临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
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生物素链霉亲和素联合免疫层析用于快速检测NT-proBNP
生物素链霉亲和素联合免疫层析用于快速检测NT-proBNP 孙宏浩;梁玉芬;赵晓双;黄玲;廖天作【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(037)002【摘要】为提高常规免疫层析技术的检测灵敏度,引入生物素-链霉亲和素系统,以荧光微球作为标记物,建立了一种新型快速定量检测NT-proBNP的方法.试验结果表明:新型试剂盒在0.02～30 μg·L－1范围能对NT-proBNP实现快速检测.在全血检测中,新型试纸条所测NT-proBNP 浓度与雷度快速免疫分析仪定量检测结果具有很好的一致性.新型免疫层析试纸条大大提高了快速检测的准确性,可广泛用于床旁检验(POCTs)等临床诊断阶段.%In order to improve the sensitivity of conventional immunochromatography,a novel rapid and quantitative assay for NT-proBNP was established by introducing biotin-streptavidin system and using fluorescent microspheres as a marker.The results showed that the new kit could detect NT-proBNP rapidly in the range of 0.02～30 μg·L －1.In whole blood test,the NT-proBNP concentration measured by the new test strip was in good agreement with the quantitative detection results of the RadioMeter AQT90 FLEX analyzer.The new immunochromatographic test strip greatly improved the accuracy of rapid test,and may be widely used in clinical diagnosis such as bedsidetest(POCTs).【总页数】5页(P6-9,15)【作者】孙宏浩;梁玉芬;赵晓双;黄玲;廖天作【作者单位】湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北省工业发酵协同创新中心,发酵工程教育部重点实验室,武汉430068;湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北省工业发酵协同创新中心,发酵工程教育部重点实验室,武汉430068;江西中医药高等专科学校医学基础部,抚州344000;湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北省工业发酵协同创新中心,发酵工程教育部重点实验室,武汉430068;江西中医药高等专科学校医学基础部,抚州344000;湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北省工业发酵协同创新中心,发酵工程教育部重点实验室,武汉430068【正文语种】中文【中图分类】O657.3;TB383.1【相关文献】1.实时生物分子相互作用分析技术用于链霉亲和素-生物素化抗体的层层组装研究[J], 裴仁军;崔小强;杨秀荣;汪尔康2.免疫层析法用于HCG快速检测的研究 [J], 李晨旭;尹晓光3.心脉隆注射液联合西药应用于冠心病心力衰竭患者治疗的临床疗效及血浆NT-proBNP的影响 [J], 曹彬;毕建杰4.构建下转换荧光-适配体的免疫层析试纸条用于快速检测黄曲霉毒素B1 [J], 王邹璐琪;李立煌;李丹阳;艾超超;任磊;孙本强5.胶体金免疫层析法应用于感染性肠道疾病病原的快速检测 [J], 宾羽琳;陈艳;邱灿林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
生物素-链亲和素
生物素-链亲和素
1 简介
生物素-链亲和素是一种用于分离和纯化特定蛋白质的技术。
生物素是一种维生素，链亲和素是一种人工合成的小分子化合物，它们可以相互结合形成生物素-链亲和素复合物。
这种复合物可以用于特异性地捕获具有生物素结合蛋白（如亲和标签）的蛋白质。
2 生物素
生物素是一种水溶性维生素，也称为维生素H。
它是许多酶类的辅助因子，参与多种代谢反应。
生物素可以通过食物摄入或肠道内微生物的合成获得。
生物素在生物体内的作用包括促进葡萄糖、脂肪和氨基酸的代谢，以及DNA复制和表达的调节。
3 链亲和素
链亲和素是一种人工合成的小分子化合物，它是由生物素和亲和基团（如imidazol）组成的。
链亲和素可以与生物素结合，形成生物素-链亲和素复合物。
链亲和素的亲和性可以通过改变亲和基团的结构来调节。
链亲和素可用于纯化和检测蛋白质，特别是那些具有生物素标签的蛋白质。
4 生物素-链亲和素的应用
生物素-链亲和素是一种常用的蛋白质纯化技术。
利用这种技术，可以通过将生物素-链亲和素复合物结合到具有生物素标签的蛋白质上，将目标蛋白质高效地分离和纯化出来。
此外，生物素-链亲和素还可用于检测和定量具有生物素标签的蛋白质。
5 结语
生物素-链亲和素技术是一种基于生物素标签的蛋白质纯化和检测方法。
通过利用生物素和链亲和素相互结合形成的复合物，可以高效地分离和纯化具有生物素标签的蛋白质。
这种技术广泛应用于生命科学研究和工业领域。
