乳酸脱氢酶测定标准操作程序

一、目的乳酸脱氢酶（LDH，LD）属于糖酵解酶，广泛存在于各种组织细胞的胞质中，以心肌、骨骼肌、肾脏含量最为丰富，其次肝、脾、胰、肺等，肿瘤组织，血液中均可检出。

红细胞内LDH含量较血清中高一百至数百倍，正常人血清中LDH主要来自红细胞，肝和骨骼肌。

二、测定方法连续监测法三、原理L—乳酸+NAD+ LDH丙酮酸+NADH+H+四．标本1.静脉抽取病人空腹血，臵于洁净干燥试管或含促凝剂的真空管内。

2.采血后应立即送到检验科生化室。

3.样品收到后立即分离血清，不能及时测定的血清应于2-80C保存。

4．严重溶血或脂血的标本不能测定。

五．设备及试剂1．希迈全自动生化仪。

2．上海复星长征公司乳酸脱氢酶试剂。

3．乳酸脱氢酶试剂应贮存于2—8℃冰箱。

六．操作步骤1．样本的准备：将编好号的样品离心，取血清加入样品杯放到样品盘的规定位臵，再把样品盘放到仪器中相应位臵。

2．试剂的检查：每天测定前先检查各种试剂的数量、效期、定标等情况，确认无误后方可进行测定。

3．操作方法：详见希迈生化仪操作手册。

七．质量控制每天操作过程中应使用上海复星长征公司的生化质控血清至少做一次室内质控，每年定期参加海南省临检中心所组织的室间质评。

八、干扰因素1、正常情况下，新生儿LDH含量最高，约为成人的两倍，随年龄增长逐渐降低至14岁时趋于稳定。

2、红细胞内LDH为正常血清的100多倍，故溶血标本不宜送检。

3、草酸盐可抑制LDH的活性，故不能用此抗凝剂的血浆测LDH。

4、LDH系细胞内酶，任何引起细胞膜通透性改变的情况（如剧烈运动、引组织缺氧等）均可使LDH在血中活性增高。

九、参考区间100 — 245 U/L十、实验室解释乳酸脱氢酶增高主要见于心肌梗塞、肝炎、肺梗塞、某些恶性肿瘤、白血病等。

某些肿瘤转移所致的胸腹水中乳酸脱氢酶活性往往升高。

目前，常用于心肌梗塞、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。

十一、异常结果处理实验结果应与临床诊断相符，结果偏高的可用生理盐水稀释后重新测定。

三级文件标准操作程序第2页共3页生效日期：目的：建立乳酸脱氢酶（LDH）测定标准操作规程。

范围：适用于乳酸脱氢酶（LDH）测定的标准操作。

职责：生化部检验人员对本规程的实施负责。

规程：1 测定方法：乳酸脱氢酶在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成NADH。

通过测定NADH在340nm处吸光度增加的速度可求得乳酸脱氢酶的活力。

LDHL-乳酸+ NAD+─────→丙酮酸+ NADH + H+2 仪器设备GS200全自动生化分析仪3 试剂3.1 乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，包括试剂1（R-1）、试剂2(R-2)。

试剂成份含量R-1 L-乳酸锂≥76mmol/LR-2 NAD+≥31mmol/l3.2 分析用人基质质控血清（RANDOX）、血清3.3 试剂稳定性与贮存乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒在2-8℃避光保存可稳定一年；试剂R-1、R-2开启后在2-8℃避光保存可稳定一个月。

3.4 样本稳定性与贮存3.4.1 分析用人基质质控血清：该血清自生产之日起，在2-8℃下保持可稳定4年；该血清一旦复融，在25℃下可稳定24小时，在2-8℃下可稳定7天，在-20℃可稳定1个月。

3.4.2 待测血清：2-8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月。

样本不可反复冻融。

不可使用已被污染的样本。

4 操作步骤4.1 打开全自动生化仪，按照GS200全自动生化分析仪操作维护保养程序，完成普三级文件准操作程序第3页共3页生效日期：通测试流程。

4.2 检验方法分析方法：速率A；主波长：340nm；副波长：405nm；样品量：8.0ul；R-1：320ul，R-2：80ul；校准方式：K因子；反应方向：上升；测定温度：37℃。

