发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术

厌氧微生物的分离与培养一、实验目的熟练掌握Hungate厌氧操作技能，了解和掌握厌氧微生物的培养基配制，并进行分离纯化。

二、实验用具装有分压表的氮气钢瓶，氢气钢瓶，调压变压器，铜柱和铜柱固定架，高压灭菌锅，厌氧管（15ml）,厌氧瓶(50ml)，异丁烯橡胶塞、电炉、圆底烧瓶（500ml、1000ml）、各种规格的定量注射器（1ml、2ml，5ml），18#针头，酒精灯，酒精棉等。

三、实验操作(一)、高纯无氧N2的制备1、接通电源：把输出电压缓缓从0伏分级升到50～90伏之间（调电压的过程持续大约2-3s就可以了）。

大约20分钟后，铜柱温度能达到350℃左右（输出电压禁止长时间超过90V以上，否则会导致铜玻璃柱变形直至破裂，甚至发生安全事故）。

2、待铜柱温度升至350℃左右时，加热套触摸起来比较烫，开启氢气钢瓶并形成气流，使铜柱内的铜丝还原（反应速率很快，几秒钟见效，还原与否可以从铜丝颜色的变化看到，同时柱内会产生水蒸气，氧化铜与氢气反应所致；通氢气的时候最好打开窗户，一定熄灭操作台边上所有明火，包括酒精灯和电炉）。

3、待铜丝被氢气还原呈现纯紫铜铮亮色，同时把里面的水蒸气也排出完全后，关闭氢气钢瓶，压力表指针降为零；打开氮气钢瓶，气流大小以把针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意气流是否足够。

4、使用完毕后，先关紧氮气钢瓶，使压力表的指示针回至零位，接着关闭电源，使调压变压器调节指示回至0伏处。

(二)、无氧无菌水的配制1.将500ml一定浓度的NaCl水溶液（防止稀释时细胞涨破）沿玻璃棒倒入固定在铁架台上的1000ml圆底烧瓶中（选择合适的圆底烧瓶，水不可太满，否则水沸腾时容易溅出），最好放入几个防爆玻璃珠。

向500ml水中加入终浓度为0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5ml 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(终浓度0.5‰)。

厌氧发酵实验厌氧发酵实验是一种常用于研究微生物在无氧条件下的生长和代谢过程的实验方法。

通过控制实验条件，可以模拟厌氧环境中的微生物代谢，观察其产物生成和生物过程的变化。

本文将介绍厌氧发酵实验的步骤和相关注意事项。

一、实验材料和设备1. 实验材料：- 不同种类的厌氧菌培养液；- 用于菌液接种的培养基；- 发酵产物分析所需的试剂和设备。

2. 实验设备：- 厌氧培养罐；- 恒温恒湿箱；- 离心机；- pH计；- 显微镜等。

二、实验步骤1. 准备工作：- 清洗所有使用的玻璃器皿和设备，使其干净无菌；- 准备好所需的培养基和培养液。

2. 厌氧培养罐的准备：- 将培养基倒入培养罐中，密封好；- 使用高压蒸汽灭菌器对培养罐进行高温高压灭菌，确保培养罐内无菌。

3. 厌氧发酵实验的进行：- 取出灭菌的培养罐，用无菌培养针将厌氧菌接种到培养基中；- 将培养罐放入恒温恒湿箱中，保持适宜的温度和湿度；- 每隔一段时间，取出培养罐进行样品采集，进行产物分析。

4. 产物分析：- 将采集到的样品进行离心分离微生物细胞和发酵产物；- 对分离得到的细胞和发酵产物进行相应的化学检测和分析；- 使用显微镜观察细胞的形态和数量变化。

三、注意事项1. 实验条件的控制：- 在实验过程中，严格控制实验条件，如温度、湿度等；- 厌氧培养罐的密封性很重要，确保无氧条件的维持。

2. 操作安全：- 在进行实验操作时，需戴好实验手套和口罩，注意个人安全；- 对于产生的废液和废物，应按照规定的程序进行处理。

3. 数据记录和分析：- 在实验过程中，要准确记录各项数据和实验结果；- 对实验结果进行合理的数据分析，得出相应的结论。

结论厌氧发酵实验是一种重要的实验方法，通过该实验可以研究微生物的生长和代谢过程。

在实验过程中，需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性。

实验结果的分析和结论对于深入理解微生物的代谢机制具有重要的意义。

通过进一步的研究和应用，厌氧发酵实验可以在工业生产和环境治理等领域发挥重要作用。

厌氧发酵工艺流程厌氧发酵是一种在缺氧条件下进行的生物反应过程，通常用于生物质、有机废物和废水的处理，以及生物氢气和甲烷的产生。

在这篇文章中，我们将详细介绍厌氧发酵工艺流程，包括工艺原理、操作步骤和应用范围。

1. 工艺原理厌氧发酵是一种微生物代谢过程，通过这种过程，有机物质在缺氧条件下被微生物分解产生气体和有机酸。

这种过程一般分为四个阶段：水解、酸化、醇化和甲烷发酵。

在水解阶段，有机物质被水解成小分子有机物；在酸化阶段，这些小分子有机物被酸化成醋酸、丙酸等有机酸；在醇化阶段，有机酸被进一步分解成醇和二氧化碳；最后，在甲烷发酵阶段，醇和二氧化碳被甲烷菌发酵产生甲烷。

