细菌的常用生化试验
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细菌鉴定中常用的九个生化反应
１、糖酵解试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。
可用指示剂及发酵管检验。
试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。
接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。
２、淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。
淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20°培养5天。
然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。
立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。
阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。
淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。
培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。
淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。
3 、明胶液化试验有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。
试验方法：挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。
于20~22℃培养7~14天。
明胶高层亦可培养于36±1℃。
每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。
细菌的生化试验
细菌生化反应
一、枸橼酸盐利用实验 二、吲哚试验 三、硫化氢试验 四、脲酶试验细ຫໍສະໝຸດ 的生化实验简介部分细菌生化试验
细菌的生化反应是指用化学 反应来测定微生物的代谢产 物，生化反应常用来鉴别一 些在形态和其它方面不易区 别的细菌，简单来说，就是 鉴别细菌。因此细菌生化反 应是细菌分类鉴定中的重要 依据之一，检验中常用的生 化反应有：氧化酶试验，触 酶试验，氧化发酵试验等。
吲哚（indole）试验：有些细菌如大肠埃希菌、 变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨 酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲 基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色， 是为吲哚试验阳性。
三、硫化氢试验
有些细菌如变形杆菌等能分解胱氨酸，甲 硫氨酸等含硫氨基酸，生成硫化氢。若遇 醋酸铅或硫酸亚铁，则生成黑色硫化铅或 硫化亚铁。
一、枸橼酸盐利用实验
在以枸橼酸钠为唯一碳源的 培养基，某些细菌（如产气 杆菌）分解枸橼酸钠产生碳 酸盐，并分解铵盐生成氨， 使培养基由酸性变为碱性， 培养基中指示剂溴麝香草酚 蓝（BTB）由淡绿色变为深 蓝色，此为阳性。大肠杆菌 因不能利用枸橼酸盐，此试 验为阴性反应。
二、吲哚试验
吲哚：
1.其外观呈无色或 浅黄色片状结晶。 有特殊气味。露置 空气中或见光色即 变红并树脂化。 2.溶于热水、热乙 醇、乙醚、苯。能 随水蒸气同时挥发。
四、脲酶试验
脲酶又称尿素酶。某 些细菌有脲酶（如变 形杆菌）有脲酶，能 分解培养基中的尿素 产生氨，是其碱性增 加，可用酚红指示剂 检测，呈红色，为阳 性。沙门菌无脲酶， 则为阴性。
一、枸橼酸盐利用实验 二、吲哚试验 三、硫化氢试验 四、脲酶试验细ຫໍສະໝຸດ 的生化实验简介部分细菌生化试验
细菌的生化反应是指用化学 反应来测定微生物的代谢产 物，生化反应常用来鉴别一 些在形态和其它方面不易区 别的细菌，简单来说，就是 鉴别细菌。因此细菌生化反 应是细菌分类鉴定中的重要 依据之一，检验中常用的生 化反应有：氧化酶试验，触 酶试验，氧化发酵试验等。
吲哚（indole）试验：有些细菌如大肠埃希菌、 变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨 酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲 基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色， 是为吲哚试验阳性。
三、硫化氢试验
有些细菌如变形杆菌等能分解胱氨酸，甲 硫氨酸等含硫氨基酸，生成硫化氢。若遇 醋酸铅或硫酸亚铁，则生成黑色硫化铅或 硫化亚铁。
一、枸橼酸盐利用实验
在以枸橼酸钠为唯一碳源的 培养基，某些细菌（如产气 杆菌）分解枸橼酸钠产生碳 酸盐，并分解铵盐生成氨， 使培养基由酸性变为碱性， 培养基中指示剂溴麝香草酚 蓝（BTB）由淡绿色变为深 蓝色，此为阳性。大肠杆菌 因不能利用枸橼酸盐，此试 验为阴性反应。
二、吲哚试验
吲哚：
1.其外观呈无色或 浅黄色片状结晶。 有特殊气味。露置 空气中或见光色即 变红并树脂化。 2.溶于热水、热乙 醇、乙醚、苯。能 随水蒸气同时挥发。
四、脲酶试验
脲酶又称尿素酶。某 些细菌有脲酶（如变 形杆菌）有脲酶，能 分解培养基中的尿素 产生氨，是其碱性增 加，可用酚红指示剂 检测，呈红色，为阳 性。沙门菌无脲酶， 则为阴性。
实验三 细菌鉴定中的几种生化试验
吲哚试剂 （对二甲基氨基苯甲醛）
玫瑰吲哚 （阳性反应）
2、V-P试验 [原理]
葡萄糖
丙酮酸
缩合
乙酰乳酸
脱羧
乙酰甲基甲醇
碱性条件
二乙酰
与培养基中精氨酸 的胍基结合
红色化合物（阳性反应）
3、MR试验
[原理]
葡萄糖 丙酮酸
大量混合酸
pH值降至4.5以下
非酸性末端产物(醇、醛等）
pH值＞6.2 甲基红指示剂 培养基橘黄色(阴性反应)
荡，再放入 37℃温箱中保温 15-30min。若培养物呈
红色者，为VP 试验反应阳性 3、 “+”表示阳性反应， “-”表示阴性反应。
MR试验
1、将另一半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入甲 基红试剂 2 滴，培养基变为红色者为阳性，变黄 色者为阴性。 2、 “+”表示阳性反应， “-”表示阴性反应。
细菌生化实验误差原因？
柠檬酸盐 利用试验 吲哚试验 硫化氢试验
IMViC 试验
硝酸还原酶试验， 淀粉水解试验
内容
