大肠杆菌自家灭活油乳苗的制备及疫苗质量检验

山东畜牧兽医2017年第38卷16猪场大肠杆菌灭活苗的制备与免疫效果观察王富贵（山东省安丘市金冢子畜牧兽医管理站 262100）摘要 本研究从惠丰猪场发病仔猪中分离到致病性大肠杆菌，并对血清型菌株O64、O9、O149进行培养，经甲醛灭活，以铝胶佐剂，制成灭活菌，经检验该疫苗合格，对同型菌的攻毒保护率80%。

关键词大肠杆菌、仔猪、免疫中图分类号：S859.79+7 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2017)02-0016-03仔猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一组肠道传染性疾病，常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病三种，以发生肠炎、肠毒血症为特征，主要发生在0~70日龄的仔猪[1]。

大肠杆菌属于条件性致病菌，当环境因素恶劣或机体抵抗力下降时，容易引发该病发生，尤其是冬季，天气寒冷，气温剧变，保温不良，空气流通不畅，更易引发此病，造成新生仔猪大批死亡或生长发育不良，严重影响养猪业的发展，给养猪户造成巨大的损失[2]。

惠丰猪场，母猪群5500头，存栏量47000头，品种为长白、大约克和杜洛克, 年产仔猪约120000头。

2015年该猪场猪群健康，年出栏量10万头，说明该猪场免疫程序在2015年前都对预防大肠杆菌病起到过一定的作用。

2016年，该猪场突然暴发仔猪黄白痢病，主要表现为一窝仔猪出生时体况正常，于12h之后，突然有一两头表现全身衰竭，很快死亡。

以后其他仔猪相继发生腹泻，粪便呈黄色浆状，含有凝乳小片。

有的转为拉灰白色粘稠粪便为特征[3]，致使仔猪发育停滞、消瘦、抵抗力下降。

惠丰猪场也曾用疫苗预防和药物治疗仔猪黄白痢，但效果不佳。

为此，从该猪场分离筛选出致病性大肠杆菌株制成铝胶苗用于该猪场后，仔猪黄白痢得到有效的控制。

1 材料与方法1.1 材料（1）用灭菌棉签从该场典型黄白痢病仔猪肛门拭取20个粪样，置无菌试管中作为病料。

（2）麦康凯和伊红美蓝琼脂培养基(上海市医学化验所试剂厂)产品型号：20151224，20种大肠杆菌0抗原单价血清(中监所)，肠杆菌科生化编码鉴定管，铝胶佐剂(浙江省军区后勤部卫生防疫检疫所)产品型号：20160104。

猪大肠杆菌多价油乳剂灭活苗
一、用途
预防大肠杆菌引起的子猪黄、白痢。

二、用量
1、未经本疫苗免疫过的初产母猪，于产前21天注射1次，每头用1毫升。

1周后加强免疫1次，每头用1毫升。

2、经本疫苗免疫过的经产母猪，于产前14～21天注射1次，每头用1毫升。

免疫期猪接种本疫苗后10～14天产生免疫，免疫期为3～4月。

贮藏本疫苗在－18℃环境中保存，有效期为两年；在4℃～10℃环境中保存，有效期为12个月。

三、注意事项
1、本疫苗在运输、使用过程中避免日光直射，环境温度不超过30℃。

2、必须保证使每头子猪吃足初乳。

3、当地应无疾病流行，被接种的猪一定要健康。

4、疫苗启封后一次用完，使用前应仔细检查，如发现有其他异物、变质等现象均不能使用。

5、注射器、针头等用具，用前需经煮沸消毒30分钟，注射部位采用酒精消毒，忌用碘酊。

6、对猪舍应严格监视，早期诊断，早期隔离发病猪，及时消除
传染源，并定期进行带猪消毒和转群消毒。

实验十一鸡大肠杆菌灭活疫苗的制备和检验细菌性灭活疫苗制备的基本程序为菌种的选择和种子的生产、菌液培养、灭活、配苗和分装，在此过程中还包括菌种、半成品以及成品检验。