2. 操作步骤厌氧发酵工艺通常包括反应器、搅拌系统、温控系统、气体收集系统等设备。

操作步骤如下：（1）原料处理：将有机废物经过粉碎、均质等处理，使其适合于微生物的生长和代谢。

（2）投料：将处理好的有机废物投入反应器中，注意保持一定的固液比和适宜的pH值。

（3）密封：密封反应器，排除其中的氧气，创造缺氧条件。

（4）发酵：在适宜的温度和pH条件下，微生物开始对有机废物进行厌氧发酵，产生甲烷等气体。

（5）气体收集：收集产生的甲烷等气体，用于能源生产或其他用途。

（6）产物处理：处理反应器中的固体产物，如沉淀物或渣滓，可以进行堆肥、焚烧等处理。

3. 应用范围厌氧发酵工艺在生物质能源生产、有机废物处理和废水处理等领域有着广泛的应用。

在生物质能源生产中，厌氧发酵可以用于生产生物氢气和甲烷，这些气体可以作为清洁能源使用。

在有机废物处理和废水处理中，厌氧发酵可以将有机废物和废水中的有机物质转化为甲烷等气体，减少污染物的排放。

总之，厌氧发酵工艺是一种重要的生物技术，具有广阔的应用前景。

通过对厌氧发酵工艺流程的研究和优化，可以更好地实现有机废物的资源化利用和环境保护。

希望本文能够对厌氧发酵工艺有所了解，并为相关领域的研究和应用提供一定的参考价值。

实验室厌氧发酵方案一、引言厌氧发酵是一种在缺氧条件下进行的生物反应过程，通过微生物的代谢产生有机酸、气体和其他有用物质。

在实验室中，厌氧发酵方案广泛应用于生物能源生产、废弃物处理和生物材料合成等领域。

本文将介绍一种常见的实验室厌氧发酵方案，并探讨其应用和优化。

二、实验室厌氧发酵方案的基本步骤1. 菌种的选择和培养在实验室厌氧发酵中，菌种的选择非常重要。

常用的菌种包括产氢菌、产甲烷菌等。

菌种的培养需要在无氧条件下进行，可以使用密闭培养瓶或无氧罐来提供无氧环境。

培养基的选择应根据菌种的特性和所需产物来确定。

2. 发酵基质的准备和处理发酵基质的选择和处理对于实验室厌氧发酵方案的成功至关重要。

常见的发酵基质包括废弃物、植物生物质和纯化有机物等。

在使用废弃物作为基质时，需要对其进行预处理，如固液分离、调整酸碱度和去除抑制物质等。

3. 实验室发酵装置的设计和操作实验室厌氧发酵装置的设计和操作直接影响发酵的效果和产物的质量。

常见的实验室发酵装置包括密闭发酵罐、发酵袋和连续流动反应器等。

装置的设计应考虑气体的收集和排放、温度的控制和搅拌等因素。

4. 发酵过程的监测和控制实验室厌氧发酵过程中，对发酵过程的监测和控制是必不可少的。

常用的监测指标包括产气量、产物浓度和pH值等。

可以使用气体分析仪、液相色谱仪和pH计等仪器进行监测。

根据监测结果，可以进行相应的控制措施，如调整温度、添加营养物质等。

三、实验室厌氧发酵方案的应用1. 生物能源生产实验室厌氧发酵方案广泛应用于生物能源生产领域。

通过利用产氢菌和产甲烷菌等微生物的代谢产物，可以生产可再生能源，如氢气和甲烷。

这些能源具有高能量密度和低碳排放的特点，对于替代传统化石能源具有重要意义。

2. 废弃物处理实验室厌氧发酵方案可以用于废弃物的处理和资源化利用。

废弃物中含有丰富的有机物质，通过厌氧发酵可以将其转化为有用的产物，如甲烷和有机肥料。

这不仅可以减少废弃物的排放，还可以实现废弃物的资源化利用。

第21卷　第1期环境研究与监测2008年01月科研报告(11～13)一株厌氧发酵菌Biolog鉴定及利用不同碳源对产氢的影响刘婧1,2(1.重庆大学城市建设与环境工程学院,重庆　400045;　2.三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆　400045)摘要:从湖沼中分离出一株厌氧发酵产氢菌,利用Biolog微生物自动鉴定系统对其进行复核鉴定.鉴定结果表明:此菌株为Enterobacte r aerogenes,可能性(PROB)为99%,相似度(SIM)值为0.79,DIS值小于5.0,三个重要参数和数据库匹配良好,准确度高.该菌株为兼性厌氧菌,丙酸型发酵.利用5种不同底物测定其产氢能力,以蔗糖为底物时产氢累计总量最高达到114mL,蛋白质类不适合做发酵产氢的底物.关键词:发酵细菌;生物产氢;Biolog中图分类号:X382 文献标识码:A 文章编号:(G)08060(2008)0120011203 能源短缺、环境污染是未来人类所面临的两大难题,而改变原有的能源结构则是实施可持续发展的有效手段.研究开发环保、高效的产氢技术一直是国内外科研人员努力追求的方向,其中生物制氢[1,2]由于其使用的原料低廉,生产过程清洁、节能且不消耗矿物资源,正越来越受到人们的关注,也是目前研究进展最快并很有希望进行规模化生产的一种制氢方法.随着科学技术的发展,微生物鉴定领域和自动化分析技术有很大进步.实验目前分离培养的产氢菌株有较高的氢气产量,为了更进一步研究菌株的属性以及对碳源的利用状况和产氢的关系.实验利用Biolog全自动微生物分析鉴定仪[3]对发酵菌进行数据分析鉴定[4],和传统鉴定方法相比,自动鉴定系统过程快捷,数据可靠,数据库包含菌种广泛.