免疫组化超详细步骤

超详细的免疫组化步骤

免疫组化步骤

操作步骤

取出细胞-------PBS冲洗3次，每次5分钟-------用预冷的丙酮或甲醇溶液固定10分钟----PBS 冲洗3次，每次5分钟-----每张爬片加50ul非免疫性动物血清（封闭液）室温下10分钟---甩掉封闭液-----加一抗50ul，37℃培养箱孵育60分钟，或4℃过夜--------PBS冲洗3次，每次5分钟----每张爬片加二抗50ul,37℃或室温30--60分钟---PBS冲洗3次，每次5分钟----显色，酶标二抗加酶的底物（如DBA）染色，显微镜下观察3--10分钟，控制染色情况---自来水冲洗，苏木素复染，中性胶固定-------金标记或荧光标记在显微镜下直接观察。

结果判读：

根据阳性对照和阴性对照，判断免疫染色是否成功。阳性细胞定位是否明确，是胞膜，胞浆还是胞核阳性，间质是否清晰，无背景着色，同时阳性细胞达5%以上，方为阳性。

注意：

浓缩型抗体应根据厂家提供的抗体效价，进行分装，按50ul或100ul分装，放入-20---70℃冰箱保存1--5年。用PBS稀释抗体在4℃可放1--3天。使用时必须按不同免疫染色方法找出抗体最佳稀释度。

即用型抗体可直接使用，无需稀释

阴性对照可以使用PBS或10%的正常非免疫动物血清。（用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致，排除有无一抗外的非特异性染色。）

阳性对照可使用自己收集或购买的阳性切片。

假阳性：抗体的稀释度不正确，浓度太高；部分多克隆抗体的特异性问题。

假阴性：抗体和检测试剂盒配对不合理。如单克隆抗体（多为鼠）试剂盒应为鼠用试剂盒；多克隆抗体（多为兔）试剂盒应为兔用试剂盒。

抗体浓度太低；孵育时间太短(SP法一抗孵育时间为1小时，二抗，三抗为10分钟；PAP 法或ABC法一抗为1小时或过夜，二抗，三抗为30分钟)；染色步骤错误；染色过程爬片过分干燥。

封闭液：封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。但也要防止封闭过度

冰冻切片的免疫组化染色步骤

速冻组织

将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。

冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。

室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。

PBS洗，5分钟×3。

用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×3。

下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。

石蜡切片免疫组化染色步骤

三步法（以SP试剂盒为例）

1. 石蜡切片脱蜡至水。

2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。

3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。

4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5. PBS冲洗，2分钟×3次。

6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

7. PBS冲洗，2分钟×3次。

8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

9. PBS冲洗，2分钟×3次。

10. 显色剂显色（DAB或AEC）。 11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。

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石蜡切片免疫组化实验步骤

石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From 徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）：

1）材料的准备

在本实验室条件下推荐使用FAA（50% ethanol, 5% acetic acid,

3.7% 甲醛）固定材料。

FAA固定液（100ml），室温保存 ：

无水乙醇 50ml

冰醋酸 5ml

37%甲醛 10ml

水 35ml

第一天：组织固定

用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。

第二天：脱水

Solution time number of changes

50% ethanol 60 minutes one

60% ethanol 60 minutes one

*70% ethanol 60 minutes one

以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。

* 组织可在70% ethanol 4℃可存放几个月

第三天：进一步脱水和浸蜡 2

以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇

Solution time number of

changes

85% ethanol 60 minutes one

95% ethanol 60 minutes one

以下所有步骤在室温进行并不时轻摇

Solution time number of

changes

100% ethanol 30 minutes two

100% ethanol 60 minutes two

25%二甲苯, 75% ethanol 30 minutes one

50%二甲苯, 50% ethanol 30 minutes one

75%二甲苯, 25% ethanol+番红 30 minutes one

100%二甲苯 60 minutes two

免疫组化实验步骤

细胞和组织的固定

（一）固定

为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。 不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大

（二）固定剂

用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。

1．醛类固定剂 双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。

1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂

2）Bouin’s液

该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。

2．丙酮及醇类固定剂

系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。

丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。

以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记结果可截然不同。选择最佳固定液标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构。②最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们，中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。