样本与R-1混匀后反应5分钟，加入R-2混合后延迟53秒，测定104秒。

样本8.0ul 主波长340nmR-1 320ul R-2 80ul 副波长405nm测光测光K=81990 5 6 8 min4.3 计算△A/min×Vt×1000ALT（U/L）= ─────────────6.22×Vs×d△A/min = 每分钟吸光度变化率Vt = 反应液总体积（ml）1000 =U/ml到U/L的转换系数 6.22 = NADH的毫摩尔吸光系数Vs = 样本体积（ml） d = 比色杯光径（cm）5 检验结果的解释抗坏血酸≤50mg/dl、游离胆红素≤684umol/L（40mg/dl），结合胆红素≤855umol/L （50mg/dl）、乳糜微粒≤2500浊度单位对测定无影响。

血清乳酸脱氢酶LDH速率法测定作业指导书1. 实验原理VITROS LDH试剂是一种干燥，多涂层的，在聚合物支撑基片上涂有分析成份的化学干片。

本法测LDH 采用丙酮酸和NADH作底物以产生乳酸和NAD+。

将一滴10ul的患者样品滴于干片上，样品就被分布层均匀地分布并渗透到下面的试剂层。

乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。

用反射强度变化测出NADH的氧化率，再将其转化成乳酸脱氢酶的活力。

测定方式：速率法波长：340nm测试时间和温度：37℃约5分钟反应过程：LDH丙酮酸+ NADH + H+———————→乳酸+ NAD2. 标本：2.1 病人准备：无特殊。

2.2 样品类型：血清；肝素锂/钠抗凝血浆。

2.3 标本采集与处理：Vitros测试血清和血浆的结果是一致的。

而其它一些方法由于在低速离心时血浆中血小板造成的污染，会使血清和血浆的测试结果有明显差异。

由于Vitros LDH干片对完整血小板内的LDH不敏感，因此对比方法的LDH结果会与Vitros肝素抗凝血浆的测试结果不一致。

样品采集后1小时内离心，然后吸出血清。

处理样品时要将其当成生物污染品。

3. 标本的存放：血清、血浆室温下最多2天；不可冷冻保存。

4. 标本的运输：样品要放在带盖的容器内以防污染和蒸发。

5. 标本拒收的标准：污染、溶血标本不能使用。

6. 试验材料：6.1 测试AST所需的物品包括：Vitros化学定标物Kit3；Vitros特制质控液；Vitros 7%BSA稀释液。

强生厂家提供原装进口，试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。

6.1.1 试剂组成：干片成分：反应成份是NADH和丙酮酸钠。

其它成份有聚合物颗粒，粘合剂，缓冲剂，表面活性剂，聚合物交叉连接剂和稳定剂。

干片标记：试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。

6.1.2 试剂准备从冰箱中取出干片盒，在将干片盒打开封装并装入仪器内的干片储藏器之前必须使其达到室温状态18～28℃。

血清乳酸脱氢酶（1.DH）速率法测定1.实验原理VITROS1.DH试剂是一种干燥，多涂层的，在聚合物支撑基片上涂有分析成份的化学干片。

本法测1.DH采用丙酮酸和NADH作底物以产生乳酸和NAD+0将一滴IOul的患者样品滴于干片上，样品就被分布层均匀地分布并渗透到下面的试剂层。

乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。

用反射强度变化测出NADH的氧化率，再将其转化成乳酸脱氢酶的活力。

测定方式：速率法波长：340nm测试时间和温度：37℃约5分钟反应过程：1.DH丙酮酸+NADH÷H+ --------------------------- 乳酸+NAD2.标本：2.1病人准备：无特殊。

2.2样品类型：血清；肝素锂/钠抗凝血浆。

2.3标本采集与处理：Vitros测试血清和血浆的结果是一致的。

而其它一些方法由于在低速离心时血浆中血小板造成的污染，会使血清和血浆的测试结果有明显差异。

由于Vitros1.DH干片对完整血小板内的1.DH不敏感，因此对比方法的1.DH结果会与Vitros肝素抗凝血浆的测试结果不一致。

样品采集后1小时内离心，然后吸出血清。

处理样品时要将其当成生物污染品。

3.标本的存放：血清、血浆室温下最多2天；不可冷冻保存。

4.标本的运输：样品要放在带盖的容器内以防污染和蒸发。

5.标本拒收的标准：污染、溶血标本不能使用。

6.试验材料：6.1测试AST所需的物品包括：VitroS化学定标物Kit3；VitrOS特制质控液；Vitros7(⅛BSA稀释液。

强生厂家提供原装进口，试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。

6.1.1试剂组成：干片成分：反应成份是NADH和丙酮酸钠。

其它成份有聚合物颗粒，粘合剂，缓冲剂，表面活性剂，聚合物交叉连接剂和稳定剂。

干片标记：试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。

6.1.2试剂准备从冰箱中取出干片盒，在将干片盒打开封装并装入仪器内的干片储藏器之前必须使其达到室温状态18~28℃。

乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明乳酸脱氢酶（LDH）法操作说明操作简介：乳酸脱氢酶（LDH）法是一种常用的生物化学分析方法。