对更好的研究纯菌种不同碳源代谢活性,代谢功能有重要意义,选用的5种碳源从定量角度分析菌株利用不同底物的产氢能力,为研究混合菌的代谢和产氢提供理论依据.1　实验材料和方法1.1　菌种来源本实验所用菌株为实验室内分离培养的一种厌收稿日期5223基金项目国家自然科学基金重点课题(3)作者简介刘婧,在读硕士研究方向城市建设与环境工程氧发酵产氢细菌,从环境中通过富集培养分离得到,将分离得到的单菌落扩大后用于各试验.1.2　主要仪器厌氧工作站;美国Biolog微生物自动鉴定仪;浊度仪;722型紫外分光光度计;SL12P HS23E型p H计;超净工作台;数显水浴锅等.1.3　培养基菌株鉴定培养基B UA+B:①称取25.85g B UA琼脂培养基,加入475mL蒸馏水在烧杯中,在氮气吹拂下缓慢加热并搅拌至全部溶解.②冷却后调p H值至7.2±0.1(25℃).121℃灭菌15 min,保持厌氧环境,冷却至45～50℃.③加入50 mL新鲜的脱脂羊血,摇匀,厌氧环境中倒平板;产氢发酵细菌基础培养基去掉葡萄糖碳源,由酵母膏, NaCl及微量元素溶液和维生素液组成[5].1.4　Biolog技术原理用Biolog技术进行碳源代谢分析,微生物在利用95种碳源过程中产生自由电子,与四唑盐染料发生了还原显色反应,颜色的深浅反应微生物对碳源的利用程度[6].微生物的种类和固有属性决定了对不同碳源利用程度不同,从而在鉴定板上形成该微生物特征性的“指纹”[7,8],通过读数仪来读取颜色变化,计算机通过与数据库比较,将目标微生物与数据库中的特征数据进行比对,与分析的微生物进行最大限度的匹配:200120.:021*********.:.:..1.5　实验方法1.5.1　Biolog鉴定方法碳源代谢实验按照Biolog微生物鉴定流程进行.先进行革兰氏染色和氧化酶实验,可以确定出菌株类型,按照革兰氏阴性菌Biolog鉴定参数(见表1)选择合适的培养条件.Biolog鉴定方法:将厌氧发酵菌分离纯化,在对数生长期进行平板划线,得到培养良好的单菌落,接种到BU A+B培养平板上,37℃在厌氧工作站培养24h,用无菌牙签挑取少量新鲜菌落,制成菌悬液,和标准菌悬液进行对照,误差范围小于±2,用八道移液枪进行Biolog GN板接种,每孔接种菌悬液150μL,加盖30℃培养24h,打开微孔板盖放入结果自动读数仪,显色结果与Bi2 olog数据库进行比对分析,颜色变为深紫色即为相似性在80%以上,表明对此种碳源利用很好.表1　革兰氏阴性菌Bio log系统鉴定参数Para meter s N EN T EN T(厌氧)扩大培养基BU G+B BUA+B温度/℃3037接种液G N/GP2IF GN/GP2IF+T浊度/%5261浊度标准类型GN2NEN T G N2ENT 鉴定板G N2G N2每孔菌悬液量/μL150150培养时间/h4～6,16～244-6,16～241.5.2　产氢实验方法产氢培养基分别装在体积为150mL的实验反应器中,用橡皮塞封闭,用固体石蜡密封,橡皮塞上扎入排气管和取样管,气体用排水法收集,并吸收CO2.所有器皿及培养基等均在121℃下高压灭菌20min后使用,所有操作均在无菌条件下进行,在37℃条件下培养,实验接入的菌种量总菌数为6×108个,接种量为10%,每隔12h测定一次产气量.2　实验结果与分析2.1　发酵细菌的分离纯化从湖沼环境中取出污泥悬浮液,分别做不同稀释度的菌悬液进行平板涂布,做平行实验,在厌氧工作站培养4d后,取生长良好,有40～80之间的菌落平板,挑取不同类型菌落再次接种,分离纯化数次后,镜检为纯菌株后进行各项产氢实验.菌落为乳白色圆形湿润菌,菌落表面光滑,边缘整齐,挑取时呈黏丝状,镜检为杆状菌.2.2　Biolog菌种鉴定发酵细菌进行革兰氏染色实验确定为阴性杆菌,不产芽孢.氧化酶实验为阴性并形成较大菌落,则为G N2EN T.菌株在培养4～6h已经有部分碳源发生显色反应,一般16～24h的结果比较稳定.表2是厌氧培养24h对发酵细菌进行Biolog鉴定后计算机读取数据、按照可能性大小给出的10个I D的名称.表2　菌种鉴定结果序号Species PROB SIM DIS T YPE 1Entero bacter aerogenes990.79 3.36G N-EN T 2Se rratia ficaria30.02 6.91G N-EN T 3Ser ratia r ubidaea00.008.25G N-EN T 4Ente ro bacter a sburiae00.009.53G N-EN T 5Kle bsiella pneumoniae ss p neumoniae00.0010.30G N-EN T 6Enterobacter cloacae00.0010.46G N-EN T 7Ser ratia liquef aciens/grime sii00.0010.91G N-EN T 8Pantoea agglomerans00.0010.97G N-EN T 9Ente robacter aeroge nes(Kle b.mobilis)00.0011.10G N-EN T 10Raoultella pla nticola00.0011.11G N-EN T 通过以上数据可以看到:SIM值=0.79>0. 75;DIS值=3.36<5.0;PROB为99%.系统得到的三个重要参数比较理想,与数据库匹配良好,SIM 值越接近,说明鉴定结果的可靠性更高在I D 地址栏显示出一个最佳匹配名称,属名2 ,种名,是一株产气肠杆菌,其他种在名称栏里列出作为参考.菌种鉴定出阳性反应64种,阴性反应25种,边界反应7种.阳性反应表示目标菌株和数据库的匹配程度≥80%,阴性反应表示样品菌与数据库匹配程度≤%,边界反应多于5个为鉴定结果不好,实验中为,并且第一个和第二个ID的DIS值大于,各种数据指标都表21环境研究与监测第21卷1.00.:Ent er obact er:aerogenes920 172.0明,鉴定结果准确,和数据库有很好的匹配.2.3　利用不同碳源的产氢能力根据代谢微平板对照相应碳源,从中选择出Ente robacter aerogenes能够利用的4种碳源和一种蛋白质比较,以葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、蛋白胨底物为代表,研究不同种类底物对厌氧发酵产氢的影响,其中葡萄糖、蔗糖、乳糖代表简单的碳水化合物,淀粉代表复杂的碳水化合物,蛋白胨代表蛋白质不同种类底物厌氧发酵在生长过程中的产氢曲线见图1.图1　E.aer og enes利用不同碳源的产氢量从图1中可以看出,葡萄糖、蔗糖、乳糖都是E. aeroge nes很好的产氢底物,最大累计产氢量分别为99、114和78mL,淀粉氢气产量为32mL,蛋白胨没有氢气产生,不适合做厌氧发酵产氢细菌底物.所以,对于厌氧发酵细菌产氢,简单碳水化合物和比较复杂的碳水化合物都是良好的碳源.而蛋白质等复杂的碳水化合物不适合做产氢底物.需要其他酶和微生物的催化分解作用下,才可以被利用来产氢.Eaerogenes属于兼性厌氧菌,进行丙酸型发酵,同时也产生乙酸、乙醇、丁酸等产物.在兼性厌氧的条件下,能够获得优势生态位,进行发酵产氢.五种常规底物产氢实验结果和Biolog鉴定过程中对碳源利用状况相吻合.而不同碳源所表现的产氢差异主要是由于碳源是以不同方式进入光合细菌内部代谢过程的,并且在厌氧条件下作为供氢体形成H+的能力不同,而H+积累所形成的还原力吸收光激活的电子直接导致了氢分子的释放,从而会影响光合细菌的产氢活性[9].3　结论与传统鉴定方法相比,Biolog自动微生物鉴定系统快速、便捷、有效,在微生物鉴定技术上是一项很大的进步,由于其数据库范围广,包含全面,为广大的微生物工作者提供了方向性指导.同时要获得准确的鉴定结果,实验过程中的每一步都需要熟练掌握,严格按照操作规程进行,尤其重要的是菌种的分离纯化、细菌数量和活性、样品预处理、严格无菌环境、与标准菌液一致的浓度范围和均匀性、培养温度和时间都是鉴定成功的保证.对实验室在厌氧状态条件下分离纯化的发酵细菌进行鉴定结果为Ent erobacte r aerogenes,根据产氢实验,这种菌具有很好的产氢能力,并且根据Bi2 olog2GN板对应碳源选出4种常规碳源和一种蛋白质作为生长产氢底物,在温度37℃,p H为7.0,以氩气维持厌氧环境,进行产氢实验.菌株Enter2 obacter aerogenes以蔗糖为底物时产氢累计总量最大,达到了114mL.主要进行丙酸型发酵,为兼性厌氧菌.进一步研究Ent erobacte r aerogenes代谢途径和代谢方式,为混合培养产氢菌的生长,混合代谢模式和途径,生理生化特性奠定了基础.参考文献:[1]　许冬生.纤维素衍生物[M].北京:化学工业出版社,2001.141～142.[2]　Landoll Leo M.Modi fi ed no nionic cel lulo se et hers[P].US:4228277,1980210214.[3]　Biolog公司网页:www.biolo g.co m[EB/OL].[4]　Garland J L,Mill s A L.Clas s ificat ion and characterizatio n ofhet erot rop hic m i crobial co mmuniti es o n t he bas i s of p at t ernsof co mmu ni ty2level s ol e2carbon2source ut ilizat ion[J].ApplEnvi ro n Microbiol,1991,57(8):2351～2359.[5]　林明,任南琪,马汐平.产氢发酵细菌培养基的选择和改进[J].哈尔滨工业大学学报,2003,35(4):398～402.[6]　B ochner B R.S l eut hi ng out bact eri al i dent it ies[J].Nat ure,1989,399:157～158.[7]　Bochner B.ASM News.1989,55:536～539.[8]　Mill er J M,Rhoden D L.Jo urnal of C li nical Mi crobiology,1991,29:1143～1147.[9]　Barbara R,Sharak Gent hner,J udy D.Wall Amm o niym up2t ake i n R ho dop seu do m o nas capulat a[J].Arch Microbiol,1985,141:219～224.31第1期刘婧:一株厌氧发酵菌Biolog鉴定及利用不同碳源对产氢的影响。

