生物大分子分离技术研究进展

关于生物大分子分离技术的研究进展汇报

摘要：生物大分子的分离纯化成本一般占整个生产过程的50-90％以上，如何通分离纯化手段快速、高效地获得目标产物并降低生产成本是生物分离技术研究的一个重要课题。本文对现阶段有关生物大分子的分离技术进行适当总结并加以相关赘述，旨在了解当前关于生物大分子分离技术的研究进展情况。

关键词：生物大分子；分离；进展

一、引言

21世纪是生物工程技术占主导地位的时代，而生化分离是生物工程技术转化为生产力过程中必不可少的重要环节。随着生物工程与生命科学的发展，对蛋白质等生物大分子纯化分离提出了越来越高的要求，由于生物工程技术特别是细胞工程、基因工程、蛋白质工程等技术产品的特殊性，要求分离技术既具有较高的分离效率又不影响产品的生物活性，即要求获得高活性、高纯度的蛋白质。近十年来，随着生命科学、生物技术和制药工业的迅速发展，对于多肽、蛋白质、酶等活性生物大分子的分离与纯化要求日益提高，这类分子通常来自天然产物或发酵液中，其初始浓度一般较低，而且对温度、pH值、剪切力、有机溶剂等非常敏感，易于失活或降解。对于这类分子的高效分离与提纯，是生物工程下游技术的关键性问题之一。

生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸（DNA和RNA）以及多糖等。生命科学的发展给生物大分子分离技术提出了新的要求。各种生化、分子研究都要求得到纯的，以及结构和活性完整的生物大分子样品，这就使得其分离技术在各项研究中起着举足轻重的作用。

生物大分子的制备具有如下主要特点：生物材料的组成极其复杂；许多生物大分子在生物材料中的含量极微。分离纯化的步骤繁多，流程长；许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境就极易失活（因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处）；生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。这些都要求生物大分子的分离技术以此为依据，突破这些难点，优化分离程序，以获得符合要求的生物大分子样品。

二、传统分离方法

溶剂萃取法：是用一种溶剂将产物自另一种溶剂（如水）中提取出来，以达到浓缩和提纯的目的，是20世纪40年代兴起的一项化工分离技术，并很快应用到了生物分子的提取和分离上。最初是用于抗生素、有机酸、维生素等生物小分子的提取。最近几十年来随着与其它技术的结合而产生了一系列新的分离技术，如逆胶束萃取、超临界萃取、液膜萃取等，可以用于生物大分子如核酸、蛋白质、多肽等的提取和精制。

透析：已成为生物化学实验中最简便最常用的分离纯化技术之一，在生物大分子的制备过程中，除盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术，同时半透膜的材料也更加多样化、透析方式也更加丰富。

超滤：是一种加压膜分离技术，自20世纪20年代问世后，直至60年代以来其发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤作为一种高效分离技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子的脱盐、浓缩和分级分离。

盐析法：使蛋白质沉淀出来已有80多年的历史。其突出的优点是成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。该法虽然分辨能力不高，但在粗级分离中仍然被经常采用。

有机溶剂沉淀法：也是较早使用的沉淀方法之一。有机溶剂对于许多蛋白质、核酸、多糖和小分子生化物质都能产生沉淀作用。其引起沉淀的主要原因在于改变介质的介电常数。以及类似盐析的争夺水化水现象。

等电点沉淀法：利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离，此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。非离子型多聚物是20世纪60年代发展起来的一类重要的沉淀剂。它们具有很强的亲水性和较大的溶解度。在溶液中可通过空间位置排斥作用使生物大分子、病毒和细菌等聚集沉淀。该法温和的操作条件和较高的沉淀效能，使得其经常被用于细菌、病毒、核酸和蛋白质的分离，其中应用最多的多聚物是聚乙二醇。