大量生产的细菌培养方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。

灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行。

灭活疫苗的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。

鸡大肠杆菌灭活菌通常采用司盘白油佐剂，经过乳化而成。

一、目的要求1、了解细菌性灭活疫苗制造和检验的基本原理和过程。

2、掌握种子的生产、菌液培养、灭活、配苗和半成品以及成品检验方法。

二、材料与试剂1．材料(1)菌种：鸡大肠杆菌灭活疫苗菌种或临床分离株。

(2)实验动物：1～4月龄健康鸡。

(3)主要器材：超净工作台、恒温培养箱、冰箱、摇床、胶体磨、压盖机、高压锅、显微镜、酒精灯、温度计、普通试管、三角瓶、平皿、1ml注射器、疫苗瓶、瓶盖、记号笔和SPF鸡隔离箱等。

2．试剂蛋白胨营养琼脂培养基、普通肉汤培养基、甲醛溶液、鉴别培养基、甲醛溶液、佐剂等。

三、实验内容1、大肠杆菌培养与细菌的灭活。

2、大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的配制。

3、大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的成品检验方法。

四、操作步骤1．大肠杆菌茵液培养(1)种子液：将大肠杆菌菌种或临床分离株，分别于普通肉汤培养基中，置36～37℃保温18～24h，经纯检验后作为种子液。

(2)细菌培养：将种子液接于蛋白胨营养琼脂培养基表面，36～37℃保温24h。

加适量灭菌生理盐水将细菌洗下，装入玻瓶中，充分振荡菌液，使细菌分散开。

(3)纯检：将培养的细菌菌液接种于琼脂培养基表面，36～37℃保温24h。

观察菌落大小，应均匀一致。

(4)细菌计数：用麦氏比浊管法测定菌数或用平板计数，将菌数调整为15亿个／ml。

2．细茵灭活按菌液体积加入终浓度为O．3％的甲醛溶液，于37℃温箱中灭活24h，其振荡数次。

灭活后取少量菌液，接种于普通营养琼脂平板，37℃培养24～48h，进行灭活检验。

摘要大肠杆菌自家灭活油乳苗的制备及疫苗质量检验研究结果表明,按乳化剂的亲水亲油平衡值设计4个配方,通过对乳化剂粘度测定、乳剂类型测定、稳定性测定得出最佳乳化剂配方为90%白油、10%司本-80、2.0%吐温-80、1%硬脂酸铝。

以此配方作为免疫佐剂,制备自家灭活油乳苗,并对其质量进行检验。

经检验合格后,采用流行病学方法评价疫苗的免疫接种效果。

结果表明,自家苗对试验动物小白鼠有保护力。

关键词大肠杆菌;灭活油乳苗;制备;疫苗质量;检验中图分类号S852.5+2文献标识码A 文章编号1007-5739(2013)05-0274-01大肠杆菌自家灭活油乳苗的制备及疫苗质量检验付兴祥1张忠平2张海琴2刘琼2赵永平2杨贵树3*(1云南省禄劝县九龙镇畜牧兽医服务中心,云南禄劝651500;2四川省南充市高坪区畜牧局动物疫病预防控制中心;3云南农业大学)大肠杆菌为肠杆菌科、埃希菌属,兼性厌氧菌,为革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。

由Echerich 于1885年发现。

在相当长的时期内,一直被视为正常菌群。

直到20世纪中叶,人们才认识到一些特殊血清型对人和动物有致病性。

大肠杆菌血清型较多,各血清型之间没有交叉免疫力,菌株易发生变异,因此市售大肠杆菌疫苗无法覆盖所有致病性大肠杆菌血清型。

自家疫苗针对性强,在未引入外来畜禽前能收到较好的免疫效果。

因此,及时分离到菌株,制取自家灭活疫苗来免疫畜禽是一种经济、效果好的预防致病性大肠杆菌的措施。

1材料与方法1.1试验材料1.1.1主要试剂。

营养肉汤、Minca 培养基、麦康凯培养基、硫乙醇酸盐(T.G )培养基、酪胨琼脂(G.A )培养基、葡萄糖蛋白胨水(G.P )培养基、白油、司本-80、吐温-80、硬脂酸铝、0.85%生理盐水,甲醛溶液,麦氏浊管。