厌氧发酵产氢的研究进展作者：屈佳玉来源：《北方环境》2013年第01期摘要：厌氧发酵产氢具有很多优越性，发展潜力巨大，具有高效、节能、成本低等优点。

全文介绍了国内外发酵产氢的研究情况，厌氧发酵产氢的影响因素。

并提出了厌氧发酵产氢的发展趋势。

关键词：厌氧发酵产氢；污泥发酵；微生物发酵目前，人们在对新能源的研究中，清洁、高效、廉价的氢一直是研究者所追求的目标。

氢是一种理想的清洁能源，它的热值高，最高达3042eal/m3，热转化率也很高，而且能量密度很高，是普通汽油的3倍，这意味着燃料的自重可减轻2/3。

制氢技术主要有物化法和生物法，物化法包括水电解法、甲烷裂化法和水煤气转化法等；生物制氢主要有光合制氢和厌氧发酵制氢。

物化法存在着耗能大、效率低等问题，生物制氢技术与之相比，具有清洁、节能和不消耗矿物资源等突出优点。

生物制氢的方法包括光合生物制氢及厌氧发酵制氢，生物制氢中提供充分的光能是光合微生物产氢的必要条件，由于光的穿透能力有限，若要提供足够的光源需要消耗大量的能源，光源的维护与管理十分复杂，并且所占空间较大，使得实现产业化的氢气生产难度很大。

与光合生物法制氢相比，厌氧发酵制氢在很多方面表现出更多的优越性：（1）发酵法生物制氢无需光源，可以实现持续稳定产氢；（2）发酵产氢菌种的产氢能力耍高于光合产氢菌种，而且发酵产氢细菌的生长速率一般比光合产氢细菌要快；（3）可生物降解的工农业有机废料都可能成为发酵法生物制氢生产的原料，来源广且成本低廉。

可见，厌氧发酵制氢更具有发展潜力，是更理想的制氢方法。

1 厌氧发酵制氢的研究进展纵观国内外，现有的厌氧发酵产氢的主要研究成果及发展方向包括：（1）利用污泥厌氧发酵产氢；（2）高效产氢菌种发酵产氢。

1.1 污泥厌氧发酵产氯培养产氢污泥是进行厌氧发酵产氢试验研究的基础和关键。

污泥是多种微生物的混合体，既有产氢微生物又有嗜氢微生物。

在厌氧发酵过程中，产氢微生物所产生的氢气会迅速为嗜氢微生物所利用。

收稿日期：2014－10－28基金项目：深圳市科技计划项目资助（JSE201109160056A ，CXB201105100085A ，CXB201111240110A ）作者简介：孙立红（1988—），女，河北保定人，硕士研究生，研究方向：纤维素类生物质厌氧发酵产氢。

通讯作者：陶虎春（1974—），副教授。

厌氧发酵过程中产氢菌源的预处理方法及其影响因素孙立红，李金波，陶虎春（北京大学深圳研究生院环境与能源学院，深圳市重金属污染控制与资源化重点实验室，广东深圳518055）摘要：厌氧发酵制氢可利用包括工农业废弃物在内的多种有机物作为基质产生氢气。

其优点是耗能少，成本低廉，有巨大的应用前景和发展潜力。

但在实际应用中，存在着基质利用率较低、发酵产氢微生物不易获得和培养等问题。

本文综述了厌氧发酵产氢过程中的混合菌筛选技术，比较了不同的预处理方法，包括物理处理（热处理、微波，超声，紫外、冷冻解冻、曝气处理）、化学处理（酸碱处理、化学试剂）和电处理等，但是，不同的预处理方法中仍存在不同的缺陷，在此基础上对厌氧发酵产氢的预处理过程提供了全新的发展方向。

除了菌源的预处理之外，影响厌氧发酵过程的因素还有很多，例如pH 值、温度、水力停留时间、Fe 2+浓度以及C /N /P 比例等，本文逐一介绍了这些因素对厌氧发酵过程中的影响。

关键词：厌氧发酵；产氢菌；预处理；影响因素中图分类号：TQ116．2文献标识码：A文章编号：1008－021X （2015）01－0022－08Pretreatments Methods on Hydrogenogens of Anaerobic Fermentation and Its Influcing FactorsSun Lihong ，Li Jinbo ，Tao Huchun（Shenzhen Key Laboratory for Heavy Metal Pollution Control and Ｒeutilization ，School of Environment and Energy ，Peking University Shenzhen Graduate School ，Shenzhen518055，China ）Abstract ：Microorganisms can make use of many kinds of organic materials including industrial and agricultural wastes to produce hydrogen through anaerobic fermentation．The process is thought to have a tremendous application prospect and a good development potential for its little energy input and low cost．Whereas there some problems for an application goal ，such as low degradation rate of substrate and difficulty to cultivate hydrogenogens of anaerobic fermentation．This paper summarizes technologies of screening hydrogenogens from mixed inoculums of the anaerobic fermentation ，and makes a comparison among different methods ，including physical pretreatments （heat ，microwave ，sonication ，ultraviolet ，freezing and thawing ，aeration ），chemical pretreatments （acid and base ，chemical reagents ）and electricity pretreatments．But each method has its own disadvantages ，so in the end ，the development direction of the screening technologies is discussed．Besides the pretreatment methods ，this artcle summaries the factors influcing the biohydrogen production such as pH ，temperature ，hydraulic retention time ，ferrous iron concentration ，ratio of C /N /P and so on．Key words ：anaerobic fermentation ；hydrogenogens ；pretreatment ；influcing factor 随着人类对能源的需求日益增加，煤炭、石油和天然气等不可再生的化石能源被快速消耗，为了实现经济和社会的可持续发展，需要寻求经济、清洁、可再生的能源。