三、现代分离方法

1 色谱技术

又称为层析技术，因其具有多种不同的分离机理，设备简单、便于自动化控制等特点，是目前生化分离分析中最常用的技术之一，在生物工程下游处理中占有主要的地位。传统的色谱柱是管式结构，流体在色谱柱内以轴向从一端流向柱的另一端，色谱填料是软的或硬的多孔颗粒填料，这类色谱柱具有分离效率高，柱容量大的特点，但存在着以下缺点：流速慢，生产效率低，蛋白质在长时间分离过程中易变性失活；压降大，对分离系 要求高；不易放大，在放大规模时，需要适级摸索分离条件，这是大规模分离纯化突出困难之一，因此迫切需要发展出新的色谱技术为解决。

液相色谱法：是分析化学中发展最快，应用最广的分析方法，它在许多领域成为必不可少的手段，其中高效液相色谱HPLC更是以其独特的优点占据突出地位。HPLC是目前最通用、最有力和最多能的层析形式，在生物大分子的分离分析中，HPLC分离模式主要有反相色谱RPC，空间排阻色谱SEC，离子交换色谱IEC，疏水作用色谱HIC，亲和色谱AC等。

反相液相色谱柱：效高、分离能力强、重复性好、操作简便、保留机理清楚，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种。反相色谱常使用高挥发性的流动相，例如三氟醋酸水溶液一三氟醋酸乙睛水溶液的梯度洗脱系统。由于蛋白质的疏水基团有差异，具有疏水能力的填料通过与不同蛋白质的疏水基团相互作用而选择性地进行蛋白分离。现在反相HPLC固定相的设计和改良有了很大进展工。

另外，反相离子：对色谱也可用于蛋白质的分离。由于蛋白质在一定pH值下可电离成离子性化合物，因此从理论上讲这类化合物如在上述反相色谱中无保留，都可用离子对色谱法进行分离。它与多数其它形式的层析不同之处在于固定相基本上是惰性的。固定相与被分离物之间只可能有疏水作用。它吸引人的地方在于流动相的小小变化，例如加入盐，改变pH或有机溶剂的量就能成功地影响分离特性。

空间排阻色谱：所用的固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质凝胶，是按溶质分子大小进行分离的色谱技术。又称尺寸排阻色谱或凝胶色谱。按流动相类型不同分为凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱。十多年来该法在凝胶制备，仪器技术性能，数据处理和理论研究上取得的进展，促进了该技术在许多领域的应用。

离子交换色谱：成为一种重要的分离工具，它以水为溶剂的缓冲液为流动相，以离子交换树脂为固定相，由于蛋白质的电荷性及不同树脂表面带不同电荷，根据不同溶质与树脂表面作用力不同导致出柱顺序差异而达分离。离子交换色谱的填料及含盐的缓冲流动相系统类似于蛋白质稳定存在的生理条件，有利于保持生物分子的活性和构象。因此，它在解决生物学中许多难于分离的问题上起到了重大作用。随着HPLC的飞速发展。以及各种新型离子交换材料的出现，离子交换色谱在氨基酸、蛋白质、核酸、有机酸、糖类及药物等方面的应用越来越广。

亲和层析：是60年代发展起来的一种高效、快速的分离纯化技术，以其高选择性、高效率且一步得到高纯度产品的技术优势,成为纯化蛋白质的最有效的技术之一。AFC是建立在目的蛋白质与固定化配基之间特异性可逆相互作用基础上的吸附色谱，是一种利用生物大分子能够通过范德华力、疏水力、空间和静电相互作用，与配体特异、可逆地结合在一起的生物学特性，从复杂的生物样品中分离得到目标产物的液相色谱技术。亲和层析容量大，选择性强，分离效率高，且对目标产物的生物活性起到一定的保护作用。最先被用于酶的纯化，现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整细胞的纯化。

毛细管电色谱CEC：是利用电渗流或电渗流结合压力来推动流动相移动的一种液相色谱分离法。它集CE和HPLC的优势与一身。既有CE水平的高柱效，同时还具有HPLC的高选择性。近年来其应用已引起广泛关注。目前，毛细管电色谱的研究主要侧重于方法本身的完善和发展，以及与质谱等定性分析技术联用的研究开发。

