抗酸染色课件

无鞭毛产气荚膜杆菌荚膜染色小鼠肝涂片10损伤或手术后伤口出现不寻常的疼痛迅速局部肿胀周围皮肤有捻发音有严重的全身中毒症状如脉搏加速烦躁不安进行性贫血x线检查伤口肌群间有气体11牛乳培养基
微生物实验（ 微生物实验（五）
痰标本抗酸染色 厌氧菌形态培养 分枝杆菌培养 麻风杆菌形态观察
2011-11-21
（一）厌氧菌的形态培养
• 经呼吸道、接触感染 经呼吸道、 • 引起麻风病 瘤型麻风（开放型）： ）：传染性强 瘤型麻风（开放型）：传染性强 结核样型（闭锁性）： ）：传染性弱 结核样型（闭锁性）：传染性弱 • 微检：标本涂片抗酸染色是诊断麻风的 微检： 主要依据
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麻风杆菌的抗酸染色
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抗酸染色
原理： 一、原理：
• 抗酸性杆菌（结核杆菌、麻风杆菌等）的细胞壁内含有 抗酸性杆菌（结核杆菌、麻风杆菌等） 大量的脂质(主要是分枝菌酸) 包围在肽聚糖的外面， 大量的脂质(主要是分枝菌酸)，包围在肽聚糖的外面， 所以分枝杆菌用一般染色不易着色，需用强染剂（5%石 所以分枝杆菌用一般染色不易着色，需用强染剂（5%石 炭酸复红溶液）加温或延长染时间才可着色。 炭酸复红溶液）加温或延长染时间才可着色。但分枝菌 酸与染料结合后，又很难被酸性脱色剂（3%盐酸酒精 盐酸酒精） 酸与染料结合后，又很难被酸性脱色剂（3%盐酸酒精） 脱色，因而被染成红色，故名抗酸染色。 脱色，因而被染成红色，故名抗酸染色。 • 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸 复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。 复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当 再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色， 再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细 非抗酸性菌）及背景中的物质为兰色。 菌（非抗酸性菌）及背景中的物质为兰色。

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▪ 3.结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临 床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断 裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、 球状颗粒，亦称Much颗粒。
▪ 4.标本经高压灭菌处理，不影响染色结果， 也保证操作者的安全。
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红色。
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四、注意事项
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1、注意涂片不宜过于浓厚。 2、火焰固定温度要适宜。 3、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳 性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多 少等因素的影响，难以严格规定。 4、染色过程中应吸去玻片上的残水，以免染色 液被稀释而影响染色效果。 5、选择幼龄的细菌。G+菌培养12-16h， E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶 常使G+菌转呈阴性反应。
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一、实验原理
（一）基本步骤：
1、初染：草酸胺结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：石炭酸复红复染
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（二）原理：
▪ 细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它 们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
▪ 初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝 紫色。
▪ 碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结 晶紫—碘的复合物，增强染料与细菌的 结合力。
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五、革兰染色的临床意义
▪ 1.对细菌的鉴别有重要意义 ▪ 2.指导临床选择用药 ▪ 3.研究细菌与致病性的关系
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思考题： 当你对一株未知菌进行革兰染色时，
怎样能确证你的染色技术操作正确， 结果可靠？
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抗酸染色法