实验室厌氧发酵方案
实验室厌氧发酵是一种重要的生物学实验手段，可以用于探究微生物代谢途径，了解生物发酵过程以及制备有用的代谢产物等。

以下是一份实验室厌氧发酵方案，供参考：
实验材料：
- 厌氧菌培养物
- 培养基液
- 发酵罐或培养瓶
- 气密性盖子或塞子
- 气体容器和压力计（用于测定发酵产物的气体产量）
- 厌氧处理设备（如封闭式抽滤器等）
实验步骤：
1. 制备培养基液，并在实验室内静置一段时间，以使其达到室温。

2. 将预处理好的厌氧菌培养物接入培养基液中，根据菌株特性选择合适的培养条件，如温度、pH等。

3. 将培养液转移至发酵罐或培养瓶中，盖上气密性盖子或塞子，封闭容器。

4. 在厌氧环境下，进行发酵过程。

可在发酵过程中采集样品，分析发酵液的成分变化。

5. 监测并记录发酵产物的气体产量，以了解发酵过程中气体的生成情况。

6. 在发酵结束后，开启发酵罐或培养瓶，取出发酵产物进行分析和检测。

注意事项：
1. 实验过程需要保持尽可能的无氧条件，避免外来氧气进入发酵液中。

2. 实验中需测量并记录发酵产物的气体产量，以便后续分析和计算。

3. 实验中涉及到的厌氧菌种类和培养条件需根据实验目的和实验室设备进行选择和调整。

4. 实验结束后，需及时清理实验室设备和消毒培养器具，避免交叉污染。

污水厂剩余污泥水解及其厌氧发酵产氢技术研究引言随着城市人口的增加和经济的发展，污水厂处理的废水量也不断增加。

处理污水生成的剩余污泥成为一个重要的环境问题。

目前，大多数污水处理厂将剩余污泥堆填或填埋，给环境带来了很大的负担。

因此，开发有效利用剩余污泥的方法已成为亟待解决的问题。

本文将探讨一种新技术，即污水厂剩余污泥的水解和厌氧发酵产氢技术。

一、污水厂剩余污泥的水解过程1. 水解原理水解是将有机物分解为小分子有机物或无机物的过程。

在剩余污泥的水解过程中，主要通过催化剂和微生物的作用将复杂的有机物分解成简单的有机物。

2. 水解反应机制水解反应主要分为两个步骤：底物降解和生成氢。

底物降解是指水解细菌通过酶的作用将复杂的有机物分解成简单的有机酸等。

生成氢是指水解细菌通过代谢过程将有机酸等转化为氢气。

3. 影响水解反应的因素水解反应的速率受到温度、pH值、底物浓度、微生物种类和催化剂等因素的影响。

二、厌氧发酵产氢技术1. 厌氧发酵产氢原理厌氧发酵产氢是一种微生物代谢过程，通过厌氧发酵作用将有机废弃物转化为氢气。

其中，水解是转化过程的前期，生成氢是转化过程的后期。

2. 厌氧发酵产氢反应机制厌氧发酵产氢反应主要通过厌氧细菌的代谢过程来实现。

在不同的环境条件下，具有产氢能力的细菌被优先选择，并通过产氢酶将底物转化为氢气。

3. 影响厌氧发酵产氢的因素温度、pH值、底物浓度、颗粒污泥的灰分等因素都对厌氧发酵产氢有着重要影响。

三、污泥水解及其厌氧发酵产氢技术应用1. 增加底物浓度在剩余污泥的处理过程中，可以通过增加底物浓度来提高水解和发酵产氢的效果。

但过高的底物浓度可能导致微生物活性下降。

2. 优化环境条件适宜的温度和pH值是促使水解和发酵反应的关键。

适当的环境条件可以提高底物的降解效率和产氢气体量。

3. 选择合适的催化剂催化剂的选择对剩余污泥的水解和发酵产氢过程具有重要影响。

不同催化剂有不同的催化效果和适应性。

结论污水厂剩余污泥的水解和厌氧发酵产氢技术是一种有效利用剩余污泥的方法。

产气肠杆菌厌氧发酵产氢工艺实验张全国;赫倚风;胡建军;王毅;刘瑞【摘要】以产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)为纯菌种,葡萄糖(G)为发酵底物,分别选取25、30、35、38℃的发酵温度,初始pH值为3.5、4.5、5.5、6.5的酸碱度,葡萄糖与蛋白酶消化物的质量比为2、3、6的碳氮比的实验条件进行厌氧发酵产氢工艺及其代谢调控途径的实验.实验结果表明,产气肠杆菌具有一定的耐酸性,耐酸范围为pH值4.5 ～7.0;不同工艺条件下产气肠杆菌发酵产氢的周期在68～156 h之间.产气肠杆菌发酵产氢周期最短为68 h的最优化发酵工艺条件为温度35℃、pH值6.5、碳氮质量比3,其氢气产率达261.5 mL/g,氢气转化率为2.1 mol/mol.【期刊名称】《农业机械学报》【年(卷),期】2014(045)002【总页数】6页(P176-181)【关键词】生物制氢;产气肠杆菌;厌氧发酵;工艺优化【作者】张全国;赫倚风;胡建军;王毅;刘瑞【作者单位】河南农业大学农业部可再生能源新材料与装备重点实验室,郑州450002;河南农业大学农业部可再生能源新材料与装备重点实验室,郑州450002;河南农业大学农业部可再生能源新材料与装备重点实验室,郑州450002;河南农业大学农业部可再生能源新材料与装备重点实验室,郑州450002;河南农业大学农业部可再生能源新材料与装备重点实验室,郑州450002【正文语种】中文【中图分类】TK91;TK6引言氢气，因其可再生性、燃烧清洁且能量密度高（是烃燃料2.75倍以上）［1］，被认为是一种可行的替代燃料［2］。