一、糖发酵试验 二、IMViC试验
1、吲哚试验
2、V-P试验 3、MR试验 三、淀粉水解试验
说明
1、本次细菌的生化试验仅选择5项代表性试验
2、本次实验均按传统的生化试验方法进行检测
现代快速生化检测
现代快速生化检测
实验三
细菌鉴定中常用的几种生化试验
细菌的生化试验
用生化的方法来检测细菌对各种基质 的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌 种类，这种生化试验称为细菌的生化反 应试验；是鉴别细菌的重要依据 。
碳水化合物 代谢试验
糖发酵试验 甲基红试验（MR） V-P试验
常 见 的 生 化 反 应
玫瑰吲哚 （阳性反应）
2、V-P试验 [原理]
葡萄糖
丙酮酸
缩合
乙酰乳酸
脱羧
乙酰甲基甲醇
碱性条件
二乙酰
与培养基中精氨酸 的胍基结合
红色化合物（阳性反应）
3、MR试验
[原理]
葡萄糖 丙酮酸
大量混合酸
pH值降至4.5以下
非酸性末端产物(醇、醛等）
pH值＞6.2 甲基红指示剂 培养基橘黄色(阴性反应)
荡，再放入 37℃温箱中保温 15-30min。若培养物呈
红色者，为VP 试验反应阳性 3、 “+”表示阳性反应， “-”表示阴性反应。
MR试验
1、将另一半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入甲 基红试剂 2 滴，培养基变为红色者为阳性，变黄 色者为阴性。 2、 “+”表示阳性反应， “-”表示阴性反应。
细菌生化实验误差原因？
柠檬酸盐 利用试验 吲哚试验 硫化氢试验
IMViC 试验
硝酸还原酶试验， 淀粉水解试验
内容
一、糖发酵试验 二、IMViC试验
1、吲哚试验
2、V-P试验 3、MR试验 三、淀粉水解试验
说明
1、本次细菌的生化试验仅选择5项代表性试验
2、本次实验均按传统的生化试验方法进行检测
现代快速生化检测
现代快速生化检测
实验三
细菌鉴定中常用的几种生化试验
细菌的生化试验
用生化的方法来检测细菌对各种基质 的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌 种类，这种生化试验称为细菌的生化反 应试验；是鉴别细菌的重要依据 。
碳水化合物 代谢试验
糖发酵试验 甲基红试验（MR） V-P试验
常 见 的 生 化 反 应
细菌的常用生化试验
本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株
的快速鉴定。
4.七叶苷水解试验
原理 方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结 果。 结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。 应用：主要用于D群链球菌 与其他链球菌的鉴别，
前者阳性，后者阴性。
5.甲基红试验
原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生 丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥 珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5 以下，使甲基红指示剂变红。 方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，培养2～4d，于培 养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。 结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。
应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者 为阴性。肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆 菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。
6.V-P试验
原理 方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，于 35℃培养48h后加入甲液（6%α-萘酚酒精溶液）和乙液 （40%KOH溶液），振摇。 结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于 35℃4h后仍如故者即为阴性。 应用：本试验常与甲基红试验 一起使用，因为前者阳性的细
产碱型
发酵型（产酸）
氧化型
应用Байду номын сангаас主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型， 而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴 别，前者是发酵型，后者是氧化型。
3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
细菌的生化试验
细菌的生化试验目的要求了解细菌生化试验的原理、方法及在细菌鉴定中的意义。
仪器及材料温箱、接种环、酒精灯、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、醋酸铅蛋白胨水培养基、柠檬酸盐琼脂斜面培养基、MR试剂、VP试剂、靛基质试剂、大肠杆菌、产气杆菌、沙门氏菌的24h纯培养物等。
方法与步骤细菌的生化试验，就是通过用生物化学的方法分析细菌的代谢产物来鉴别细菌的试验。
下面是几种常用的生化试验。
只有纯培养的细菌才能用来做生化试验。
1．糖发酵试验将细菌无菌操作接种于糖发酵培养基中，于37℃培养24～48h，结果：只产酸(＋)，产酸产气(⊕)，不发酵(-)。
2．甲基红(MR)试验与维－培(VP)试验取菌接种于2支含0.5%葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃温箱培养4d，分别作甲基红和维－培试验。
（1）甲基红试验取上述培养基一支，加入甲基红试剂(甲基红0.1g溶于95%酒精300ml中)5～6滴，液体呈红色者为阳性，黄色者为阴性，橙色者为可疑。
（2）维－培试验取上述培养基一支，先加维－培甲液(6%α－甲萘酚酒精溶液)3ml，再加入维－培乙液(40%氢氧化钾水溶液)1ml，混和后静置于试管架内观察2～4h，凡液体呈红色者为阳性，不变色者为阴性。
3．靛基质试验有些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸产生靛基质(吲哚)，遇相应试剂而呈红色。