本文将详细介绍使用乳酸脱氢酶法进行实验操作的步骤。

材料准备：1. 乳酸脱氢酶试剂盒2. 样品溶液3. 乳酸标准品4. 实验用试管和显微管操作步骤：1. 样品制备- 将待测样品装入实验用试管中。

每个样品应分别装入不同的试管，以避免交叉污染。

- 若样品过浓稀，需要进行适当的稀释，确保样品浓度在测试范围内。

2. 标准曲线制备- 准备不同浓度的乳酸标准品溶液，浓度范围可根据实验要求而定。

- 将不同浓度的标准品溶液分别装入实验用试管中。

3. 试剂添加- 分别向样品管和标准品管中加入相同体积的乳酸脱氢酶试剂，充分混匀。

4. 反应温育- 将所有试管置于恒温水浴中，温度设定为适合乳酸脱氢酶反应的温度（一般为37°C）。

- 在设定的反应温度下，将试管保持在水浴中反应一段时间（时间根据实验要求而定）。

5. 反应终止- 在反应时间结束后，以适当的方法终止反应。

常见的终止方式是添加酸性试剂或采用其他合适的方法。

6. 测定乳酸脱氢酶活性- 使用光度计、分光光度计或其他合适的仪器，测定样品和标准品反应后产生的光吸收值。

吸收值与乳酸脱氢酶活性成正比。

- 通过标准曲线，将样品的吸收值转化为对应的乳酸脱氢酶活性。

注意事项：1. 本实验操作需要严格按照实验室安全操作规范进行，避免任何可能导致个人受伤或污染的行为。

2. 实验过程中的试剂、标样和废液等应按照实验室规定的方法处理，不得随意丢弃。

3. 在操作过程中，保持实验器材和试剂的洁净，尽量避免外界因素对实验结果的影响。

4. 操作时需注意避免交叉污染，尤其是样品的装管和试剂的配比过程。

5. 样品和标准品的选择要合适，浓度范围应覆盖实验要求。

6. 温育过程中，确保试管能均匀受热，并避免发生温度不稳定的情况。

总结：乳酸脱氢酶（LDH）法是一种可靠的生物化学分析方法，适用于乳酸脱氢酶活性的测定。

血清乳酸脱氢酶同工酶测定（醋酸纤维素薄膜电泳法）[原理]先将血清在醋酸纤维素薄膜进行电泳使乳酸脱氢酶的同工酶分离，然后在薄膜上进行酶反应，显色试剂中包括有底物（乳酸）、NAD+、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）和碘硝基四唑蓝（INT），NAD+和PMS起递氢作用，INT最后接受氢被还原生成紫色的甲臜类化合物。

其反应如下：LD乳酸+NAD+丙酮酸+NADH2NADH2+PMS NAD++PMSH2PMSH2 +INT PMS+INTH2[试剂]1．PH8.6巴比妥缓冲液（离子强度0.05）：称取巴比妥钠10.3g，巴比妥1.84g，溶于热的蒸馏水中，冷后加蒸馏水至1L。

2．0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸二氢钾2.16g，磷酸氢二钠（Na2 HPO4.2H2O）30.13g, 溶于蒸馏水中，并稀释至1L。

3．0.5mol/L乳酸钠溶液：吸取60%DL—乳酸钠溶液9.25ml,加蒸馏水至100ml。

4．显色试剂：临用前配制下列试剂：（1）1mg/ml吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）水溶液；（2）辅酶Ⅰ（NAD+）10mg，溶于pH7.5磷酸缓冲液1ml；（3）碘硝基四唑蓝[氯化2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四唑]（INT）12mg，溶于pH7.5磷酸缓冲液3ml中；（4）0.5 mol/L乳酸钠溶液1ml。