然而，氢气作为燃料也面临着制氢成本高的难题；造成生物制氢成本高的原因主要是原料转化率低，使实现规模化制氢还有一段距离［3］。

近年来，生物制氢研究主要集中在厌氧发酵制氢和光合发酵制氢方向［4－6］。

Favaro等研究了城市垃圾中不同有机废物的产氢特性［7］，任南琪等对厌氧发酵制氢进行了研究［8］，张全国等则对光合细菌发酵制氢开展了大量的研究［9－11］，这些多是基于活性污泥富集菌群的研究，纯菌种因自身可利用底物单一等原因被学者忽略，有关研究相对较少，Hu等研究了巴氏梭菌等4种厌氧菌纯培养产氢的特性［12］。

厌氧发酵原理及其工艺厌氧发酵原理及其工艺1.4 实验研究目的，技术路线我国目前的农作物发酵制沼气技术与发达国家相比,起步较晚,大型项目的运行经验相对较少。

由于我国幅员辽阔,不同地域的农作物资源种类不同,其物理和化学性质也有较大的差别,加之我国不同地区年平均气温差别较大,使我国农作物厌氧发酵制备沼气的大型项目难有统一的设计参数标准。

对于不同的大型沼气项目,必须结合项目实际的农作物种类和物性、气候条件、供热条件、沼液和沼渔的消纳和后续处理工艺、农作物的价格和最大运输半径、原料的储存和供料方式、发电机组的选型等因素进行综合考虑,才能使项目实施后获得最佳的经济和社会效益。

根据我国农作物制备沼气技术的应用现状,结合本文研究的农作物制备沼气项目实际案例,本文的研究目的为:;研究发酵原料的物理化学性质和产气率,提出合理估算农作物（主要是黄瓜藤）和粒径的方法,为项目实例提供工艺选择、系统设计和经济性计算提供可靠依据。

为了实现上述目的,本文研究内容主要集中如下几个方面:（1）研究农作物破碎预处理的特点,为合理计算破碎预处理能耗提供计算方法。

（2）研究了黄瓜藤的鲜活度对发酵产气量和产气速率等因素的影响。

（3）不同投配率对发酵产气量和产气速率等因素的影响；为了厌氧发酵反应的持续反应，同时还研究不同投配率对于pH值的影响。

1.5 论文章节安排本论文共包括六章内容。

第一章介绍课题的研究背景，国内能源消费和可再生能源利用现状，以及课题的主要研究内容和意义。

第二章厌氧发酵反应制备沼气的基本原理和影响参数。

第三章阐述农作物的破碎原理，从中说明粒度与能耗间的关系，并且从能耗的角度分析不同粒度的颗粒的耗能情况。

第四章针对需要采用实验方法对各个因素进行研究，确定实验的数据测量的方法以及实验进行过程中需要的注意事项，防止实验失败。

第五章实验采用定制CSTR厌氧反应器对黄瓜藤在中温条件下进行厌氧消化反应实验，研究系统的稳定性能和产气性能。

第1篇一、实验目的1. 了解厌氧发酵的基本原理和过程。

2. 掌握厌氧发酵实验的操作步骤。

3. 分析实验结果，探讨影响厌氧发酵的因素。

二、实验原理厌氧发酵是指在没有氧气或氧气浓度极低的条件下，有机物质在微生物的作用下分解产生甲烷、二氧化碳和水等物质的过程。

本实验主要研究厌氧发酵过程中，有机物分解产甲烷的规律。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：人粪尿、秸秆、猪粪、牛粪、自来水、接种物（如厌氧菌种）等。