1.1.2仪器。

胶体磨、电子天平、精密试纸、HY-8大容量振荡器、PGX 型多段可编程光照培养箱、电热恒温培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、SW-CJ-1FD 型单人单面净化工作台、TDL-40B 离心机、冰箱、离心管。

鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗的制备及质量检验作者：刘玉华等来源：《安徽农业科学》2014年第36期摘要[目的] 为有效控制鸭大肠杆菌病的流行提供参考依据。

[方法] 利用分离自泰州某规模化养鸭场的大肠杆菌菌株TZY1作为菌种，制备鸭大肠杆菌铝胶灭活苗，并进行相应的质量检验。

[结果] 通过无菌检验、安全检验和动物保护力试验发现自制疫苗无外源性微生物污染，对雏鸭安全性好。

对雏鸭的攻毒试验结果表明制备疫苗的免疫保护率达100%，该疫苗的免疫剂量为0.5 ml。

田间试验结果表明免疫保护率达95.1%。

[结论] 成功制备了鸭大肠杆菌铝胶灭活苗。

关键词鸭；大肠杆菌；铝胶；灭活苗；制备中图分类号S834文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12929-02Abstract[Objective] The research aimed to provide reference basis for controlling the prevalence of duck colibacillosis effectively. [Method] TZY1 strain of Escherichia coli separated from a largescale duck farm in Taizhou was used to prepare the aluminum hydroxide inactivated vaccine against Escherichia coli of duck. And its quality indices were examined. [Result] The results of sterilization test， safety examination and animal protection test showed that the selfprepared vaccine wasn’t polluted by exogenous microorganisms and it had good safety to ducklings. The results of challenge experiment on ducklings showed that the immune protection rate of the selfprepared vaccine reached 100% and its immunization dose was 0.5 ml. The results of field experiment shoed that the immune protection rate was 95.1%. [Conclusion] Aluminum hydroxide inactivated vaccine against Escherichia coli of duck was successfully prepared.Key wordsDuck； Escherichia coli； Aluminum hydroxide； Inactivated vaccine； Preparation鸭大肠杆菌病是由某些致病血清型的大肠杆菌引起的鸭较为常见的细菌性疾病[1]。

大肠杆菌灭活苗的制备实验报告实验目的：1.熟悉大肠杆菌培养和灭活方法；2.学习掌握灭活苗制备的实验技术。

实验原理：实验步骤：1. 大肠杆菌培养：取一块LB平板，用灭菌铁环沾取一点大肠杆菌单克隆菌株，点接在含有LB培养基的离心管中。

将培养管放入恒温摇床中，以37℃、200rpm的条件下培养12-16小时。

2.培养基的制备：将1LLB培养基溶解于适量的蒸馏水中，加入适量的琼脂糖。

将混合溶液调节至pH7.0左右，然后将溶液加热至溶解琼脂糖完全。

将溶液分装入离心管中，每管倒满2/3，然后将倒置固化。

3.灭活实验：将大肠杆菌培养物离心，去除上清液，然后加入对应的化学灭活剂。

常用的化学灭活剂有福尔马林、甲醛以及石灰。

选择合适的灭活剂和浓度，将大肠杆菌悬液与灭活剂混合，混匀后放置室温下静置一段时间。

4.灭活后的处理：灭活结束后，将灭活后的大肠杆菌培养物通过离心使菌体沉淀，去除上清液。

然后用生理盐水洗涤培养物，再次离心使菌体沉淀。

重复洗涤步骤，以去除残留的灭活剂。

5.疫苗的制备：将洗涤后的菌体沉淀用生理盐水稀释至适宜浓度，然后将稀释液分装入疫苗瓶中。

6.储存条件：将制备好的大肠杆菌灭活苗储存在2-8℃的冰箱内。

储存期一般不超过3个月。

实验结果：制备好的大肠杆菌灭活苗应该呈现透明无菌液体。

实验注意事项：1.在培养大肠杆菌时要注意无菌操作，避免外源菌污染。

2.在灭活过程中，要控制好灭活剂的浓度和作用时间，避免对菌体产生过大的损伤。

3.制备疫苗后要储存于低温冰箱中，避免菌体的破坏和变化。

4.实验过程中要注意个人防护，避免与化学灭活剂直接接触。

实验总结：通过本次实验，我们成功地制备了大肠杆菌灭活苗。

制备疫苗的过程需要准确掌握各个步骤和相关技术，以确保疫苗的质量和效果。

此外，实验中还需要注意无菌操作、化学灭活剂的使用和个人防护等安全问题。

通过这次实验，我们不仅熟悉了大肠杆菌的培养和灭活方法，还对灭活疫苗的制备过程有了更深入的了解。

鸡大肠杆菌自家灭活疫苗的制备与应用研究
王耀邦;杜美丹
【期刊名称】《上海畜牧兽医通讯》
【年(卷),期】2009(000)001
【摘要】鸡大肠杆菌病是由致病性鸡大肠杆菌引起的一种最常见的传染病，也是危害我县养鸡生产最严重的一种传染病，其感染率几近100％，致死率在15％以上。

此病在不同季节、不同日龄均可发生，易与其他病混合感染，诱发了其他疾病的发生，增加了用药成本，降低了饲料报酬，同时降低了家禽产品的品质，造成重大经济损失。

【总页数】2页(P24-25)
【作者】王耀邦;杜美丹
【作者单位】浙江省缙云县畜牧兽医局,浙江,缙云,321400;浙江省缙云县畜牧兽医局,浙江,缙云,321400
【正文语种】中文
【中图分类】S8
【相关文献】
1.国家三类新兽药-鸡大肠杆菌病蜂胶灭活疫苗 [J],
2.鸡大肠杆菌病多价蜂胶灭活疫苗研究（Ⅰ报）——疫苗制备及免疫效力试验 [J], 杨峻;邵华斌
3.吉林城区鸡大肠杆菌多价油佐剂灭活疫苗的研制 [J], 李沐森;周淑荣
4.鸡大肠杆菌蜂胶多价灭活疫苗对肉仔鸡大肠杆菌病的防治效果 [J], 张文明;信守
会
5.鸽新城疫灭活疫苗的制备及应用研究 [J], 刁有祥;贾世玉
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大肠杆菌自家灭活油乳苗的制备及疫苗质量检验摘要大肠杆菌自家灭活油乳苗的制备及疫苗质量检验研究结果表明，按乳化剂的亲水亲油平衡值设计4个配方，通过对乳化剂粘度测定、乳剂类型测定、稳定性测定得出最佳乳化剂配方为90%白油、10%司本-80、2.0%吐温-80、1%硬脂酸铝。

以此配方作为免疫佐剂，制备自家灭活油乳苗，并对其质量进行检验。

经检验合格后，采用流行病学方法评价疫苗的免疫接种效果。

结果表明，自家苗对试验动物小白鼠有保护力。

关键词大肠杆菌；灭活油乳苗；制备；疫苗质量；检验大肠杆菌为肠杆菌科、埃希菌属，兼性厌氧菌，为革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。