临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
但与聚苯乙烯的非特异性吸附较高。
6
亲和素活性单位 以亲和素结合生物素的
量来表示； 结合1μg生物素所需要
的亲合素量为1个亲合素 活性单位。一般1mg亲合 素约含13～15个活性单 位。
7
链霉亲合素（streptavidin,SA） 与亲合素(A)有类似生物学特性的一种蛋白质。
由Streptomyces avidinii菌分泌的一种蛋白 质，SA分子量为65000，由4条序列相同的肽链 构成，每条SA肽链可以结合1个生物素分子。 SA与A的ka虽然相同，但在实际应用中其检测 灵敏度明显优于A。
糖基化
多糖基化
无糖基化
结合生物素能力
4
4
亲和常数（K）
1015
1015
活性（U）
13～15
15～18
亲和素和链霉亲合素理化特性比较 9
第二节 生物素和亲和素 标记物的制备
一、生物素标记物的制备
1、作为标记物，活化生物素直接标记大分子生物活性 物质如抗原、抗体；
根据抗原或抗体分子所带可标记基团的类型（氨基、醛基或巯 基）以及分子的等电点
17
BAB法(直接法)检测原理示意图
18
二、标记亲和素－生物素法（labelled avidin-biotin tech, LAB）
直接法
间接法
LAB法(直接法)检测原理示意图
20
三、亲和素－生物素化酶复合物法（ABC）
ABC-双抗体夹心ELISA检测原理示意图
四、酶－抗酶－亲和素－生物素化酶 复合物法（PAP-ABC）
tlymphocytebab法直接法检测原理示意图二标记亲和素生物素法labelledavidinbiotintechlab直接法间接法lab法直接法检测原理示意图abc双抗体夹心elisa检测原理示意图三亲和素生物素化酶复合物法abcpapabc复合法检测原理示意图四酶抗酶亲和素生物素化酶复合物法papabc第四节技术评价与应用领域一技术评价1生物素b和亲和素a之间的高亲和力使反应试剂经得起高度稀释降低或避免了非特异性结合
6
亲和素活性单位 以亲和素结合生物素的
量来表示； 结合1μg生物素所需要
的亲合素量为1个亲合素 活性单位。一般1mg亲合 素约含13～15个活性单 位。
7
链霉亲合素（streptavidin,SA） 与亲合素(A)有类似生物学特性的一种蛋白质。
由Streptomyces avidinii菌分泌的一种蛋白 质，SA分子量为65000，由4条序列相同的肽链 构成，每条SA肽链可以结合1个生物素分子。 SA与A的ka虽然相同，但在实际应用中其检测 灵敏度明显优于A。
糖基化
多糖基化
无糖基化
结合生物素能力
4
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亲和常数（K）
1015
1015
活性（U）
13～15
15～18
亲和素和链霉亲合素理化特性比较 9
第二节 生物素和亲和素 标记物的制备
一、生物素标记物的制备
1、作为标记物，活化生物素直接标记大分子生物活性 物质如抗原、抗体；
根据抗原或抗体分子所带可标记基团的类型（氨基、醛基或巯 基）以及分子的等电点
17
BAB法(直接法)检测原理示意图
18
二、标记亲和素－生物素法（labelled avidin-biotin tech, LAB）
直接法
间接法
LAB法(直接法)检测原理示意图
20
三、亲和素－生物素化酶复合物法（ABC）
ABC-双抗体夹心ELISA检测原理示意图
四、酶－抗酶－亲和素－生物素化酶 复合物法（PAP-ABC）
tlymphocytebab法直接法检测原理示意图二标记亲和素生物素法labelledavidinbiotintechlab直接法间接法lab法直接法检测原理示意图abc双抗体夹心elisa检测原理示意图三亲和素生物素化酶复合物法abcpapabc复合法检测原理示意图四酶抗酶亲和素生物素化酶复合物法papabc第四节技术评价与应用领域一技术评价1生物素b和亲和素a之间的高亲和力使反应试剂经得起高度稀释降低或避免了非特异性结合
第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
➢ 电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基 因位点
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
生物素-亲和素标记技术完整讲解资料
4.2 在分子生物学中的应用
BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要 集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测以及将免疫 测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗 原的检测等方面。自从合成了生物素化的脱氧三磷酸脲苷 (dUTP)和UTP等核苷酸单抗以来，以生物素化多核苷酸为 探针的核酸杂交技术有了很大发展，常用于Southern、 Northern和原位杂交等。试验时，标记探针先与细胞或染 色体原位(或是固定在乙酸纤维素膜上)的变形核酸分子进 行杂交，然后用偶联了酶或荧光物质的亲和素(或链霉亲 和素)识别杂交互补片段，使其显色或产生荧光，这种技 术克服了放射性核酸探针标记与检测的缺点，应用潜力很 大。
4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡
2.上样
3.洗杂 4.洗脱
五 反应特点
1. BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。 2.生物素易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，再和生物素 衍生物结合，将信号多级放大，能保持大分子物质的原有生 物活性。 3.亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度 专一性，不增加非特异性干扰，也不会因反应试剂浓度高低 受影响。 4.酸、碱、变性剂及有机溶剂均不会影响亲和素与生物素的结 合力。裴仁军等试验结果表明，链霉亲和素与生物素能够在 结合表面形成均一的多层膜维系紧密的结合。 5.BAS不仅能与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合， 还可制成亲和介质，用于分离提纯。 6.BAS操作方便，反应结果可用肉眼观察，实验成本低。
接法和间接法，直接法是以游离的亲和 素(或链霉亲和素)作为桥联剂，利用亲和 素的多价性，将生物素化抗体复合物与 标记生物素(如酶标生物素)联结起来，达 到检测反应分子的目的。间接法则是在 抗原与特异性抗体结合反应后，再用生 物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结 合，从而使灵敏度进一步提高。由于生 物素化抗体分子上连有多个生物素，因 此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲和 素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分 子。加入相应酶作用底物后，会产生强 烈的酶促反应，提高检测灵敏度。Smith K A[5]利用间接BAB法检测乙型肝炎表面 抗原(HBsAg)，其灵敏度比常规ELISA高 1 000多倍。
生物素、亲和素标记技术
生物素、亲和素标记技术
教学ppt
1
一、生物素及其理化性质 1 概念 2 分子式 3 结构特点 4 溶解特性 5 等电点 6 其它特性
教学ppt
2
1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布 的一种小分子生长因子，又名辅酶R或 维生素H。
2 分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31
教学ppt
12
2 活性测定： ⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（红色） B A-B （出现黄色时B的量）
⑵ 分光光度法：
教学ppt
13
五、生物素标记物及亲和素标记物的制备：
1 生物素标记物的制备： B +Ab/Ag/E 交联剂
B-Ab/Ag/E
2 亲和素标记物的制备： A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E
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14
六、技术类型：
可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹 心法、间接法、竞争法等，在次基础上 引入A-B系统。
1 BAB法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A Ag-Ab·B-A
B·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
教学ppt
返回 15
2 BA法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A·E Ag-Ab·B-A-
DMF 制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺
二环己基碳二亚胺 标记特点：
BNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基 结合达到标记的目的
适用于：标记Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA
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6பைடு நூலகம்
2 长臂活化生物素(BCNHS)： DMF + 6-氨基己酸
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1
一、生物素及其理化性质 1 概念 2 分子式 3 结构特点 4 溶解特性 5 等电点 6 其它特性
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2
1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布 的一种小分子生长因子，又名辅酶R或 维生素H。
2 分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31
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12
2 活性测定： ⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（红色） B A-B （出现黄色时B的量）
⑵ 分光光度法：
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13
五、生物素标记物及亲和素标记物的制备：
1 生物素标记物的制备： B +Ab/Ag/E 交联剂
B-Ab/Ag/E
2 亲和素标记物的制备： A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E
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六、技术类型：
可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹 心法、间接法、竞争法等，在次基础上 引入A-B系统。
