沈阳医学院学报Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＳｈｃｎｙａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ第４卷第４期２００２年ｌ２月 ・２３３・ 【文章编号】１００８—２３４４（２００２）０４—０２３３一Ｏ１ 乙醇固定石蜡包埋组织提取ＤＮＡ 及ＰＣＲ扩增方法的探讨 潘晓蔚 吴ｊ爵 王嘉伦 （１．沈阳医学院医学基础部中心实验室，辽宁沈阳１１００３４；２．病理教研室） 【关键词】脱氧核糖核酸；聚合酶链反应；石蜡包埋 【中图分类号】１１５２１ 【文献标识码】Ｂ 自从１９８５年Ｇｏｄｇ等成功地发明了从４％甲 醛固定、石蜡包埋组织中提取脱氧核糖核酸（ｄｅ— ｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ，ＤＮＡ）的方法以来，国内外文 献中已有大量关于应用该方法提取ＤＮＡ进行分 子病理学研究的报道…。但学者们也注意到从 ４％甲醛固定石蜡包埋组织中提取的ＤＮＡ不能很 好地进行聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃ— ｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增这一问题。我们应用乙醇固定石 蜡包埋组织提取ＤＮＡ及ＰＣＲ扩增方法，现介绍 如下。 １材料和方法 １．１ 组织标本８３例胃黏膜活检组织，其中胃 癌４１例，慢性萎缩性胃炎３８例，慢性浅表十叶’胃炎 ４例。９５％乙醇固定，时间最长２４ ｈ，石蜡包埋。 １．２ ＤＮＡ提取液 包括１０×ＰＣＲ缓冲液、 ０．４５％ＮＰ－４０、０．４５％Ｔｗｅｅｎ ２０、１００ ｓ／ｍｌ蛋白 酶Ｋ。 １．３ ＤＮＡ提取方法将蜡块标本切成４ ｐ．ｍ切 片，每例切２０张，装入离心小管中。每切１例将 切片刀换一个位置，待切片刀位置更换完毕后， 用１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ和流水充分洗涤，擦干后继续使 用，以防交叉污染 Ｊ。二甲苯脱蜡２次，４８＇ｔ２水 浴２ ｈ。无水乙醇脱水２次，４８＇ｔ２水浴３０ ｍｉｎ。 ３７℃温箱干燥２ ｈ。每个小管中加入变性缓冲液 １００ ，５５＇ｔ２水浴１７ ｈ。４＇ｔ２冰箱保存备用。酚氯 仿提取法按试剂盒说明书操作。 １．４常规ＰＣＲ扩增Ｋ—ｒａｓ基因应用包含１２和 １３外显子的Ｋ．ｒ＇ｄｔＳ基因引物在ＰＣＲ扩增仪上进 【收稿日期】２００２—０５—２２ 行扩增，引导合成１１４ｂｐ的ＤＮＡ片断。ｄ．牡Ｐ－ｄｃ ＴＰ掺入ＰＣＲ扩增ＦＨＩＴ基因内３个微卫星多态 标记：１０ ｒＩＩｌ反应体系中加入基因组ＤＮＡ １００ ｎｇ， １ Ｉｎｌ １０×ＰＣＲ缓冲液，ｄＮＴＰ ２００ ｐａｎｏｌ／Ｌ，上下游 引物（２０ ｇ．ｍｏｌ／Ｌ）各０．２ ｍｌ，５Ｕ／Ｌ Ｔａｑ酶０．１ Ｉｎｌ， １０ ＭＣＩ／ｍｌ ｄ＿３２Ｐ—ｄｃ ＴＰ ０．１ Ｉｎｌ。９５℃变性５ ｍｉｎ。 循环条件为９５℃５０ ｓ，５４～５６℃４０ｓ，７２℃１ ｒａｉｎ， ３２个循环后，７２℃延伸５ ｍｉｎ。 ２结果 ８３例乙醇固定石蜡包埋的胃黏膜活检组织 标本ＤＮＡ提取及ＰＣＲ扩增结果对４例慢性浅 表性胃炎、１９例早期胃癌及ｌ４例进行期胃癌进 行常规ＰＣＲ扩增Ｋ—ｒａ８基因，成功例数分别为２ 例、ｌ３例和１０例。