鼠神经生长因子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

中山大学研究生学刊（自然科学、医学版）　第２９卷第２期ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＧＲＡＤＵＡＴＥＳ　ＶＯＬ．２９Ｎｏ２　２００８　ＳＵＮ　ＹＡＴ．ＳＥＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＮＡＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ、ＭＥＤＩＣＩＮＥ）２００８　

骨髓间充质干细胞向神经元细胞　

诱导分化的研究进展　

林耿鹏　’　刘泳烽　’　甘丹卉　’　邓宇斌　’　

（中山大学中山医学院，１）Ｏ４级本科，２）Ｏ４级本科，　

中山大学中山医学院病理生理教研室，３）教授，广州５１００８０）　

摘　要：骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）具有多胚层分化特性，是干细胞治疗的　

重要种子细胞之一。目前，大量体外及体内分化实验表明，ＭＳＣｓ在特定的细　

胞因子、生长环境及培养时间等条件下可以向神经元细胞分化，表现在其能表　

达神经元特异标志，并显示出神经元细胞的某些功能；对其分化的机制探索也　

在逐渐深入。但对于分化的持久性、具体机制如何等问题仍有待进一步研究。　

关键词：间充质干细胞；分化；神经元标志物；神经元样细胞　

骨髓造血干细胞（ＨＳＣｓ）和骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）共同组成骨髓干细胞。两　

者都是中胚层来源的细胞。其中，前者具有向各种血细胞分化的潜能；后者则具有向多　

种间充质细胞分化的能力¨］。目前，干细胞是治疗中枢神经系统损伤的一种疗效较为肯　

定的方法。干细胞的类型有多种，其中ＭＳＣｓ具有的多胚层分化特性、低免疫原性、取　

材方便、容易扩增、不存在伦理方面问题等特征，使其有可能成为干细胞治疗中的重要　

手段　］。有关ＭＳＣｓ向各种细胞分化的研究有许多，本文将对其向神经元细胞分化的研　

究作一综述。　

１　骨髓间充质干细胞的基本生物学特性　

１．１形态学及表面标志　

ＭＳＣｓ从形态上看，类似于黏附状态的成纤维细胞，胞体梭形。但迄今为止，还没　

有报道显示ＭＳＣｓ具有特异的表面分子标志。一般认为，ＭＳＣｓ不表达骨髓造血干细胞　

和内皮细胞的相对特异抗原，包括ＣＤ１１ａ，ＣＤ３４和ＣＤ４５　。　

第３６卷第５期第６２５页　２００７年１０月　华中科技大学学报（医学版）　Ａｃｔａ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ　Ｓｃｉ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｖｏ１．３６　Ｎｏ．５　Ｐ．６２５　０ｃｔ．　２００７　

Ｓｍａｄ３选择性调节ＴＧＦ—ｌ３１促进大鼠骨髓间充质　

干细胞成骨分化的实验研究　＊　

王运涛　郑启新　吴小涛　郭晓东　茅祖斌　陈　辉　赵梓汝　

东南大学附属中大医院骨科，南京２１０００９　华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，武汉４３００２２　

摘要　目的探讨转化生长因子８１（ＴＧＦ－￣Ｉ１）信号转导通路下游信号分子Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３在ＴＧＦ－Ｏｌ促进大鼠骨髓　间充质干细胞（ＭＳＣｓ）成骨分化中的作用。方法　采用ＲＴ—ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ＴＧＦ－１３１促ＭＳＣｓ成骨分化过程中　Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３　ｍＲＮＡ和蛋白表达的变化；脂质体介导稳定转染Ｓｍａｄ３ＡＣ，间接免疫荧光试验鉴定；采用ＲＴ－ＰＣＲ检测　转染细胞中碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和核心结合因子（ｃｂｆａ１）ｍＲＮＡ的表达，用对硝基苯磷酸盐（ＰＮＰ）法检测细胞ＡＬＰ活性，　用茜素红染色法检测细胞矿化能力，观察Ｓｍａｄ３ＡＣ对ＭＳＣｓ成骨分化的影响。结果　在ＴＧＦ－１３１刺激后２４　ｈ，ＭＳＣｓ中　Ｓｍａｄ３的ｍＲＮＡ和蛋白表达量明显减少（Ｐ＜Ｏ．０１），而整个刺激过程中，Ｓｍａｄ２的ｍＲＮＡ和蛋白表达量无明显变化（Ｐ　＞Ｏ．０５）；稳定转染细胞中ｃ—Ｍｙｃ抗原阳性表达；受ＴＧＦ－１３１刺激后，ＭＳＣｓ和Ｖ－ＭＳＣｓ（空载体转染组）中ＡＬＰ、ｃｂｆａｌ　ｍＲＮＡ的表达水平、矿化能力明显高于Ｓｍａｄ３ＡＣ－ＭＳＣｓ；随ＴＧＦ－［３１刺激时间延长，Ｓｍａｄ３ＡＣ—ＭＳＣｓ中ＡＬＰ活性增加缓　慢，仅于４８　ｈ有明显增加（Ｐ＜Ｏ．０５），但与同时段ＭＳＣｓ和Ｖ－ＭＳＣｓ中ＡＬＰ活性相比，差异有极显著性意义（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）。　结论ＴＧＦ－１３１促进ＭＳＣｓ成骨分化这一生物学效应的输出受Ｓｍａｄ３特异性和选择性的调节。　关键词　转化生长因子８１；　骨髓间充质干细胞；　Ｓｍａｄ２；　Ｓｍａｄ３　中图法分类号Ｒ３４９．６　

ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ（）Ｆ　ＡＮＡＴ（）ＭＹ　Ｖｏｌ－３４　Ｎｏ．５　２０１　１　解剖学杂志２０１１年第３４卷第５期　

多种细胞因子诱导大鼠间充质干细胞向多巴胺能神经元分化　

陈丹丹　付文玉　庄文欣　吕　娥　郭　健。　李锋杰　

（潍坊医学院，１组织学与胚胎学教研室，２医学研究实验中心，３药学实验室，潍坊２６１０５３）　

摘要　目的：探索音速波状蛋白（ＳＨＨ）、成纤维细胞生长因子一８（ＦＧＦ８）、碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）、全反式维甲酸　（ＡＴＲＡ）和胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）多种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ）向多巴胺（ＤＡ）能神经　元分化的可行性及分化后细胞功能的改变。方法：体外分离、扩增和鉴定大鼠ＢＭＳＣｓ；分别采用ｂＦＧＦ＋ＡＴＲＡ＋ＧＤＮＦ　和ｂＦＧＦ＋ＳＨＨ＋ＦＧＦ８细胞因子组合进行诱导，免疫细胞化学显色方法鉴定２组神经元样细胞，计数和比较２组阳性细　胞阳性率；荧光分析法测定诱导后细胞培养上清液中儿茶酚胺含量。结果：经过诱导大鼠ＢＭＳＣｓ能够分化为神经元样细　胞。免疫细胞化学显色呈神经巢蛋白、微管相关蛋白一Ⅱ、酪氨酸羟化酶（ＴＨ）阳性；且ｂＦＧＦ＋ＳＨＨ＋ＦＧＦ８组诱导的神经　元样细胞阳性率高于ｂＦＧＦ＋ＡＴＲＡ＋ＧＤＮＦ组。２组细胞上清液中儿茶酚胺类物质含量分别为（２．７３１±０．８１）ｔ￣ｇ／Ｌ和　（２．９７７±０．１６）ｔ￣ｇ／Ｌ。结论：ｂＦＧＦ＋ＳＨＨ＋ＦＧＦ８组合能够更有效地诱导大鼠ＢＭＳＣｓ分化为ＤＡ能神经元样细胞。　关键词　问充质干细胞；神经元；细胞分化；细胞因子；大鼠　

Ｓｏｍｅ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｉｎｄｕｃｅ　ｒａｔ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｉｎｔｏ　

ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　

Ｃｈｅｎ　Ｄａｎｄａｎ　，Ｆｕ　Ｗｅｎｙｕ　，Ｚｈｕａｎｇ　Ｗｅｎｘｉｎ。，Ｌｖ　Ｅ　，Ｇｕｏ　Ｊｉａｎ。，Ｌｉ　Ｆｅｎｇｊｉｅ。　

・－－——１２０６・—　——　文章编号：１００７—４２８７（２００８）１０—１２０６—０４　Ｃ　ｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａ￣ｎ，Ｏｃｔｏ￣ｒ，２ＯＯ８，Ｖ　ｌ　１２，Ｎｏ．１Ｏ　ＧＡＰ一４３在骨髓问充质干细胞向神经样细胞　分化过程中表达的实验研究　王晨光，苏冠方　，齐首楠，刘早霞，赵亮亮　（吉林大学第二医院眼科，吉林长春１３００４１）　摘要：目的观察生长相关蛋白．４３（ＧＡＰ－４３）在体外培养的骨髓问充质干细胞（ＢＭＳｃｓ）向神经样细胞分化中的表　达情况以探讨其在骨髓间充质干细胞定向分化过程中的作用。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，选取第３代　细胞，经流式细胞仪检测细胞表面标志物进行鉴定，并分别应用化学诱导剂Ｂ巯基乙醇（ＢＭＥ）和脑源性神经生长因子　（ＢＤＮＦ）诱导ＢＭＳＣｓ分化，观察诱导后细胞的形态学变化，并应用免疫细胞化学方法对诱导后的细胞进行鉴定、分析生　长相关蛋白４３、神经巢蛋白（ｎｅｓｔｉｎ）、神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）、神经丝蛋白（ＮＦ）的表达情况。应用统计学方法比　较两组细胞经诱导后２…４　６　８　ｈ　ＧＡＰ－４３免疫细胞化学染色阳性率。结果　第三代ＢＭＳＣｓ经流式细胞仪检测ＣＤｇＯ　（＋）、ＣＤ７１（＋）、ＣＤ２９（＋），ＣＤ４５（．），经两种方法诱导ＢＭＳＣｓ均可分化为神经样细胞，分化后细胞均表达ＧＡＰ－４３、　ｎｅｓｔｉｎ、ＮＳＥ、ＮＦ。诱导后２，４，６，８　ｈ　ＧＡＰ－４３表达阳性率Ｂ／ＶＩＥ组为７７．１％，８３．４％，８７．Ｏ％，８２．５％，ＢＤＮＦ组：６９．３％，　７８．１％，８２．２％，８６．８％。ＧＡＰ－４３随诱导分化时间增加而持续表达，两组问表达阳性率无统计学差异。结论ＧＡＰ－４３　在化学诱导剂及生长因子诱导ＢＭＳＣｓ分化为神经样细胞过程中持续表达，对于骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分　化具有重要意义。　关键词：生长相关蛋白４３；骨髓间充质干细胞；诱导；分化；免疫细胞化学　中图分类号：Ｑ８１３　文献标识码：Ａ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ＧＡＰ－４３　ｅｘｐｒｅｓ￣ｏｎ　Ｏｉｌ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｎｅｕｒｏｎ－ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌｓ　ＷＡＮＧ　Ｃｈｅｎ－ｇｎａｎｇ，ＳＵ　Ｃ．ｕａｎ－ｆａｎｇ，ＱＩ　Ｓｈｏｕ－ｎａｎ，ｅｔ　ａ１．（Ｅｙｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，朋ｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００４１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４３（ＧＡＰ－４３）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓ・　ｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＢＭＳＣｓ）ｔｏ　ｎｅｕｒｏｎ－ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌｓｉｎ　ｖｉｔｒｏｉｎ　ｏｒｄｅｒｔｏ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｔ’Ｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎｔｈｉｓ　ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＢＭＳＣｓ　ｏｆ　ｒａｔ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＢＭＳＣｓ　ｏｆｔｈｅ　ｔｈｉｒｄ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ．ＢＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎ—　ｄｕｃｅｄ　ａｎｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｂｅｔａ　ｍｅｍａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ＢＭＥ）ａｎｄ　ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｅ￣ｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍ　）ｌ１０１ｏ百ｃａｌ　ｃｈａｎｇ￣ｏｆｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｌｌｓｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ，ａｎｄＧＡＰ－４３，ｎｅｓｔｉｎ，ＮＳＥ　ａｎｄＮＦ　ｏｆｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｌｌｓｉｎｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙｉｍｍｔｍｏｃｙ・　ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅｓ　ｏｆＧＡＰ－４３　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｌｍｐａＩ划ｂｙ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｎ　２，４，６，８　ｈｏｕｒｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｔｈｉｒｄ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＢＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＤ９０（＋），ＣＤ７１（＋），ＣＤ２９（＋），ａｎｄ　ｃｏ４５（一）ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｅｙｔｏｍｅｔｅｒ．ＢＭＳＣｓ　Ｃａｎ　ｂｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｏ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｎｅｕｒｏｎ－ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ＢＭＥ　ａｎｄ　ＢＤＮＦ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ＧＡＰ－４３、ｎｅｓｔｉｎ、ＮＳＥ、ＮＦ．Ｏｎ　２，４，６，８　ｈｏｕｒｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ＧＡＰ－４３　ｗｅｒｅ　７７．１％，８３．４％，８７．０％，８２．５％ｉｎ　ＢＭＥ　ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ　６９．３％，７８．１％，８２．２％，８６．８％ｉｎ　ＢＤＮＦ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＢＭＳＣｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ＧＡＰ－４３　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｍｔｅｓ　ｏｆＧＡＰ－４３　ｓｔａｉｎｉｎｇ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎ－　ｄｕｓｉｏｎ　ＧＡＰ－４３　ｃａｎ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙｉｎｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓｔｈａｔ　ＢＭＳＣｓ　ａｒｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏ　ｎｅｕｒｏｎ－ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌｓｂｙ　ｅｉｔｈｅｒｅｈｅｍ－　ｉｅａｌ　ｉｎｄｕｃｅｒ　ｏｒ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ　ｐｌａｙ　ａ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｃｅｓｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＧＡＰ－４３；ＢＭＳＣｓ；Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（Ｃｈ／ｎ　ＪＬａｂ脚ｌ，２００８，１２：１２０６）　骨髓问充质干细胞（ｂｏｎｅ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）是存在于哺乳动物骨髓基质中的一类　具有多种分化潜能的成体干细胞。由于ＢＭＳＣｓ较　易获得，分离培养较为容易，且可分化为多种组织细　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０４７１８５８）；吉林省科技发展　计划项目（２００７０５１９３）　＊通讯作者　胞，因而使其在疾病的治疗以及组织工程领域具有　广阔的应用前景。ＢＭＳＣｓ向神经细胞方面的定向分　化研究将为临床上神经细胞缺损疾病的治疗带来新　的希望，但目前对于ＢｌＶＩＳＣｓ定向分化机制的研究仍　处于探索阶段，关于ＢＭＳＣｓ向神经细胞方向分化的　确切机制也还有待进一步深入研究。　神经生长相关蛋白（ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｓｓｏｃｉａｔ