发酵过程优化

第一章、绪论第一节发酵过程优化在生物工业中的地位及其研究内容一、发酵过程优化在工业中的地位现代生物技术不仅能在生产新型食品、饲料添加剂、药物的过程中发挥重要的作用，还能经济、清洁地生产传统生物技术或一般化学方法很难生产的特殊化学品，在解决人类面临的人口、粮食、健康、环境等重大问题的过程中必将发挥积极的作用二、发酵过程优化的研究内容第一个方面是细胞生长过程研究第二个方面是微生物反应的化学计量第三个方面是生物反应过程动力学的研究（主要研究生物反应速率及其影响因素）第四个方面的内容是生物反应器工程（包括生物反应器及参数的检测与控制）第二节、发酵过程优化的研究进展一、发酵过程优化是生物反应工程的研究前沿之一生物反应动力学的研究内容：是有关生物的、化学的与物理过程之间的相互作用，诸如生物反应器中发生的细胞生长、产物生成、传递过程等及影响微生物反应宏观动力学的重要因素生物反应动力学研究的目的：是为描述细胞动态行为提供数学依据，以便进行数量化处理二、流加发酵1、概述流加发酵即补料分批发酵(fed-batch fermentation),有时又称版连续培养或连续发酵,是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法2、流加发酵与连续发酵和分批发酵的比较流加发酵介于分批发酵和连续发酵之间,兼两者的优点,又克服了两者的缺点.3、流加发酵的研究进展(1)、在20世纪70年代以前流加发酵的理论研究几乎是个空白，流加过程控制仅仅以经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇或恒速流加1973年日本学者Yoshida 等人首次提出了“Fed-Batch Fermentation ”这个术语，并从理论上建立了第一个数学模型，流加发酵的研究才开始进入理论研究阶段其后,随着研究深入,流加发酵在一下三个方面有重大进展 20世纪70年代中后期对流加发酵过程的动力学解析结合发酵过程的可测参数对流加过程进行反馈控制（如DO 法、CO2法、RQ(呼吸商)法、pH 法、代谢物法、萤光法等） (2)流加发酵的最优化研究流加发酵最优化研究的核心问题是找出最佳的底物流加方式，以维持发酵过程始终处于最佳状态流加发酵最优化的研究内容包括：状态方程的建立;目标泛函的确定;最优化底物流加方式的求解 (3)对流加过程进行反馈控制流加发酵的物料衡算式可以表达为：方程试中, μ , π , σ 分别代表菌体,产物生成比速度及其质消耗比速,在等式中是以个相对于X,P,S 的函数,它可以是X,P,S 中某单一因子的函数,也可以是X,P,S 中两个或三个因子的函数. 4.高生产率和细胞密度发酵 细胞生长环境的优化策略 (1)培养基组成的优化 (2)特殊营养物的添加 (3)限制代谢副产物的积累 培养模式(1)所培养细胞的具体代谢行为(2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力(3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力 诱导策略细胞循环发酵 (应用限制：作用于进入过滤单元的细胞的剪应力太大；系统的放大存在许多实际困难)XV dtXV d μ=)(F S XV dt SV d F +-=σ)(XV dtPV d π=)(F dtdV=第二章、发酵过程优化原理第一节、发酵过程优化的微生物反应原理一概述1 大肠杆菌生长过程中观察到下列现象∶(1).在大肠杆菌快速生长期间，生物合成的中间体很少渗漏到胞外培养基中,结构单元(氨基酸、核酸等)的合成速率和聚合形成大分子的速率一致(2). 大肠杆菌胞内的大分子物质随比生长速率而变化(3).一旦生长培养基中的结构单元足够，细胞就不再合成这些物质(4)特定的代谢途径代谢特定的底物，只有底物存在时，细胞才合成相应的酶(5)若两个不同的底物同时存在于培养基中，细胞先合成能在一种底物上以较高比生长速率生长的酶系，当这种底物消耗完毕，再合成利用另一底物的酶。