凝胶色谱：(又名分子排阻色谱)由于凝胶相当于一种分子筛，小分子可以完全渗透到凝胶内部孔穴中而被滞留，中等分子可以部分地进入较大一些的孔穴中，大分子则完全不能进入孔穴中。又因蛋白质的分子量与其分子大小成线性关系，故凝胶色谱对于确定蛋白质的分子量分布以及分离纯化蛋白质是一较为理想的方法。高效凝胶色谱法测定蛋白质分子量具有快速/微量、重现性好、简便易行等优点，是一种非常实用的药品质控方法。

疏水色谱：由于其具有洗脱条件温和，不用昂贵和有毒的有机溶剂作流动相以及蛋白活性回收率高等优点，因此本法是生物工程后处理以及蛋白质药物的纯化和分析中不可缺少的一种手段。HP(高效)-HIC主要有以下3个特点：利用蛋白质和固定相的弱疏水作用，流动相从高离子强度向低离子强度洗脱，条件温和，不损伤蛋白质的生物活性；固定相刚性好，耐高压，因此可采用高效液相色谱装置，操作简单快速。分离效率高且重现性好；柱容量大，一般分析柱即可进行蛋白质的制备。 径向色谱：在原理上解决了传统色谱技术所存在的问题。众所周知，膜分离过程具有处理量大，效率好等优点，但是膜分离过程中选择性低，对样品的分辨力差，如果选用具有高选择性和分辨力的色谱填料，如离子交换或亲和色谱填料，并制成膜的形式，再结合径向流动的原理，则可做成处理量大、速度快、选择性好、分辨力高的分离技术，这就是径向膜色谱技术。

膜色谱：根据配基与目标蛋白的相互作用方式，膜色谱可分为四类：亲和膜色谱AMC，离子交换膜色谱IMC，疏水作用膜色谱HIMC，多级膜色谱MMC。膜色谱采用具有一定孔径的膜作为介质，连接配基。利用膜配基与蛋白质之间的相互作用进行分离纯化。当料液以一定流速流过膜的时候，目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合，而杂质则透过膜孔流出，待处理结束后再通过洗脱液将目标分子洗脱下来，其纯化倍数可达数百乃至上千倍。

膜色谱是目前生物大分子分离中最为有效的方法之一，其特点为：色谱填料柱中的每一片膜都相当于一个短而粗的吸附床层，膜厚相当于床层高度，当床层体积一定时，这种结构有利于在相同压降下获得更高的流速，从而提高了分离速度和处理量；膜表面的配基与液流主体间的扩散路径很短，膜介质只受表面液膜扩散及吸附动力学的影响，消除了传统色谱中占主要地位的孔扩散阻力，大大改善了传质效果，提高了配基的利用率和总的分离速度， 缩短了分离时间，一次循环操作时间一般只是普通填料柱的十分之一，提高了生产效率，并有利于保持配基和目标蛋白的生物活性；采用了膜介质，整个床层的压降大为降低，一般只用低压蠕动泵即可满足分离要求．这样既降低了设备投资和运行费用，也避免了液流与泵体直接接触，便于无菌操和防止蛋白质失活；配基修饰过的膜介质选择性与填充柱相当，在采用足够的膜堆和梯度洗脱技术之后，可以获得较高的分离纯化效果；膜介质具有良好的刚性，能够承受较高的压力．且便于进行放大。

亲和色谱：是基于目标分子(或杂质)与特异性配基之间的亲和相互作用(分子识别)选择性分离纯化生物大分子的色谱方法。利用亲和色谱提取蛋白质、抗体等生物药物或分离基因工程产物已成为一个十分活跃的研究领域。 “亲和”一般是指生物大分子之间特异性的相互作用，如酶和底物的结合或抗体与抗原的结合等；而在生物分离的范畴亲和观念越来越多地用于新 型生物分子的分离纯化。亲和配基和生物大分子之间的特异性相互作用通常包括静电相互作用、疏水相互作用、氢键、范德华力、配位键和弱共价键等。正是由于这一系列的相互作用，可利用竞争性配基进行特异性洗脱，也可采用改变pH值、离子强度和极性等非特异性洗脱方式进行洗脱。亲和色谱具有选择性好和分辨率高等诸多优势，可实现目标分子的一步分离，因此能够大幅降低纯化的时问和生产的成本。