试验时，取菌接种于蛋白胨水培养基中，37℃培养2～3d；于培养基中加入戊二醇或二甲苯2～3ml，摇均，静置片刻后，沿试管壁加入靛基质试剂(配法：对二甲基氨基苯甲醛1.0g，95%酒精95ml溶解后，再加浓盐酸50ml)2ml，若能形成玫瑰靛基质而呈红色，则为阳性反应，不变色为阴性反应。
4．HS试验某些细菌能分解培养基中含硫氨基酸如半胱氨酸等产生硫化氢，硫化2氢遇醋酸铅或硫酸亚铁则形成黑色的硫化铅或硫化亚铁。
用接种针取菌穿刺于含有醋酸铅或硫酸亚铁的琼脂培养基中，37℃培养4d，凡沿穿刺线或穿刺线周围呈黑色者为阳性，不变色者为阴性。
细菌的常用生化试验
结果：在菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。
应用：在革兰阳性球菌中只有金黄
色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌 科中沙雷菌和变形杆菌产生此酶，
故本试验可用于细菌的鉴别。
7.凝固酶试验
原理
由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能 力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的 虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分 解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。
具体试验有：①糖类发酵试验；②葡萄糖代谢类 型鉴别试验；③七叶苷水解试验；④淀粉水解试 验；⑤甲基红试验；⑥V-P试验；⑦β-半乳糖苷 酶试验（ONPG试验）。
方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成 菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴 5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。
结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。 应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG 试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。
四、酶类试验
1.氧化酶试验
原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系 统的最终呼吸酶。
方法：常用方法有三种； 菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。 滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。 试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。
结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。为保证结果的 准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。
2.吲哚（靛基质）试验
原理
方法：将待检菌接种于蛋白胨水培养基中，于35℃培养 24～48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。
结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性 。
应用：在革兰阳性球菌中只有金黄
色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌 科中沙雷菌和变形杆菌产生此酶，
故本试验可用于细菌的鉴别。
7.凝固酶试验
原理
由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能 力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的 虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分 解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。
具体试验有：①糖类发酵试验；②葡萄糖代谢类 型鉴别试验；③七叶苷水解试验；④淀粉水解试 验；⑤甲基红试验；⑥V-P试验；⑦β-半乳糖苷 酶试验（ONPG试验）。
方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成 菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴 5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。
结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。 应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG 试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。
四、酶类试验
1.氧化酶试验
原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系 统的最终呼吸酶。
方法：常用方法有三种； 菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。 滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。 试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。
结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。为保证结果的 准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。
2.吲哚（靛基质）试验
原理
方法：将待检菌接种于蛋白胨水培养基中，于35℃培养 24～48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。
结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性 。
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告一、引言在微生物学中，鉴定细菌的方法有很多种，其中生理生化反应实验是最常用的一种方法之一。