二微生物的生长1 细胞生长过程可分为三个步骤:(1)底物传递进入细胞(2)通过胞内反应，将底物转变为细胞质和代谢产物(3)代谢产物排泄进入非生物相，即胞外培养基底物、代谢产物和细胞质成分的定义为：底物是一种存在于初始非生物相或者摄入物中起作用的可交换的化合物代谢产物是一种作为代谢物产生于某代谢途径进入非生物相的化合物细胞质成分是一种细胞利用底物产生的不可交换的化合物2 研究表明在膜上可能存在三种不同的运输机制：(1)自由扩散(2)协助扩散(3)主动运输前两种机制是沿着浓度梯度进行运输，是被动的过程，在运输过程中不需要提供外部能量。

而主动过程逆着浓度梯度进行运输，需要输入一定的吉布斯自由能。

3 微生物细胞的胞内反应(1)分解代谢反应糖类在转化为代谢产物(CO2、乳酸、乙酸和乙醇等)的同时，还形成ATP、NADH和NADPH。

NADH和NADPH都在分解代谢反应中产生，但NADPH 主要消耗于合成代谢中，NADH则主要消耗于分解代谢途径，如氧化磷酸化(2)生物合成和聚合反应为了合成细胞物质，需要合成结构单元并将其聚合。