采用高温进行固定，手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次。
固定温度控制
固定时要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜。
固定后处理
放置待冷后染色，避免因温度过高影响后续染色效果。
执行染色步骤
涂片制备与固定
按照标本操作程序涂片，并在室温下自然 干燥或略加温。
试剂储存与使用注意事项
每次试剂用完后，请迅速盖好， 以免挥发，储存时应避免高、低 温及阳光照射。
储存试剂的方法
01
试剂储存环境
储存时应避免高、低温及阳光照射 。
02
03
试剂的保存方式
每次试剂用完后，请迅速盖好，以 免挥发。
试剂储存时间
储存时间不宜过长，应尽快使用完 毕。
感谢观看
03
固定后处理
放置待冷后染色，避免因过热影响后续染 色效果。
进行涂片操作
固定温度控制
手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约 3~4秒。要求玻片温度不超过60℃。
固定后冷却
放置待冷后染色，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜。
避免靠近火焰
涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，但勿靠近火焰。
控制涂片干燥程度
固定方法
常用高温进行固定，手持载玻片一端 ，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速 来回移动3~4次，共约3~4秒。
固定温度控制
要求玻片温度不超过60℃，以玻片 背面触及手背皮肤不觉过烫为宜。
固定后处理
放置待冷后染色，避免温度过高影响 染色效果。
固定和染色过程
掌握固定技巧
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固定方法
每次用卡介苗做阳性对照，大肠埃希菌 ATCC25922做阴性对照。

二、近代以来交通、通讯工具的进步对人们社会生活的影 响
(1)交通工具和交通事业的发展，不仅推动各地经济文化交 流和发展，而且也促进信息的传播，开阔人们的视野，加快 生活的节奏，对人们的社会生活产生了深刻影响。
(2)通讯工具的变迁和电讯事业的发展，使信息的传递变得 快捷简便，深刻地改变着人们的思想观念，影响着人们的社 会生活。
1．李鸿章1872年在上海创办轮船招商局，“前10年盈和，成
为长江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立
之势”。这说明该企业的创办
()
A．打破了外商对中国航运业的垄断
B．阻止了外国对中国的经济侵略
C．标志着中国近代化的起步
D．使李鸿章转变为民族资本家
解析：李鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家； 洋务运动标志着中国近代化的开端，但不是具体以某个企业 的创办为标志；洋务运动中民用企业的创办在一定程度上抵 制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故B、C、D 三项表述都有错误。 答案：A
出口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事
业是
()
A．电报业
B．大众报业
C．铁路交通业 D．轮船航运业
[解析] 材料主要反映了信息交流的快捷，故选A。
[答案] A
[题组冲关]
3．假如某爱国实业家在20世纪初需要了解全国各地商业信
息，可采用的最快捷的方式是
()
A．乘坐飞机赴各地了解 B．通过无线电报输送讯息
时
代潮流
图说历史
主旨句归纳
(1)20世纪初，孙中山提出“民族、民权、
民生”三民主义，成为以后辛亥革命
的
指导思想。
(2)三民主义没有明确提出反帝要求，也

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二、墨汁负染色法
步骤
2.滴半滴墨汁.取菌并混匀。 3.盖盖玻片(覆盖于菌液上，注意先将盖 玻片一边接触菌液缓缓斜放下，以免产 生气泡)。 4.油镜观察。
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二、墨汁负染色法
结果观察
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二、墨汁负染色法
临床意义
新型隐球菌可引起全身各组织器官 炎症，最易侵犯的是中枢神经系统，引 起慢性脑膜炎。
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方法
一、抗酸染色法
1.涂片制备 挑取痰液→在玻片上涂成痰膜（涂两 次，第一次干燥之后再涂第二次） →干燥→固定。
2.抗酸染色 初染 脱色 复染
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方法
一、抗酸染色法
2. 染色 ⑴初染：石炭酸复红染液（10min) ⑵脱色：酸性酒精（1-2min) ⑶复染：亚甲基蓝 （30秒)
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二、墨汁负染色法 目的
墨汁负染色法观察新型隐球菌的球菌的荚膜较厚，一般不 易着色，同时菌体折光性较强，用墨 汁负染色法可在黑色背景下看到透亮 的菌体。
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二、墨汁负染色法
材料
1.菌种 新型隐球菌 2.试剂 优质墨汁 3.其他 载玻片、盖玻片、镊子、普通 光学显微镜
《医学微生物学》实验五
一、抗酸染色法 二、墨汁负染色法
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一、抗酸染色法 目的
抗酸染色观察结核分枝杆菌的形态。
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一、抗酸染色法
原理
分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量 较高，特别是其中大量分枝菌酸可影响 染料穿入。一旦着色后不易被盐酸酒精 脱色。
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一、抗酸染色法 材料
结核病人的痰液标本、抗酸染色液 试剂盒、试管夹、玻片等。
墨汁负染色法可鉴别新型隐球菌。

