基因工程操作原理复习提纲

专题1 基因工程基因工程，也称作DNA重组技术或DNA拼接技术或转基因技术。

是在体外对不同生物的DNA分子进行拼接,获得重组DNA，从而定向改变生物性状的技术。

基因工程的原理：基因重组一、基因工程的基本工具基因工程的基本工具包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体1.限制性核酸内切酶（也叫作限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离、提纯得到。

（2）特点：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此限制酶具有专一性。

例如：EcolR I识别的序列是GAATTC，切割位点在GA碱基之间。

（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

其中在中轴线两侧进行切割形成的是黏性末端，沿中轴线切割形成的是平末端。

2. DNA连接酶，包括E·coliDNA连接酶（从大肠杆菌内提取得到）和T4-DNA连接酶（从T4-噬菌体中提取得到）两种DNA连接酶作用：能将DNA片段连接起来，并形成磷酸二酯键。

(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：①相同点：缝合的都是磷酸二酯键。

②区别：E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶不仅能连接黏性末端也能连接平末端。

(2)DNA连接酶与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段的末端DNA连接酶是将两个DNA片段连接。

3.载体载体的功能是将目的基因运到受体细胞内。

（1）作为载体具备的条件：①能自我复制②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，供重组DNA的选择和鉴定（筛选出含有目的基因的受体细胞）。

④对受体细胞无害；（2）最常用的载体是质粒,存在于细菌拟核之外，具有自我复制能力的裸露的小型环状DN A分子。

（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒二、基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取；第二步：基因表达载体的构建第三步：将目的基因导入受体细胞；第四步：目的基因的检测与鉴定第一步：目的基因的获取1.目的基因是指：人们所需要的，能控制蛋白质的基因。

专题一基因工程1、基因工程的原理是，是在水平上进行设计和施工。

2、限制酶主要是从生物中分离纯化出来的。

3、限制酶能够识别双链DNA分子的某种，并且使每一条链中部位的两个核苷酸之间的键断开。

4、限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：和。

5、DNA连接酶可分为和两大类。

二者都缝合键，但是前者只能连接末端。

6.运载体具备的条件：①有一个至多个，以便于。

②能进行，以便于保持遗传信息的连续性。

③有特殊的，以便于。

7、基因工程中使用的载体有：、和等。

其中最常用的是。

8、质粒本质上是小型环状的。

9、基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：、、、。

10、利用PCR技术扩增目的基因的原理是11、基因工程操作程序的核心步骤是12、构建好的基因表达载体包括、、和四部分。

13、启动子是一段有特殊结构的，是识别和结合的部位，能驱动基因。

终止子也是一段有特殊结构的，位于基因的。

14、标记基因的作用：；常用的标记基因是。

15、将目的基因导入植物细胞时受体细胞既可以是也可以是。

采用最多的方法是，其次还有和等。

16、将目的基因导入动物细胞时最常用的方法是。

此方法的受体细胞必须是。

17、原核生物细胞作为基因工程受体细胞的原因是，其转化方法中要先用处理受体细胞，使其成为细胞，18、目的基因的检测与鉴定(1)首先要检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上，方法是采用技术。

(2)其次还要检测，方法是采技术。

(3)最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用。

19、探针本质上是用放射性同位素标记的含有基因的一段DNA单链。

1。

1. 基因工程概念：基因工程是一门以分子遗传学为理论基础、以分子生物学和微生物学的现代技术方法为手段的新兴交叉学科，它诞生于1973年，其发展十分迅速，新知识、新概念、新技术不断涌现，并广泛渗透到生命科学的各个领域，带动了整个生命科学的发展，是现代生物技术中的核心技术。

它为人类创造新生物开辟了新天地。

2. 基因工程的定义：基因工程是将不同来源的基因（DNA分子），按照工程学的方法进行设计，在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录、表达的操作。

基因工程又称DNA重组技术。

3. 基因工程的特点及实施条件：基因工程的最大特点是分子水平上的操作，细胞水平上的表达。

其实施包括四个必要条件：工具酶、基因、载体和受体细胞。

4. 基因工程的基本步骤：（1）分离制取带有目的基因的DNA片段；（2）DNA片段和载体DNA 在体外连接；（3）将重组DNA分子导入合适的受体细胞，并扩增繁殖；（4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的重组体克隆；（5）外源基因的表达和产物的分离纯化。

5. DNA复制的特点：（1）DNA的复制是从特定的复制起始点开始并按5’-3’的方向进行；（2）DNA 分子的半保留复制；（3）DNA分子的半不连续复制；（4）DNA分子复制是通过DNA聚合酶及各种相关酶蛋白、蛋白因子的协同有序的工作完成的；（5）DNA分子复制具有高度的精确性和准确性。

6. DNA的变性、复性与杂交：在高温、强碱及某些试剂存在的条件下，双链DNA分子氢键断裂，两条链完全分离，形成单链DNA分子，这种情况称为DNA变性。

DNA的复性是指变性DNA在适当的条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的逆转过程。

热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。

杂交的基本原理是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段按碱基互补关系形成杂交双链分子。

1.1 DNA重组技术的基本工具一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。

概念分析①基因工程技术的原理：基因重组②目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

③操作水平：DNA分子水平④操作环境：体外⑤优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物性状从结构上分析，为什么不同生物的DNA能够重组?(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。

