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实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析
小麦幼苗过氧化物酶同工酶
生物111班 杨明轩 1102040128
一、研究背景及目的
过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 - 1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。基于 “差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
一、实验目的
1、 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）的基本原理和操作方法。
2、 掌握蛋白质和核酸在聚丙烯酰胺凝胶中的分离和检测技术。
3、 运用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品的纯度和分子量。
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成的三维网状结构。
这种凝胶具有分子筛效应，即不同大小和形状的分子在电场中通过凝胶时受到的阻力不同，从而实现分离。蛋白质和核酸等生物大分子在一定的 pH 条件下带有电荷，在电场中会向与其电荷相反的电极移动。分子的电荷量、大小和形状等因素共同影响其在凝胶中的迁移速度。
对于蛋白质，通常采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。SDS 能使蛋白质变性并与蛋白质结合，形成带大量负电荷的 SDS蛋白质复合物，消除了蛋白质原有的电荷差异，使得蛋白质的迁移速度主要取决于其分子量大小。 对于核酸，常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率更高，适用于分离小片段的核酸，如寡核苷酸和 RNA 片段。
三、实验材料和仪器
1、 材料
标准蛋白质样品（如分子量已知的蛋白质Marker）
待测蛋白质样品
核酸样品（如 DNA 片段）
丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺
过硫酸铵（APS）
N,N,N'，N'四甲基乙二胺（TEMED）
十二烷基硫酸钠（SDS）
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
甘氨酸
盐酸
溴酚蓝
考马斯亮蓝 R-250 染色液
脱色液 琼脂糖
2、 仪器
垂直电泳槽
直流稳压电源
移液器
离心管
微量进样器
脱色摇床
凝胶成像系统
四、实验步骤
（一）制胶
1、 安装电泳槽：将两块玻璃板洗净、晾干，放入电泳槽中，用夹子夹紧，确保玻璃板之间无空隙。
聚丙烯酰胺凝胶电泳 作用：用于分离蛋白质和寡糖核苷酸。
作用原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。 而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的分离和检测生物大分子的方法。它的原理是利用聚丙烯酰胺凝胶的孔隙大小和电荷特性，将不同大小和电荷的生物大分子分离开来。
将待分离的生物大分子样品加入到聚丙烯酰胺凝胶中，然后通过电泳的方式将样品分离开来。电泳是利用电场作用力将带电粒子分离的方法，它的原理是根据带电粒子的电荷大小和电场强度的不同，使它们在电场中运动速度不同，从而实现分离。
在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电泳槽中的聚丙烯酰胺凝胶是一个三维网状结构，具有一定的孔隙大小和电荷特性。当电场通过凝胶时，带电的生物大分子会在凝胶中移动，根据其大小和电荷特性，不同的生物大分子会在凝胶中停留在不同的位置上，从而实现分离。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离效果受到凝胶浓度、电场强度、电泳时间等因素的影响。通常情况下，凝胶浓度越高，孔隙大小越小，分离效果越好；电场强度越大，分离速度越快，但也容易出现样品热失活和凝胶破裂等问题；电泳时间越长，分离效果越好，但也容易出现样品扩散和凝胶老化等问题。
聚丙烯酰胺凝胶电泳广泛应用于生物学、生物化学、医学等领域，可以用于分离和检测DNA、RNA、蛋白质等生物大分子，是一种非常重要的实验技术。