合成蛋白质需消耗大量的自由能，细胞一般根据其自身需求来调节蛋白质的合成,其合成由蛋白质合成系统(PSS)负责，该系统中核糖体是主要部分E. coli中大约70%能量和还原力用于合成蛋白质.(3)次级代谢反应细胞代谢和生长过程偶联在一起的过程，称之为初级代谢许多工业上重要的产品，其合成反应并不与生长过程偶联，我们称之为次级代谢，这些反应合成的产物叫次级代谢产物，就象初级代谢形成的产物叫初级代谢产物一样.第二节、发酵过程数量化方法 一、数量化方法的基础 1. 发酵过程的速度 2. 化学计量学和热力学 3. 生产率、转化率和产率只有当变量可测量时，才有可能对发酵过程进行数量化处理 二、发酵过程的速度下表给出发酵过程的速度概念1. 菌体生长速度为∶2. 氧和底物利用速度:3. P 、C 和HV 生成速度为:4.细胞生长的比速率为μ：5. 底物消耗的比速率为qs ∶6. 产物形成的比速率为qp ：7. 氧消耗的比速率为qo ：8. 二氧化碳生成的比速率 为qc ：9.发酵热生成的比速率： dt dxr x =dt dsr s-=dtd r oo-=dt dpr p=dt dc r c=dtdHvr Hv =dtdxx ⋅=1μdtdsx q s ⋅=1dtdpx q p⋅=1dtdox q o ⋅=1dtdc x q c ⋅=1dt dH x q VH V⋅=1三.化学计量学和热量学 1.化学计量方程表示通用化了的碳源根据元素分析得出的细胞组成 表示产物2. 产率系数(1).宏观产率系数宏观产率系数(或称得率系数)Yi/j 是化学计量学中一种非常重要的参数，常用于对碳源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，其中i 表示菌体或产物，j 表示底物例如，菌体对底物的产率系数可表示为：生物反应过程中宏观产率系数的定义总览有时，以摩尔为单位表示产率系数更有利：相似的概念可用于表达重要的常数：值在实践中对推导元素平衡方程很重要，对与氧化磷酸化有关的理论问题也有重要意义vHv W C P X N O d c b a S H O H CO N O H C N O H C NH O N O H C ⋅++++→++ννννννννδγβαδγβα)()()()()()()(22''''32d c b a N O H C δγβαN O H C ''''δγβαN O H C ds dxr r dtds dt dx S S X X S X Y s x t t s x =-=≈--=∆∆-=//00/底物消耗的摩尔数细胞形成的碳摩尔数=C S Y 形成的摩尔数细胞形成的碳摩尔数ATP Y C ATP=氧消耗的摩尔数细胞形成的碳摩尔数=C O Y C O Y3.理论代谢产物产率假设发酵过程中完全没有菌体生成，则YP/S 可达理论最高值，称为理论代谢产物产率(1)根据化学计量关系计算例如，由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化学计量方程为∶ .依此计算，=147/180=0.82此处没有考虑反应过程中NADH 及ATP 等辅助底物的生成和消耗 (2).由生物化学计量关系计算根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径，进行代谢过程中有关NAD(P)+和ATP 等辅底物的物料衡算，结合化学计量关系可求出.上式：由该反应式得∶=(147×13)/(12×180)=0.75此处α-酮戊二酸的氨基化还原反应中所需要的NADPH 由异柠檬酸脱氢反应供给用生化计量式时, 必须清楚有关的代谢途径 4.实际发酵过程中的产率系数在实际发酵中，产率是变化的，产率取决于下列因素： Y= f (菌株、底物、μ、m 、Ｓ；、tm 、OTR 、C/N ，P/O)式中m 为混合度，S 为底物浓度，为平均滞留时间，tm 为混合时间，OTR 为氧传递速度，C/N 为碳氮比，P/O 为磷氧比 另外，Papoutsakis 和Lim(1981)用碳流分支的概念来解释菌体产率变化的原因：其中r 1和r ２分别为碳源分支代谢途径1和途径2的反应速度，MX 和MS 为菌体和底物的分子量，νx 是S →X 反应的化学计量系数，产率只随r ２或r １变化.在甲基营养菌中存在两种不同的碳代谢流：同化(r 2)和氧化(r 1)碳源和其它营养物的浓度或温度、pH 等培养条件的任何变化都可能引起r ２或r １变化这一概念表明，甲基营养菌菌体产率的变化是一个动力学问题，而不是生物合成问题第三节、微生物反应动力学OH CO NO H C O NH O H C 2249523612635.1++→++O H CO NO H C O NH O H C 22495236126272321213++→++21//11)(r r M M Y S X X S X +⋅=ν一、细胞生长动力学模型1.无抑制作用的细胞生长动力温度和pH 恒定时，对于某一特定培养基组分的浓度s ，Monod 方程为∶式中: μmax 称为最大比生长速率(h-1)，Ks 称为半饱和 常数(g/L).底物消耗速率方程对应为∶Monod 方程应满足∶(1)菌体生长为均衡型非结构生长；(2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物； (3)菌体产率系数恒定2.细胞生长稳定期和延迟期的Monod 型动力学 (1).延迟期动力学模型的建立 (2).生长稳定期动力学模型的建立式中α和β是经验常数，取α=μmax 和β=xmax 3.微生物死亡期和内源代谢 (1).微生物死亡期的动力学模型Kd 为比死亡速率 (h -1)对应于由底物生成菌体的一级反应速率为∶(2).内源代谢的动力学模型或ms 为细胞的维持系数(s -1)，Y*X/S 为最大细胞产率 4.底物和产物抑制的动力学模型(1).底物抑制动力学(Andrew 底物抑制模型)式中KIS 是底物抑制常数(2).产物抑制动力学（Hinshelwood 模型）SK Ss +=m ax μμSK Sq q s s s +=m ax,)1(),(/max L t t s e sK st s --+=μμ)1(βαx x r x -⋅=dtdxx kd ⋅-=1x k r d x )(-=μX m X Y r s S X s ⋅+⋅⋅=-μ*/1s SX s m Y q +⋅=μ*/1ISS K S S K //11max ++=μμ式中，P 为产物浓度，k 为动力学常数或: 式中KIP 为产物抑制常数二、微生物产物形成动力学模型Gaden 根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关系，将产物形成区分为三种类型:1. 也称为偶联模型（醇类、葡萄糖酸、乳酸）2. 也称部分偶联模型（柠檬酸、氨基酸）3.也称为非偶联模型（抗生素、酶、维生素、多糖）上述三种类型外还有一种模型是qP 与μ负偶联的模型，例如黑曲霉生产色素，其qP 与μ的关系可表示为：当考虑到产物可能存在分解时：式中，kd 为产物分解常数)1(max P k SK SS ⋅-+=μμPK KS K S IP IP S +⋅+=max μμX Y r Y r X P X X P P μ//==μX P P Y q /=X r r X P ⋅+⋅=βαβμα+⋅=P q X r P ⋅=ββ=P q μX P P P Y q q /max ,-=P k X r r d X P ⋅-⋅+⋅=βα。