1 BAB法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A Ag-Ab·B-A
B·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
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2 BA法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A·E Ag-Ab·B-A-
DMF 制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺
二环己基碳二亚胺 标记特点：
BNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基 结合达到标记的目的
适用于：标记Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA
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6பைடு நூலகம்
2 长臂活化生物素(BCNHS)： DMF + 6-氨基己酸
生物素-链霉亲和素,作为荧光标记
生物素-链霉亲和素，作为荧光标记一、生物素-链霉亲和素的定义生物素-链霉亲和素是一种用于标记生物分子的荧光标记物。
它是由生物素和链霉亲和素组成的复合物。
生物素是一种维生素B7，也称作维生素H，它与链霉亲和素的结合具有较高的亲和力。
链霉亲和素则是一种可以与生物素结合并发出荧光的物质。
将生物素-链霉亲和素与所需标记的生物分子结合后，可以利用链霉亲和素的荧光发射信号来对生物分子进行检测和观察。
二、生物素-链霉亲和素的制备生物素-链霉亲和素通常通过化学合成的方式进行制备。
首先需要合成生物素分子和链霉亲和素分子，然后将两者进行反应结合，得到生物素-链霉亲和素复合物。
制备好的生物素-链霉亲和素可以在实验室中用于各种生物标记的研究工作。
三、生物素-链霉亲和素的特性1. 高亲和力：生物素和链霉亲和素之间的结合具有较高的亲和力，能够稳定地结合在一起，确保标记物在实验过程中不会轻易分离。
2. 显著荧光特性：生物素-链霉亲和素复合物具有明显的荧光特性，可以在适当的荧光激发条件下发出强烈的荧光信号，便于实验者进行观察和测量。
3. 稳定性：生物素-链霉亲和素复合物在适当的条件下具有良好的稳定性，可以在实验室中长时间保存和使用。
四、生物素-链霉亲和素在生物学研究中的应用1. 蛋白质标记：生物素-链霉亲和素可以用于标记目标蛋白质，通过观察蛋白质的荧光信号，可以研究蛋白质在细胞中的表达和定位等信息。
2. 细胞标记：生物素-链霉亲和素可以用于标记细胞膜表面的生物分子，有助于研究细胞相互作用和信号传导等生物学过程。
3. 分子探针：生物素-链霉亲和素作为一种标记物，可以用于研究分子间的相互作用和结构等相关信息。
4. 荧光显微镜：生物素-链霉亲和素标记的细胞和分子可以在荧光显微镜下观察，进一步拓展了荧光显微镜技术在生物学研究中的应用。
五、结语生物素-链霉亲和素作为一种荧光标记物，在生物学研究中发挥着重要的作用。
它具有高亲和力、显著的荧光特性和良好的稳定性，能够在生物标记的实验中提供可靠的信号和结果。
生物素-亲和素
该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合,进一
步提高检测灵敏度。
免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫
测定基础上发展起来的一种新的免疫学技术。是 凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、 敏感性、稳定性及可重复性的有机结合。
5. BA -组织化学技术
利用BA 技术将染料浓聚于靶细胞表面， 使其更利于观察， 提高了检测灵敏度。 Xia Y1 等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤
性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生 物有生物素酰肼（BHZ）及肼化生物素 （BCHZ）。
亲和素（ Avidin ）－抗生物素蛋白、抗生物素
是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白， 它由四个相同的氨基酸亚基组成， 亚基之间通过二硫键连接，亲和素 的每一个亚基含有一个与生物素结 合的位点，并与生物素或其衍生物 形成高度稳定的复合物。
1. BA-酶免疫技术
原理
亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再 将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔
内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来，
能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。
优点
生物素对抗体和酶的标记率高，又不影响其 他活性。 生物素亲和素的结合极为稳定，不会在孵育 和各种洗涤过程中脱落。 每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合 更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感 性。
۞ Morag
G.等使用硝基-(链霉)亲和素吸附于分离柱 上,分离提纯兔抗血清中的免疫球蛋白、抗-转移因 子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离 柱的生物学特性。
۞在制备特异性破骨细胞cDNA库时,加入 生物素化的mRNA,然后通过固相亲和素提取。 用斑点印迹法分析,发现在此提取物中, 高度聚集了特异性破骨细胞cDNA。