由Echerich于1885年发现。

在相当长的时期内，一直被视为正常菌群。

直到20世纪中叶，人们才认识到一些特殊血清型对人和动物有致病性。

大肠杆菌血清型较多，各血清型之间没有交叉免疫力，菌株易发生变异，因此市售大肠杆菌疫苗无法覆盖所有致病性大肠杆菌血清型。

自家疫苗针对性强，在未引入外来畜禽前能收到较好的免疫效果。

因此，及时分离到菌株，制取自家灭活疫苗来免疫畜禽是一种经济、效果好的预防致病性大肠杆菌的措施。

1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 主要试剂。

营养肉汤、Minca培养基、麦康凯培养基、硫乙醇酸盐（T.G）培养基、酪胨琼脂（G.A）培养基、葡萄糖蛋白胨水（G.P）培养基、白油、司本-80、吐温-80、硬脂酸铝、0.85%生理盐水，甲醛溶液，麦氏浊管。

1.1.2 仪器。

胶体磨、电子天平、精密试纸、HY-8大容量振荡器、PGX型多段可编程光照培养箱、电热恒温培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、SW-CJ-1FD 型单人单面净化工作台、TDL-40B离心机、冰箱、离心管。

1.2 试验方法1.2.1 乳化剂配方的优化。

乳化剂配方设计根据乳化剂的亲水亲油平衡值，固定亲油性乳化剂司本-80，改变亲水性乳化剂吐温-80，设计4种乳化剂配方（表1），并与等量生理盐水乳化。

鸡大肠杆菌灭活疫苗制备2.西藏山南扎囊县农牧综合服务中心摘要:随着规模化养鸡业的迅速发展，鸡大肠杆菌病的发生和流行日益严重，几乎遍布所有的商业鸡场，给养鸡业带来很大的经济损失。

为了预防该病的传染，作者制备了鸡大肠杆菌病灭活疫苗。

制备了氢氧化铝胶佐剂和培养基，鸡大肠埃希氏菌的菌液培养、纯粹检验、活菌计数、灭活及无菌检验。

鸡大肠埃希氏菌病灭活疫苗:经无菌检验为阴性;经物理性状检验为:静置后上层是淡黄色的澄明液体，下层为灰白色沉淀，振荡后呈均匀混浊液;经鸡安全检验结果为安全;经鸡效力试验有效。

本病无论是药物预防还是疫苗的生物防治，都不是防治此病的根本方法。

要想减少或者杜绝大肠杆菌病的发生率，必须采取加强饲养管理、搞好环境卫生、严格消毒等综合防治措施才行。

鸡大肠埃希氏菌病灭活疫苗的制备，以及疫苗的无菌检验、物理性状检验、安全检验、效力检验等，其结果符合兽用生物制品检验的有关规程。

该疫苗是安全有效的。

鸡大肠杆菌灭活疫苗为免疫预防该病打下了良好的基础。

关键词:鸡，大肠杆菌，灭活疫苗鸡大肠杆菌病是由病原性大肠埃希氏杆菌引起的禽类传染病,由于大肠杆菌在自然界广泛分布，也是禽肠道的正常菌群[3]。

经常可从健康鸡的肠道中分离出致病性大肠杆菌血清型，表明大肠杆菌是条件致病菌或引起继发感染。

禽舍中的粪便和灰尘是致病性大肠杆菌的重要来源，细菌经呼吸道、消化道、种蛋等途径使禽发生感染。

各种年龄的家禽对大肠杆菌都能感染，但多发生于幼龄家禽，特别是雏鸡的发病率和病死率均较高。

近年来，随着规模化养鸡业的迅速发展，鸡大肠杆菌病的发生和流行日益严重，几乎遍布所有的商业鸡场，给养鸡业带来很大的经济损失。

同时，由于血清型众多和滥用抗生素导致耐药菌株的大量出现，使药物控制的难度越来越大，疫苗免疫接种成为有效的预防途径。

从西藏农牧学院实习牧场分离出的致病性鸡大肠埃希氏菌产生肠毒素。

将产肠毒素大肠杆菌称为(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)[1]。