其中（2）、（3）、（4）混合后为甲液，（1）为乙液；用时以甲液∶乙液=20∶1混合。

应用前，将上述溶液充分混和；但PMS水溶液加入量为0.2ml，且应待其他三种溶液混和后再加。

4．洗脱液：正丙醇9份与二甲亚砜1份混匀即可。

2 5． 2%醋酸：2ml 醋酸加水至100ml 。

[主要仪器]1. 恒温水浴箱2. 电泳仪和电泳槽3. 醋酸纤维素薄膜4. 载玻片5. 镊子6. 培养皿[操作步骤]1. 取8×2cm 薄膜一条，于无光泽面的一端2cm 处轻轻用铅笔画一直线（点样线），并在另一端上写上姓名，注明正极。

乳酸脱氢酶测定方法>我们知道，现实生活中存在着各样各样的的酶，这些酶可以单独作用，也可以相互作用，对我们的人体产生很大的影响，但是相信大家对于酶的测定方法还不是很熟悉吧，不相同酶的测定有不相同的方式方法，而且方式方法也种类不一，现此刻乳酸脱氢酶测定方法成为很多人研究的领域话题，那么终究该如何测定呢，下面就让我们一起来了解一下乳酸脱氢酶测定方法吧。

方法：实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量防备起泡。

每次检测都应该做标准曲线。

如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品吻合试剂盒的检测范围。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。

空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品 100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不波及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应 120 分钟。

为保证明验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体，甩干，不用冲洗。

每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl 生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比率配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60 分钟。

3. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡1-2 分钟， 350μl/每孔，甩干。

4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃， 60 分钟。

5. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟，350μl/每孔，甩干。

6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（ 30 分钟内，此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后3-4 孔梯度不明显，即可终止）。

7. 依序每孔加停止溶液50μl，停止反应（此时蓝色立转黄色）。

停止液的加入序次应尽量与底物液的加入序次相同。

为了保证明验结果的正确性，底物反应时间到后应赶快加入停止液。

乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。

二、临床意义（一）概述乳酸脱氢酶（LDH），又称L－乳酸－NAD+氧化还原酶，酶编号为EC 1.1.1.27，分子量约为34000道尔顿。

LDH是一种细胞质酶，存在于所有组织细胞中。

由于组织中的LDH 浓度比血浆高约500倍，即使组织的轻微损伤也将导致血清中活性的明显增高，在肝、心肌、骨骼肌和肾中发现高度组织特异性活性的酶。

（二）临床意义乳酸脱氢酶增高主要见于心肌梗死、肝炎、肺梗死、某些恶性肿瘤、白血病等。

某些肿瘤转移所致的胸腹水中乳酸脱氢酶活力往往升高。

目前，常用于心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。

（三）医学决定水平170U／L:此值在参考范围以内，等于或低于此值可排除许多与LDH升高有关的疾病，而考虑其他的诊断。

此值还可作为病人自身的对照，用来与以前或将来的测定值作比较。

300U／L：高于此水平时，应考虑到可能引起LDH升高的各种疾病，如心肌梗塞、肝病变、传染性单核细胞增多症、进行性肌营养不良等。

因此，应作其他各种试验，以作出明确诊断。

血清溶血可使测定值增高，应予以注意。

500U／L：高于此值，常见于巨幼细胞性溶血，急性白血病、慢性粒细胞性白血病、转移癌和肝昏迷等，此时应作其他多种检测来作出正确诊断。

三、检验原理L-乳酸＋NAD+−−LDH丙酮酸＋NADH＋H+−→NADH的生成速率与样品中LDH活性成正比，在340nm波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A／min)，即可计算出样品中LDH的活性。

四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。

样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。

组织ldh检测方法
乳酸脱氢酶同工酶（LDH）检测方法包括电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制法和酶切法等，但迄今最好的和用得最多的是电泳法。

具体操作如下：
1. 将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%满。

2. 吸去培养液，用PBS液洗涤一次。

换新鲜培养液（推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液），将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔（背景空白对照孔），未经药物处理的对照细胞孔（样品对照孔），未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞孔（药物处理样品孔），并做好标记。

按照实验需要给予适当药物处理（如加入0-10μl左右特定的药物刺激，可设置不同浓度，
不同处理时间，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照），继续按常规培养。

到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培
养液体积的10%。

加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。

3. 到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。

分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。

4. 各孔分别加入60μl LDH检测工作液。

混匀，室温（约25℃）避光孵育30min（可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动）。

然后在490nm处测定吸光度。

使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。

以上信息仅供参考，具体操作建议咨询专业人士。