生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析
4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
生物素-亲和素系统相关技术3
3、BAS在放射免疫技术中的应用
4、
BAS在分子生物学中的应用
免疫-PCR
免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来 的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化 底物显色。
PCR具有很强的放大能力，其可以定量 地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和 特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通 过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由 此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
PCR技术具有高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
二、免疫PCR的发展
免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的
还不多；
实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，
且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几 百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检 测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适 用于检测一些含量特别少的抗原分子。
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯
（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。
2.标记蛋白质醛基：酰肼（BHZ）和肼化生
物胞素（BCHZ）。
3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）
-生物胞素（MPB）。
4.标记核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三
磷酸、BNHS和BHZ。
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯
降低ALP的活性。
活化生物素可与不同的大分子物质结合，应
根据可标记基团的种类及特性，选择相应的
活化生物素；
抗体：BNHS
偏酸性抗原：BHZ
核酸：光生物素
一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，即
生物素化大分子具有多价性，它是BAS多级 放大作用的物质基础。
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生物素（biotin，B）, 又称维生素H 、B7,动 植物中广泛存在，卵黄 和肝中含量高；
MW244.31D,有两个环状 结构；
Ⅰ环为咪唑酮环，为与 亲和素结合部位；
Ⅱ环为噻吩环，含一个 戊酸侧链，其末端可与 生物大分子连接，形成 生物素标记物。
咪唑酮环 噻吩环
羧基
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活化生物素 噻吩环上戊酸侧链
第十三章
生物素－链霉亲 和素标记免疫技术
Biotin-Avidin Labelling Immunoassay Tech
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第一节 生物素和亲和素 第二节 生物素和亲和素标记物的制备 第三节 生物素和亲和素系统的技术方法 第四节 技术评价与应用领域
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T lymphocyte
第一节 生物素和亲和素
PAP-ABC复合法检测原理示意图
第四节 技术评价与应用领域
一、技术评价 1、生物素（B）和亲和素（A）之间的
高亲和力，使反应试剂经得起高度稀 释，降低或避免了非特异性结合； 2、二者均可偶联蛋白质、核酸、多糖 等活性物质； 3、具有多级放大作用，使其具有高灵 敏性；
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二、应用领域 1、BAS与免疫标记技术 适用于微量抗原、抗体及其他生物活性物质
可影响标记物活性，如碱性磷酸酶标记 后活性会降低；
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亲和素（avidin,A） 从蛋清中提取的一种碱性糖蛋白，耐热及多种
蛋白水解酶作用，每个分子由4条相同亚基组 成，每个亚基都可以结合一个生物素分子。 与生物素结合的特异性高、稳定性好。
K=1015L/mol（BA），K=105～11L/mol（antigen-antibody）
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二、亲和素标记物的制备 1、几乎所有用于标记的物质均可与亲
和素结合，小分子如I125、胶体金、荧 光素；大分子如蛋白酶、抗原/体、荧 光蛋白等 直接标记法：A+E 改良过碘酸钠法、戊二醛法
间接标记法：A+B+E