生理生化反应实验可以通过观察细菌对不同物质的代谢情况来确定其种类和特性。
本报告将介绍细菌鉴定中常用的生理生化反应实验。
二、目的本报告旨在介绍常用的生理生化反应实验，包括试剂、操作步骤、结果解释等内容，以帮助读者更好地了解和掌握这些实验。
三、材料与方法1. 大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）培养基；2. 硝酸盐还原试剂；3. 糖类试剂：葡萄糖、果糖、半乳糖；4. 氨基酸试剂：天冬氨酸、赖氨酸；5. 酶试剂：淀粉酶、蛋白酶；6. 无水硫酸铜溶液。
四、实验步骤及结果解释1. 硝酸盐还原试验步骤：（1）取一支细菌液体培养物，加入硝酸盐还原试剂；（2）观察液体颜色变化。
结果解释：若液体变为红色，则表示细菌能够还原硝酸盐为亚硝酸盐，是亚硝化菌。
若无颜色变化，则表示细菌不能还原硝酸盐。
2. 糖类代谢试验步骤：（1）取三个试管，分别加入葡萄糖、果糖、半乳糖；（2）加入相同量的细菌液体培养物；（3）观察试管内气泡产生情况。
结果解释：若在葡萄糖试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用葡萄糖进行发酵代谢；若在果糖或半乳糖试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用果糖或半乳糖进行发酵代谢。
3. 氨基酸代谢试验步骤：（1）取两个试管，分别加入天冬氨酸和赖氨酸；（2）加入相同量的细菌液体培养物；（3）观察试管内气泡产生情况。
结果解释：若在天冬氨酸试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用天冬氨酸进行代谢；若在赖氨酸试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用赖氨酸进行代谢。
4. 酶代谢试验步骤：（1）取两个试管，分别加入淀粉和蛋白质；（2）加入相同量的细菌液体培养物；（3）观察试管内颜色变化情况。
结果解释：若在淀粉试管内出现了透明带，则表示该细菌能够分泌淀粉酶；若在蛋白质试管内出现了变色，则表示该细菌能够分泌蛋白酶。
常用细菌生化反应试验
• 试剂：酚红、溴甲酚紫等 • 结果:培养基呈酸性变色 • 应用：观察细菌对糖度的 分解情况，常
用于肠道杆菌的鉴定
糖发酵试验结果判断
反应现象 酸性变色、有气泡 酸性变色、无气泡
培养基不变色
结果描述
分解××糖产酸、产气 分解××糖产酸、不产
气 不分解××糖
甲基红试验
• 原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步 生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4 以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色 反应。此为甲基红试验阳性。
伤寒沙门菌KIA（K A－＋）MIU（＋－－）
大肠埃希菌KIA（AA＋－）MIU（＋＋－）
苯丙氨酸脱氨实验
• 原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱氨酶，可 使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮 酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合 物。
• 培养基：苯丙氨酸琼脂 • 试剂：10％三氯化铁 • 结果：加入试剂后培养基呈现绿色为阳性 • 应用：多用于肠道杆菌的鉴定
脱酸 乙酰甲基甲醇
V-P试剂 二乙酰
培养基变红
葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径
大肠埃希菌IMViC试验（＋＋－－） 右侧为对照（－－＋＋）
葡萄糖
V－P试验
丙酮酸
脱酸
乙酰甲基甲醇
V-P试剂
二乙酰
培养基变红
大肠埃希菌IMViC试验（＋＋－－） 右侧为对照（－－＋＋）
蛋白质类代谢试验
• 靛基质试验 • 硫化氢试验 • 苯丙氨酸脱氨试验 • 尿素酶试验
• 培养基：葡萄糖蛋白胨水 • 结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+
培养基不变色： －
• 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主 要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
葡萄糖
用于肠道杆菌的鉴定
糖发酵试验结果判断
反应现象 酸性变色、有气泡 酸性变色、无气泡
培养基不变色
结果描述
分解××糖产酸、产气 分解××糖产酸、不产
气 不分解××糖
甲基红试验
• 原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步 生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4 以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色 反应。此为甲基红试验阳性。
伤寒沙门菌KIA（K A－＋）MIU（＋－－）
大肠埃希菌KIA（AA＋－）MIU（＋＋－）
苯丙氨酸脱氨实验
• 原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱氨酶，可 使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮 酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合 物。
• 培养基：苯丙氨酸琼脂 • 试剂：10％三氯化铁 • 结果：加入试剂后培养基呈现绿色为阳性 • 应用：多用于肠道杆菌的鉴定
脱酸 乙酰甲基甲醇
V-P试剂 二乙酰
培养基变红
葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径
大肠埃希菌IMViC试验（＋＋－－） 右侧为对照（－－＋＋）
葡萄糖
V－P试验
丙酮酸
脱酸
乙酰甲基甲醇
V-P试剂
二乙酰
培养基变红
大肠埃希菌IMViC试验（＋＋－－） 右侧为对照（－－＋＋）
蛋白质类代谢试验
• 靛基质试验 • 硫化氢试验 • 苯丙氨酸脱氨试验 • 尿素酶试验
• 培养基：葡萄糖蛋白胨水 • 结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+
培养基不变色： －
• 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主 要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