东莞市新涌医院
检验科
抗酸染色
作业指导书
文件编号：
第1页，共1页
版本：第一版，第0次修改
生效日期：2011年4月
一、目的
主要用于结核杆菌等抗酸性菌的涂片染色。
二、原理
结核菌、麻风杆菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质之皮膜而不易着色，但一经着色后，酸性酒精的作用亦是不容易把它脱色。
三、试剂组成
1、石碳酸复红溶液
6、滴加亚甲基蓝溶液，染色30秒钟。
7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去亚甲基蓝溶液，然后沥去标本上剩余的水，
待玻片干燥后镜检。
五、结果解释
在淡蓝色背景下，抗酸性菌呈红色，其他细菌及细胞呈蓝色。
六、注意事项
1、染色时勿使玻片上的染液干燥。
2、涂抹后的痰膜不能太厚或太薄，以透过痰膜看报纸上的5号字时字迹较模糊，为适宜的厚度；看不见5号字或很清晰，则表明该玻片涂抹太厚或太薄。
2、酸性酒精溶液
3、亚甲基蓝溶液
4、
四、检验方法
1、涂片自然干燥后加热固定。
2、滴加石碳酸复红溶液盖满玻片，加热至蒸汽后停止加热，保持染色5分钟。
3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4、自痰膜上端外缘滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1~2分钟。
5、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去酸性酒精溶液，沥去标本上剩余的水。
3、由于香柏油能够溶解复红染料，使萋-尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害，故禁止使用香柏油，必须使用显微镜专用的镜油
4、酸性酒精溶液用完后，可自制5%盐酸酒精溶液作为脱色液。
5、每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发。
6、试剂贮存时，尽量避免高温、低温环境及阳光直射。
7、本试剂应由专业人员使用。

3 Auramine-O染色法
这种方法使用荧光染色剂，使抗酸菌呈现黄绿色荧光，有助于快速检测。
Ziehl-Neelsen染色的步骤是什么？
1
制备涂片
将待染菌涂于玻璃载玻片上，形成细加热固定 Nhomakorabea2
菌单层。
用加热法使细菌附着在载玻片上，并
固定其形态和结构。
3
染色
在载玻片上滴加抗酸染色剂，使细菌
脱色
4
呈现红色。
与常规染色相比，抗酸染色更具选择性，能够突出抗酸菌的特征。同时，抗 酸染色也需要使用特定的染色剂和技术步骤，以扩大可观察的细菌范围。
抗酸染色有哪些常用方法？
1 Ziehl-Neelsen染色法
这种方法使用碱性染色剂和酸性脱色剂，使抗酸菌呈现红色，而其他细菌则呈现蓝色。
2 Kinyoun染色法
与Ziehl-Neelsen染色法类似，但使用的染色剂浓度更高，可以更好地突出抗酸菌的颜色。
抗酸染色的原理基于细菌细胞壁的化学成分差异。染色过程中，通过特定染 色剂的作用，使得抗酸菌呈现鲜艳的颜色，而其他细菌则没有被染色。
抗酸染色的应用范围是什么？
抗酸染色广泛应用于微生物学、医学诊断和环境卫生等领域。它可以帮助研 究人员识别和鉴定细菌群落，并在疾病诊断和卫生监测中起到重要作用。
抗酸染色与常规染色有什么不 同？
抗酸染色的结果如何分析？
抗酸染色结果可通过显微镜观察，根据染色颜色、形态、结构等特征来鉴定 和分析细菌的种类和数量，从而得出相关结论。
抗酸染色中常见的误诊是什么？
在抗酸染色过程中，可能会出现误诊情况，例如未正确定位抗酸菌，染色剂 浓度不足或过量等。正确的技术操作和经验可以减少误诊的发生。
抗酸染色在细菌学研究中的应用案例。