2、直接标记法（HRP-A/SA） a.改良过碘酸钠法
b.戊二醛法
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第三节 生物素和亲和素 系统的技术方法
特异性高、亲和力高、稳定性好、多级放大作用； 以BAS-酶免疫技术为例 一、桥联亲和素－生物素法（bridged avidin-
biotin technology,BAB法） 直接法：生物素标记在一抗上；
间接法：生物素标记在二抗上； T lymphocyte
2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成 新的标记物。
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3、生物素标记抗体（IgG）的制备 基本原理 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-
C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽 键，从而使其标记上生物素。
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4、实验流程
1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶 液；
的羧基经活化修饰 后形成的衍生物， 只有活化生物素才 能偶联各种其他生 物大分子，如蛋白 质、多糖、荧光素 等。
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生物素标记蛋白质的特点
生物素需活化后才能通过侧链与蛋白质 分子连接；
多价性-一个蛋白质分子可以被多个生物 素标记(放大效应)；
抗原、抗体标记后需保持活性不变； 多用BNHS标记抗体和中性或偏碱性的蛋 白质，BHZ标记偏酸性蛋白（抗原）
的定性和定量检测；
2、BAS与亲和层析技术 用于蛋白质纯化，为已 知配体寻找受体
基质颗粒-亲和素 （固 相）
生物素化抗体/配体（ 液相）
待分离物质（液相，含 目的抗原/配体）
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3、BAS与 亲和组织 化学技术
4、BAS与基因杂交 5、BAS与放射免疫显像 6、BAS与免疫-PCR
但与聚苯乙烯的非特异性吸附较高。
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亲和素活性单位 以亲和素结合生物素的
量来表示； 结合1μg生物素所需要
的亲合素量为1个亲合素 活性单位。一般1mg亲合 素约含13～15个活性单 位。
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链霉亲合素（streptavidin,SA） 与亲合素(A)有类似生物学特性的一种蛋白质。
由Streptomyces avidinii菌分泌的一种蛋白 质，SA分子量为65000，由4条序列相同的肽链 构成，每条SA肽链可以结合1个生物素分子。 SA与A的ka虽然相同，但在实际应用中其检测 灵敏度明显优于A。
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BAB法(直接法)检测原理示意图
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二、标记亲和素－生物素法（labelled avidin-biotin tech, LAB）
直接法
间接法
LAB法(直接法)检测原理示意图
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三、亲和素－生物素化酶复合物法（ABC）
ABC-双抗体夹心ELISA检测原理示意图
四、酶－抗酶－亲和素－生物素化酶 复合物法（PAP-ABC）
糖基化
多糖基化
无糖基化
结合生物素能力
4
4
亲和常数（K）
1015
1015
活性（U）
13～15
15～18
亲和素和链霉亲合素理化特性比较 9
第二节 生物素和亲和素 标记物的制备
一、生物素标记物的制备
1、作为标记物，活化生物素直接标记大分子生物活性 物质如抗原、抗体；
根据抗原或抗体分子所带可标记基团的类型（氨基、醛基或巯 基）以及分子的等电点
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A的高pI及高含糖结构导致在聚苯乙烯板和硝酸纤维素膜上或与组 织细胞DNA结合时，易产生一定程度的非特异性结合，造成较高的 显色背景，而SA较A在应用中明显克服了这一缺点。
亲和素（A）
链霉亲合素 (SA)
结构
四亚基
四亚基
分子量
68kD
65kDpI10来自6.0氨基酸特点
碱性氨基酸较多
酸性氨基酸较多
戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与 酶和亲和素上的氨基共价结合，形成酶-戊二 醛-免疫球蛋白结合物。
戊二醛分子式
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3、间接标记法（A/SA-B-HRP）
首先将HRP标记上生物素 再利用亲和素与生物素间的特异结合能力，合
成亲和素-生物素-HRP复合物（ABC）
注意事项：如何除去未标记物？ 各种成份的比例？
2、用0.1mg/L,pH9.0 NaHCO3溶液将纯化的1g抗体 稀释为1～2g/L;
3、按BNHS：抗体1：8 ～1：15（体积比）混合， 室温搅拌下反应2 ～4小时；
4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 ℃ 透析过夜；
5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻 存备用。