对３８例慢性萎缩性胃炎和４ｌ 例胃癌进行０［．３２Ｐ－ｄｃ ＴＰ扩增微卫星标记，分别成 功２５例和３０例。 ３讨论 目前已了解到未加缓冲液的４％甲醛固定 液，使用一段时间后，甲醛会氧化生成甲酸，使ｐＨ 值下降，而低ｐＨ值能使ＤＮＡ断裂（即降解）［３１， 因此不能较好地应用ＰＣＲ技术进行扩增。而应 用乙醇固定、石蜡包埋胃镜活检组织提取ＤＮＡ， ＰＣＲ扩增成功率接近７０％。其可能主要有以下 原因：①乙醇对ＤＮＡ片段没有或仅有较弱的降解 作用。②胃镜取材的活检组织当即固定，保证了 ＤＮＡ片段的完整性。由于胃镜取材标本体积小， 所含的组织量少，脱蜡后若采用常规酚氯仿提取 法，所获得的ＤＮＡ量少，标本利用率低。而我们 （下转第２３５页）
石蜡切片标本制作法:
这是最常用的组织学标本的制作方法，包括以下几个步骤：取材、固定、脱
水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色和封固
（一） 取材、固定
所取材的组织在动物死后或离体后会很快解体，这可能是由于细菌或是组织本身 所含酶的分解所致。所以，动物在乙醚麻醉下或以不同方法杀死后， 应立即进行 取材和固定，以停止其分解作用。尽可能保存细胞组织生前结构和成分。
1.取材：
即从动物体内取下器官或组织材料的过程。以取肝脏为例，取材的步骤为： 将动物麻醉或杀死后，腹部向上固着在蜡盘上，打开腹部，暴露肝脏，用锋锐的 解剖剪或手术刀细致而又迅速地取下一块大小适宜（0.5cm3）的肝脏组织块，立 即投入固定液内。
2.固定:
固定是将组织用化学试剂浸泡，使其蛋白质等成分迅速凝固，尽量保持其生前形 态结构而不发生死后的变化。固定时所使用的化学溶液，称为固定液。
常用的固定液配方:
⑴Susa液：
I液
氯化汞（升汞）饱和水溶液 50.0ml
U液
氯化钠 0.5g
三氯醋酸 2.0g
冰醋酸 4.0ml
甲醛（40%） 20.0ml
蒸馏水 30.0ml
使用时取等量的I液和U液混合后，将组织块投入，固定 24小时
(2)Helly 干液：
重铬酸钾 2.5g
氯化汞 5.0g
硫酸钠 1.0g 蒸馏水 100.0ml
使用之前加入40%甲醛5.0ml。
⑶10 %甲醛：
40%甲 醛 10.0ml
蒸馏水 90.0ml
(4)Bouin 液：
苦味酸饱和水溶液 75.0ml
40%甲 醛 25.0ml
冰醋酸 5.0ml
⑸Carnoy 液：
无水酒精 6份
氯仿 3份
冰醋酸 1份
（二）脱水、透明、浸蜡、包埋
这几个步骤是为了将组织包埋在较硬的物质即石蜡中，以便制备较薄的石蜡切片。
1.脱水：
普通固定液大多是水溶液，必须先脱去组织内的水分，为浸蜡创造条件。脱水剂通常使 用酒精。脱水的步骤是逐步升高酒精溶液的浓度， 以去净组织块内的水分， 最后完全由纯酒 取代。
第1篇
一、实验目的
1. 掌握石蜡切片的基本操作步骤。
2. 了解石蜡切片的染色原理和方法。
3. 观察细胞组织的结构特征。
二、实验器材与试剂
1. 器材：
- 石蜡切片机
- 石蜡包埋机
- 恒温箱
- 显微镜
- 载玻片
- 盖玻片
- 毛笔
- 镊子
- 刀片
- 染色缸
- 烤片机
- 试剂瓶
2. 试剂：
- 4%多聚甲醛固定液
- 无水乙醇
- 二甲苯 - 苏木素染液
- 伊红染液
- 1%盐酸酒精溶液
- 1%氨水溶液
- 甘油蛋白粘片剂
