Par6/Cdc42 形成了复合物，共同控制细胞的极化[3,4]；在嗜中性粒细胞的运动过程中，PKCζ可能还参与了Gi 蛋白所诱导的细胞黏附和肌动蛋白聚集过程[5]。

许多肿瘤细胞，如乳腺癌、肺癌、胃癌等的恶性转化都和细胞内 PKC 的表达水平升高或突变有关，但是对于PKC在癌细胞运动过程中的作用目前还研究较少[6]。

本文以乳腺癌MDA-MB-231细胞为模型，探讨了PKCζ降低表达对乳腺癌细胞趋化运动能力和黏附能力的影响。

2.材料和方法2.1 MDA-MB-231细胞的培养和传代人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞购自美国细胞菌种库 (American Type Culture Collection, ATCC) (Manassas, VA, USA)，来源是人乳腺器官，属于上皮细胞腺癌。

蛋白激酶A与蛋白激酶C的研究进展Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】蛋白激酶A与蛋白激酶C的研究进展摘要：蛋白激酶A（PKA）与蛋白激酶C（PKC）是参与细胞信号转导的两类物质。

PKA全酶是四聚体，由两个调节亚基R和两个催化亚基C组成，PKC均为单链多肽，分为3类。

PKA参与的信号通路以cAMP为第二信使，而PKC参与的信号通路却以DAG和IP3为信使。

这两个信号通路都是由G蛋白耦联受体所介导的，都能调控基因的转录，而在这个过程中，PKA进入细胞核，PKC则与质膜结合。

关键字：蛋白激酶A（PKA）蛋白激酶C（PKC）第二信使磷酸化1前言蛋白激酶是一类在胞内信使依赖的、在蛋白质磷酸化过程中起中介和放大作用并帮助完成信号传递过程的酶。

蛋白激酶负责将磷酸基团转移到特定底物蛋白上，这类酶用 ATP 或GTP作为磷酸基团的供体，而蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸作为磷酸基团的受体。

目前己发现在真核细胞内有400多种蛋白激酶，它们催化多种功能蛋白，如酶、受体、运输蛋白、调节蛋白、核内蛋白等。

功能蛋白通过磷酸化和去磷酸化，发生构象互变，导致功能蛋白的活性、性质的改变，从而调节细胞各个生命活动过程。

本文简要介绍蛋白激酶大家族中其中的两类：蛋白激酶A与蛋白激酶C。

蛋白激酶A(PKA)又叫cAMP依赖性蛋白激酶，是Kerbs等人在继sutherland 等人提出cAMP第二信使的概念之后，在研究糖原的代谢过程中发现的．是普遍存在于动物体内的一种蛋白激酶。

近年来，cAMP作为第二信使的研究较多，有学者已经从分子水平上研究cAMP与人类疾病的关系，如细胞的异常生长和增殖等。

蛋白激酶A特别是蛋白激酶A Iα(PKA Iα)作为cAMP的主要调节分子，在癌细胞系、原发性肿瘤和增生过度的细胞中呈过度表达。

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是细胞信号转导途径中的重要递质。

一、实验目的本实验旨在通过磷酸肌酸底物法测定肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）的活性，并探讨其在生物体内的功能。

通过实验，了解CK活性受温度、pH值等因素的影响，以及酶的激活和抑制现象。

二、实验原理肌酸激酶（CK）是一种广泛存在于生物体内的重要酶，参与细胞内能量代谢过程。

磷酸肌酸底物法是一种常用的测定CK活性的方法。

该法基于CK催化磷酸肌酸（Creatine Phosphate，CP）与ADP反应生成ATP和肌酸（Creatine，Cr）的原理。

在特定条件下，ATP的生成量与CK的活性成正比。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 肌酸激酶样品- 磷酸肌酸（CP）- ADP- NADH- 磷酸氢二钠（NaH2PO4）- 磷酸二氢钠（Na2HPO4）- 氯化镁（MgCl2）- 氯化钠（NaCl）- 碘化钾（KI）- 碘液- 水浴锅- 移液器- 试管- 离心机2. 实验仪器：- 分光光度计- 烧杯- 量筒- 胶头滴管- 恒温箱四、实验方法与步骤1. 配制底物溶液：- 称取一定量的CP，用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。

- 称取一定量的ADP，用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。

- 将NADH用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。

2. 配制反应混合液：- 取若干试管，分别加入不同浓度的肌酸激酶样品、磷酸肌酸溶液、ADP溶液、NADH溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液、氯化镁溶液和氯化钠溶液。

- 将混合液置于水浴锅中，调节温度至实验设定的温度。

3. 测定酶活性：- 在特定时间点，向反应混合液中加入碘液，观察溶液颜色的变化。

- 用分光光度计测定溶液在特定波长下的吸光度值。

- 根据吸光度值计算酶活性。

4. 稳定酶活性：- 在实验过程中，分别调节pH值和温度，观察酶活性的变化。

五、实验结果与分析1. 酶活性与温度的关系：- 实验结果表明，随着温度的升高，CK的活性逐渐增加，但当温度超过一定范围时，酶活性开始下降。