石碳酸复红-------抗酸Ⅰ液 3% 盐酸酒精---- 抗酸Ⅱ液 碱性美蓝 ----- 抗酸 Ⅲ 液
方法
1. 制片（涂片3次），干燥，固定。 2. 初染:
抗酸 I 液 覆盖标本，加热5 min。(注:至蒸汽产 生, 勿煮沸, 及时添加染料)
冷却后细水流冲洗。 3. 脱色 :
抗酸II液 30 sec，细水流冲洗。 4. 复染：
旋转平板 90°
注意：用力均匀、轻柔；不能重复；第四区只接触第三区
结果
• 细菌生长现象
–菌苔 –菌落
–画图并描述菌落 的种类、大小、 形态、色泽、边 缘等
目的：分离细菌
菌苔 菌落
2、液体培养基接种：接种环、 生长现象
表面生长
专性需氧菌：枯草杆菌、结核分枝杆菌等
基本接种方法
• 固体平板分区划线 • 液体培养 • 斜面接种 • 半固体穿刺
1、平板分区划线法
• 培养基
–固体琼脂平板 （1人/组）
• 菌种
–金大混合菌
• 接种环、酒精灯、标记笔等
接种环灭菌
打开菌种管试管口
试管口灭菌
取一环菌种
再次灭菌试管口
盖上塞子
四区划线
旋转平板90°
旋转平板90° 烧灼接种环
二、抗酸染色
• 目的：
掌握抗酸染色原理及方法。
• 原理：
结核分枝杆菌细胞壁含大量脂类，普通染色 不能着色，经加热并延长时间后着色，但又不能 被盐酸酒精脱色，故可用来鉴别抗酸杆菌。
为什么不同的细菌着不同颜色 ?
抗酸杆菌
石碳酸复红+加热 盐酸酒精 碱性美蓝
非抗酸杆菌
材料
• 结核患者痰液 • 玻片、棉签、酒精灯、吸水纸、显微镜等 • 染料:

2.材料:抗酸染液和含BCG（卡介苗）痰液
3.方法:
(1)制片: 取痰液（3-4环），涂片， 固定。 (2)染色:
A. 滴加石炭酸复红（加热，维持5min)，水流冲洗； B. 滴加3%盐酸酒精（30s），水流冲洗； C. 滴加碱性美兰（1min），水流冲洗，吸水纸吸干，油镜检。
4.实验结果
蓝色背景（细胞、非抗酸菌）中红色分支状杆菌。
磨一小槽, 消毒, 向大头端进针, 注射0.2ml病毒液
30-45°
胶带纸封口，大头朝上, 37℃孵育3天
一、细菌分布调查 二、抗酸染色 三、病毒接种（一）
一、细菌分布调查
1、水(空平板培养基)
加自来水1ml,再加融化的琼脂,冷却后置37℃培养24h
2、空气中(普通琼脂平板培养基)
去皿盖放于实验台/窗台/走廊20min, 盖皿盖, 37℃培养24h
3、咽喉部位(血琼脂平板培养基)
棉拭子取咽喉部分泌物, 分 区划线接种, 37℃培养24h
涂片
抗酸菌 非抗酸菌
复红
脱色
美蓝
三、病毒接种（一）
材料
5-10天的鸡胚 病毒液（新城鸡瘟病毒） 照蛋箱
structure of egg
蛋壳 气室 卵膜 尿囊绒毛膜 尿囊腔 卵黄囊
蛋白
Strong healthy blood vessels. Embryo moves.
•划出气室 •胚胎、大血管 •避开大血管，蛋壳上磨出一个小槽
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4、皮肤(普通琼脂平板培养基)
食指洗前/后, 消毒液浸泡后,碘 酒消毒并酒精脱碘后,分别在培 养基上按指纹, 37℃培养24h
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1’