- 中性树胶
三、实验步骤
1. 取材与固定：取新鲜组织，用4%多聚甲醛固定24小时以上。
2. 脱水：将固定好的组织放入脱水盒，依次用75%、85%、90%、95%、无水乙醇进行脱水，每级酒精处理1小时。
3. 浸蜡：将脱水后的组织放入二甲苯中浸泡，每缸浸泡1小时。
4. 包埋：将浸好蜡的组织块放入包埋机中，加入融化的石蜡，待石蜡凝固后取出，修整蜡块。
5. 切片：将修整好的蜡块固定在切片机上，切成4微米厚的切片。
6. 水化：将切片放入水中，用毛笔轻轻搅动，使切片展平。
7. 脱蜡：将水化的切片放入二甲苯中，依次浸泡30分钟，然后放入无水乙醇中，浸泡10分钟。
8. 苏木素染色：将脱蜡后的切片放入苏木素染液中，染色0.5-1分钟。
9. 自来水漂洗：将染色后的切片放入自来水中漂洗。
10. 盐酸酒精分化：将漂洗后的切片放入1%盐酸酒精溶液中分化数秒。
11. 自来水漂洗：将分化后的切片放入自来水中漂洗。
12. 氨水返蓝：将漂洗后的切片放入1%氨水溶液中返蓝1分钟。
13. 自来水漂洗：将返蓝后的切片放入自来水中漂洗。
14. 伊红染色：将漂洗后的切片放入伊红染液中染色1分钟。 15. 自来水漂洗：将染色后的切片放入自来水中漂洗。
・１４１２・ 临床与实验病理学杂志Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ ２０１６ Ｄｅｃ；３２（１２）
网络出版时间：２０１６一ｌ２—２２ ０８：５３ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０７３．Ｒ．２０１６１２２２．０８５３．０２７．ｈｔｍｌ
甲醛固定石蜡包埋胃癌组织中三种ＤＮＡ提取
方法的比较
郭 丽 ，祁 荣 ，臧旭 ，郑瑞 ，付佳
关键词：甲醛固定；石蜡包埋；ＤＮＡ提取；聚合酶链式反应 中图分类号：Ｒ ４４６．８；Ｒ ３９４．２ 文献标志码：Ｂ
文章编号：１００１—７３９９（２０１６）１２—１４１２—０２
ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｅｊｃｅｐ．２０１６．１２．０２７
目前国内大多数医院均用１０％中性福尔马林固定手术
标本。随着分子生物学技术的不断发展，这些标本是可靠的
分子生物学研究材料来源，在医学检验、法医鉴定、大宗病例
回顾性研究等方面得到广泛应用。已有研究证明石蜡包埋 组织在制作及保存过程中受多种试剂等因素的影响，导致
ＤＮＡ脆性增加、ＤＮＡ与蛋白质交联等问题，为从中保质保量
地提取ＤＮＡ带来困难…，其原因可能由于所用标本组织的
类型、制作过程、保存条件和时间以及具体实验操作方法的
差异所致。文献报道从石蜡包埋组织中提取ＤＮＡ的方法比
较多 。本实验通过改良试剂盒提取法克服了影响提取 ＤＮＡ的因素，简化了实验操作步骤，一定程度地避免了标本
量的损失，从石蜡包埋胃癌组织中获得的ＤＮＡ可有效用于
ＰＣＲ扩增和ＤＮＡ测序。
１材料与方法
１．１标本来源收集２００８年３月～２０１２年１２月中国医科
大学附属第一医院病理科存档的胃癌石蜡包埋组织３Ｏ例。
１．２ ＤＮＡ提取方法３种方法分别对３０例石蜡包埋胃癌
组织进行ＤＮＡ提取。制作组织切片，组织连续切片ｌ０一ｌ２
片，每片５ 厚，装入已标记的１．５ ｍｌ离心管中，二甲苯脱
蜡：（１）加１ ｍｌ二甲苯，室温静置１５ ｍｉｎ；（２）室温１２ ０００ ｒ／