葡萄糖
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告细菌鉴定是微生物学中的一个重要分支，它是通过对细菌的形态、生理生化反应、生长特性等方面进行分析，来确定细菌种类的过程。
在细菌鉴定中，生理生化反应实验是一种常用的方法，它可以通过观察细菌在不同条件下的生长情况，来确定细菌的种类。
本文将介绍几种常用的生理生化反应实验。
1. 氧气需求实验氧气需求实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌的氧气需求量。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同氧气浓度的培养基中，然后观察细菌的生长情况。
如果细菌只能在氧气充足的条件下生长，那么它就是一种需氧菌；如果细菌只能在氧气缺乏的条件下生长，那么它就是一种厌氧菌；如果细菌既能在氧气充足的条件下生长，也能在氧气缺乏的条件下生长，那么它就是一种兼性厌氧菌。
2. 糖类发酵实验糖类发酵实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌对不同糖类的发酵能力。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同糖类的培养基中，然后观察培养基的酸碱度变化。
如果培养基的酸碱度发生了变化，那么说明细菌对这种糖类进行了发酵。
通过这个实验，我们可以确定细菌对哪些糖类具有发酵能力，从而进一步确定细菌的种类。
3. 氧化还原实验氧化还原实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌的氧化还原能力。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同氧化还原剂的培养基中，然后观察培养基的颜色变化。
如果培养基的颜色发生了变化，那么说明细菌对这种氧化还原剂具有反应能力。
通过这个实验，我们可以确定细菌的氧化还原能力，从而进一步确定细菌的种类。
4. 酶活性实验酶活性实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌的酶活性。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同底物的培养基中，然后观察底物的变化情况。
如果底物发生了变化，那么说明细菌对这种底物具有酶活性。
通过这个实验，我们可以确定细菌的酶活性，从而进一步确定细菌的种类。
细菌的生化试验
细菌的生化实验一、糖的发酵培养基：糖培养基PH7.6的蛋白胨水溶液（蛋白胨1%）（氯化钠0.5%）适量糖，1% 1.6%澳甲酚紫酒精溶液0.1% 分装10*100mm小试管，每管3-41^,内置一密闭端向上的发酵管， 10磅10分灭菌。
方法: 用接种环取少量纯培养物接种于培养基中，37摄氏度培养18-24小时后观察，一般观察2-3天。
结果: 产酸则培养基由兰紫变黄，用“ + ”表示。
产酸又产气，则培养基变黄，小管内有气泡，用“。
”表示，无变化则培养基仍为兰紫色，管内也无气泡，用“-”表示。
原理: 指示剂澳甲酚紫的指示范围为PH5.2-6.8（黄-紫）。
每一种糖（醇）培养基内只含一种糖（醇）的成分，接种进去的细菌若能发酵这种糖，则可产生乳酸，使PH下降，培养及就由兰紫色变为黄色，如果同时还产生CO2、H2、CH4等气体，则小管内留有气泡，如果不能发酵分解这种糖，则培养及不变色也无气泡。
培养基：蛋白胨水蛋白胨1%氯化钠0.5%蒸馏水适量其中的蛋白胨最好选用含色氨酸较多的多价蛋白胨。
每支小试管分装3-4ml, 10磅10分灭菌。
试剂：（欧立希氏试剂）对二甲基氨基苯甲醛 1g纯乙醇95ml浓盐酸20ml以上物品依次混合溶解方法：接种细菌于培养基中，37摄氏度培养24-48小时后，取出加乙醚约0.7cm厚，塞紧棉塞后摇震，使乙醚与培养物混匀，静置于试管架内数分钟，待乙醚浮至培养基表面，打开棉塞，沿试管壁慢慢加入靛基质试剂4-5滴，不要摇。
结果：乙醚层现红色为阳性，以“ + ”表示，不变者为阴性，以“-”表示。
原理：细菌若有色氨酸酶，就能分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质（吲哚）。
靛基质无色，但遇到对二甲基氨基苯甲醛，则可以生成红色的靛基质，以肉眼可见。
三、甲基红实验：培养及：葡萄糖蛋白胨水（PH7.4）葡萄糖0.5%磷酸氢二钾0.5%蛋白胨0.5%蒸馏水适量加热溶解后，分装小试管，每管3-4ml，10磅10分灭菌试剂：0.1g甲基红溶于300ml95%乙醇中，加蒸馏水至500ml方法：接种细菌于培养液中，37摄氏度培养2-4天，取出加M、R试剂3-4 滴。
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1.糖（醇、苷）类发酵试验
原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力 各不相同，细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅 产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。 方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培养基中， 置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。 结果：若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸 性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体 培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他 变化。 应用：是鉴定细菌最主要和最基本的 试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤 为重要。
应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者 为阴性。肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆 菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。
6.V-P试验