2. 实验仪器：厌氧发酵装置、温度计、pH计、取样器、显微镜等。

四、实验步骤1. 原料准备：将人粪尿、秸秆、猪粪、牛粪等有机物质按一定比例混合，加入自来水搅拌均匀，调节pH值至6.8～7.2。

2. 接种：将厌氧菌种按一定比例接种到混合原料中。

3. 厌氧发酵：将接种后的原料倒入厌氧发酵装置中，密封好，控制温度在37～40℃。

4. 取样分析：定期取样，测定甲烷产量、pH值、温度等指标。

5. 观察记录：观察发酵过程中的现象，如气泡产生、颜色变化等。

6. 数据分析：根据实验数据，分析影响厌氧发酵的因素，探讨优化发酵条件。

五、实验结果与分析1. 甲烷产量：实验结果表明，厌氧发酵过程中，甲烷产量随着发酵时间的延长而增加。

在第15天时，甲烷产量达到峰值，随后逐渐下降。

2. pH值：发酵过程中，pH值逐渐降低，说明发酵过程中产生了酸性物质。

3. 温度：发酵过程中，温度保持在37～40℃范围内，有利于厌氧微生物的生长和代谢。

4. 影响因素：（1）原料配比：不同原料的碳氮比、水分含量等对甲烷产量有显著影响。

本实验中，人粪尿与秸秆的配比为1:1时，甲烷产量较高。

（2）接种量：接种量过大或过小都会影响甲烷产量。

本实验中，接种量为原料的1%时，甲烷产量较好。

（3）温度：发酵温度对甲烷产量有显著影响。

本实验中，37～40℃的温度有利于甲烷产生。

六、结论1. 厌氧发酵是一种有效的有机物质处理方法，能够将有机废物转化为可利用的甲烷气体。

产氢厌氧细菌的分离筛选及其产氢效能评价本研究从牛的瘤胃、瓣胃和皱胃,污水处理厂生物池进口处、生物池内取样,利用划线法分离筛选出厌氧细菌；采用吲哚试验、氧化酶试验和点滴试验、16SrDNA测序等技术对分离细菌进行鉴定；利用摇瓶培养方法测定细菌的生长曲线；自行研制厌氧流化床生物反应器；最后将分离鉴定的细菌分别放入自行研制反应器中进行发酵产氢效能评价。

具体研究结果如下：1.从牛的瘤胃、瓣胃和皱胃中共分离到三株厌氧细菌。

生理生化鉴定结果显示,三株厌氧细菌吲哚试验均呈阳性,氧化酶试验呈阴性,点滴试验呈阴性；16SrDNA测序结果显示,三株厌氧细菌的16srDNA序列的相似性在99%以上,属同一种兼性厌氧细菌——肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)。

2.在污水处理厂生物池进口污泥中、生物池内各分离到一株厌氧细菌。

生理生化鉴定结果显示,两株厌氧细菌吲哚试验均呈阳性,氧化酶试验呈阴性,点滴试验呈阳性；16srDNA测序结果显示,两株厌氧细菌的16srDNA序列的相似性在99%以上,属同一种兼性厌氧细菌——大肠杆菌(Escherichia coli)。

3.分离筛选到的两株厌氧细菌的生长曲线测定结果表明,肺炎克雷伯菌的对数生长期为1-8h,稳定期为8-14h,14h之后进入衰亡期；大肠杆菌的对数生长期为1-4h,稳定期为4-14h,14h之后进入衰亡期。

两株厌氧细菌的对数生长期和稳定期略有差别,但是衰亡期开始的时间是相同的。

4.自行研制厌氧流化床生物反应器,摆脱了实验室小型产氢装置的局限性,可以在较大规模下用细菌循环利用原料产氢；能保证较好的厌氧环境,较恒定的温度,为厌氧发酵产氢提供稳定的工作环境；能将秸秆原料直接投入到反应器中供养细菌产氢,简单易行。

5.以蔗糖作为诱导物质,以甜高粱秸秆为主要原料,在自行研制的厌氧流化床生物反应器中测定分离细菌的产氢效能。

结果显示,两株细菌不仅有产氢能力,并可在反应器的活性炭上形成白色细菌颗粒。

污水厂剩余污泥水解及其厌氧发酵产氢技术研究污水厂剩余污泥水解及其厌氧发酵产氢技术研究引言：随着城市化进程的不断加快，污水排放量不断增加，给环境带来了严重的污染问题。

传统的污水处理工艺往往依靠化学物理方法对污水进行处理，但这种方法造成的剩余污泥处理却给环境带来了新的问题。

剩余污泥处理通常是通过厌氧消化、堆肥和焚烧等方式进行，但这些方法存在能源浪费、污染排放和占地过多等问题。

近年来，研究人员开始关注污水厂剩余污泥中的潜在能源——生物质能。

水解发酵技术作为生物质能转化的关键环节，能够将污泥中的有机物以有机酸为主进行分解，进一步转化为氢气、甲烷等可再生能源，并产生有机肥料。

因此，研究污水厂剩余污泥水解及其厌氧发酵产氢技术具有重要的理论和实践意义。

一、剩余污泥的特性及水解机理剩余污泥主要由固体、水分和有机物组成，其中有机物含量较高。

水解是将有机物通过生物分解等方式进行分解转化的过程。

剩余污泥水解主要受到微生物的影响，通过微生物的代谢活动，将有机物分解为有机酸、氨氮等溶解性物质。

水解的主要机理可以分为两种：酸型和碱型。

在酸型水解中，水解产物主要是挥发性脂肪酸、醇类和氨氮等，反应产生大量的氢气。

而在碱型水解中，水解产物主要是脂肪酸和醇类，反应产生较少的氢气。

二、厌氧发酵产氢的技术原理厌氧发酵产氢是利用厌氧发酵微生物将有机物转化为氢气的过程。

厌氧发酵产氢技术主要包括两个步骤：水解和产氢。

水解是将剩余污泥中的有机物经由微生物作用分解为有机酸和其他溶解性物质，并同时释放出氧化还原等能量。

水解过程需保持中性或微酸性的条件，并通过调节温度、搅拌等措施促进微生物的活性和有机物的水解。

产氢是水解产物中的有机酸通过厌氧发酵微生物转化为氢气。

产氢过程需要在无氧状态下进行，适宜的温度和pH值可以提高产氢的效果。

厌氧发酵产氢技术的关键是选择适宜的发酵菌群，并通过调节温度、pH值、氢气浓度等参数，促进微生物的生长和产氢。

三、污水厂剩余污泥水解及产氢技术在实践中的应用许多研究表明，污水厂剩余污泥经水解处理后可有效产生氢气并降解有机物。