原理 方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，于 35℃培养48h后加入甲液（6%α-萘酚酒精溶液）和乙液 （40%KOH溶液），振摇。 结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于 35℃4h后仍如故者即为阴性。 应用：本试验常与甲基红试验 一起使用，因为前者阳性的细
本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株
的快速鉴定。
4.七叶苷水解试验
原理 方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结 果。 结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。 应用：主要用于D群链球菌 与其他链球菌的鉴别，
前者阳性，后者阴性。
5.甲基红试验
原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生 丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥 珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5 以下，使甲基红指示剂变红。 方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，培养2～4d，于培 养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。 结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。
菌，后者通常为阴性。
二、蛋白质和氨基酸的代谢试验
原理：不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。细菌对 蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为 短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽 类分解为氨基酸。 具体试验有：①明胶液化试验；②吲哚试验（靛基质试 验）；③硫化氢试验；④尿素酶试验；⑤苯丙氨酸脱氨 酶试验；⑥氨基酸脱羧酶试验。
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可产生氮气。
4.脂酶试验
原理：有的细菌产生脂酶，可分解脂肪成游离的脂肪酸。 从而使培养基中与脂肪结合形成无色化合物的维多利亚 蓝释放出来，呈现深蓝色。
方法：将被检菌接种于脂酶培养基（含维多利亚蓝）中， 于37℃培养24h
结果：培养基变为蓝色为阳性，阴性为粉红色或无色。
产碱型
发酵型（产酸）
氧化型
应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型， 而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴 别，前者是发酵型，后者是氧化型。
3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
原理 细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是β—半乳糖苷透性酶， 它位于细胞膜上，可运送乳糖分子渗入细胞。另一种为β-半乳糖苷 酶，亦称乳糖酶，位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。 具有上述两种酶的细菌，能在24—48h发酵乳糖，而缺乏这两种酶 的细菌，不能分解乳糖。 方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成 菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴 5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。 结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。 应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG 试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。
原理
由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能 力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的 虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分 解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。
具体试验有：①糖类发酵试验；②葡萄糖代谢类 型鉴别试验；③七叶苷水解试验；④淀粉水解试 验；⑤甲基红试验；⑥V-P试验；⑦β-半乳糖苷 酶试验（ONPG试验）。
1.明胶液化试验
原理 方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22℃培养7d， 逐日观察结果。 结果：培养基呈液化状态为阳性。 应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙 雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆 菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其 他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌 如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也 能液化明胶。另外多数假单胞菌也 能液化明胶。
结果：若3h后在菌落周围形成乳白色混浊环，即为阳性， 6h后混浊环可扩展至5～6mm。 应用：主要用于厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌、诺维梭 菌产生此酶，其他梭菌为阴性。
6.DNA酶试验
原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解成寡核 苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸链则溶于 酸，所以当在菌落平板上加入酸后，会在菌落周围出现 透明环。 方法：将被检菌点种于0.2%DNA琼脂平板上，于35℃培 养l8～24h，然后用lmol/L盐酸覆盖平板，观察结果。 结果：在菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。 应用：在革兰阳性球菌中只有金黄 色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌
应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在 肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华
菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、
克雷伯菌属通常为阳性。
2.丙二酸盐利用试验
原理：有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解生 成碳酸钠，使培养基变碱。 方法：将被检菌接种于丙二酸盐培养基培养基，35℃培养24～48h 后观察结果。
注意事项
①3%H2O2溶液要新鲜配制。 ②不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细胞含有触酶，可致假阳 性反应。 ③取对数生长期的细菌。
3.硝酸盐还原试验
原理：在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为 氨基酸和细胞内其他含氮化合物；在分解代谢过程中，硝酸盐或亚 硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的 细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。
2.吲哚（靛基质）试验
原理
方法：将待检菌接种于蛋白胨水培养基中，于35℃培养 24～48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。 结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
3.硫化氢试验
原理 方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35℃培养 24～48h观察结果。 结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴 别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑 那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细
6.氨基酸脱羧酶试验
原理 方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸） 培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或 矿物油，于35℃培养l～4d，每日观察结果。 结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲 酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现 紫色则试验无意义，不能作出判断。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除 伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧 酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志 贺菌均为阴性。
三、碳源和氮源利用试验
1.枸橼酸盐利用试验 原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，并且利用枸橼酸盐作为唯一 碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱 性。 方法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35℃培养l～4d，每日观 察结果。
结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性；
菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴
性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。
4.尿素分解试验
原理 方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35℃培养l8～24h 观察结果。 结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变 为阴性。
应用：主要用于肠杆菌科中变形杆
菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和 普通变形杆菌脲酶阳性。另外雷氏
3.碳源和氮源利用试验
（1）枸橼酸盐利用试验（2）丙二酸盐利用试验 4.各种酶类试验 （1）氧化酶试验（2）过氧化氢酶试验（触酶试验）（3）硝酸盐还原 试验 （4）脂酶试验（5）卵磷脂酶试验（6）DNA酶试验（7）凝固酶试验 （8）CAMP试验
一、碳水化合物的代谢试验
2.氧化-发酵试验（0/F试验）
原理： 不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因 是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发 酵。 方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加 无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于lcm。将培养基于 35℃培养48h或更长。 结果：
结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。
应用：肠杆菌科中属间及种的鉴 别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸
杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌
属中有些菌种也呈阳性，其他菌 属均为阴性。
四、酶类试验
1.氧化酶试验 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系 统的最终呼吸酶。