(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。

(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。

(3)生物界共用一套遗传密码。

二、基础理论和技术的发展催生了基因工程（一）基础理论的重大突破①DNA是遗传物质的证明 1944年，艾弗里等人通过不同类型肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，艾弗里等人的工作可以说是基因工程的先导。

②DNA双螺旋结构和中心法则的确立1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。

1958年，梅赛尔松和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。

中心法则阐明了遗传信息流动的方向。

③遗传密码的破译人们认识到，自然界中从微生物到人类共用一套遗传密码，而且为基因的分离和合成等提供了理论依据。

（二）技术发明使基因工程的实施成为可能①基因转移载体的发现 1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移，这一发现为基因转移找到了一种运载工具②工具酶的发现科学家发现了多种限制酶、连接酶、逆转录酶，这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。

③DNA合成和测序技术的发明④DNA体外重组的实现⑤重组DNA表达实验的成功 1973年，博耶和科恩选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。

基因工程复习重点一、载体PTXBⅠOri 原核生物复制起点T7 promotor T7启动子是最强的启动子，指导转录起始。

Lac opterator 乳糖操纵基因，可被Lac I编码的阻遏蛋白结合抑制转录。

SD 原核生物翻译起始时核糖体的识别序列位于mRNA上MCS 多克隆位点可插入外源基因，不影响其复制。

内含多个酶切位点、如图。

Intein 内含肽CBD chitin binding domain（几丁质结合位点）可与Tag（亲和标记）结合Stop code 终止密码子Amp氨苄抗性基因可用作抗性筛选的重要标记Lac I 乳糖调控基因编码阻遏蛋白二、质粒提取原理：答：三种溶液：溶液1：50 mmol/l 葡萄糖- --维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解；25 m mol/l Tri· Cl （pH 8.0)---维持pH;10 m mol/l EDTA (pH 8.0)------螯合Ca2+, DNase 失活，保护DNA溶液2：0.2 mol/ NaOH----------核酸变性（pH>12或pH<3) (解链）1% SDS-----------------蛋白变性，裂解细胞。

溶液3：7.5 mol/L NH4AC （pH 7.6) -------沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。

其它溶液：(1)2M NH4AC------------------------------沉淀蛋白，溶解核酸；(2)异丙醇-----------------------------沉淀质粒(3)70％乙醇----------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。

(4) RNase--------------------------------除去细菌RNA过程及作用：(1) 1.5 ml 菌液，12000 rpm * 1 min, 弃上清（repeat) －－收集细菌(2)溶液1 (200 ul), 剧烈混匀－－－－－－－－－－－－－提供缓冲液(3)溶液2 (400 ul)，温柔混匀，冰中5 min;－－－－－－－裂解细胞，蛋白核酸变性(4)溶液3 (300 ul), 温柔混匀，冰中10 min;－－－－－－－质粒复性(5)13000 rpm* 5 min, 取上清；－－－－－－－－－－－－除去细菌蛋白，基因DNA(6)540 ul 异丙醇，室温10 min;－－－－－－－－－－－－沉淀质粒(7)14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－－－－－－－－除去可溶性杂质(8)100 ul 2M NH4AC(9)13000 rpm* 5 min, 取上清；(10)100 ul 异丙醇，室温10 min;(11)14000 rpm * 10 min, 弃上清；(12)70%乙醇500 ul, 14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－除去异丙醇，盐分(13)烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－除去乙醇(14)50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA(15)电泳鉴定三、连接反应答：1、总体积为10 ul ；2、16 ℃连接过夜；（为什么是16 ℃？答：连接反应包括两步一是将碱基50%连接（变性）：Tm=2（A+T）+4（G+C），一般在8℃左右。

第一章基因工程概述一、名词解释基因、基因操作、基因工程、重组DNA技术二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。

2、简述基因工程操作的理论依据。

3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。

第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶、同裂酶、同尾酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。

2、影响限制性内切酶活性的因素主要有哪些？3、影响连接反应效率的因素主要有哪些？4、大肠杆菌DNA聚合酶有哪些活性？分别简要说明其主要用途。

5、简述切口平移法标记DNA的原理。

答：首先，在Mg2+存在下利用低限量的DNase I处理双链DNA，随机产生少量切口；然后，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性在切口处向3'端平移去除核苷酸，同时，其5'→3'聚合酶活性则将切口作为引物沿5'→3'方向催化DNA合成；随着反应的进行，5'端核苷酸不断去除，3'端核苷酸不断掺入，导致切口沿着DNA合成方向移动，即切口平移。

如果在反应体系中加入标记dNTP，则这些标记dNTP将取代原有的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子。

6、简述交换（置换）法标记DNA的原理。

答：反应体系中只有一种标记的dNTP存在时，可利用大肠杆菌DNA聚合酶I或T4/T7 DNA 聚合酶的3’→5’外切酶活性从3’端降解DNA，当露出与该标记dNTP互补的碱基时，上述酶的5'→3'聚合酶活性则催化该位置发生合成反应，用标记的dNTP置换原来的核苷酸残基，产生3’端标记的DNA。

第三章基因工程的载体一、名词解释载体、质粒、噬菌体、噬菌体溶菌周期、噬菌体溶原周期、克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体、表达标签二、思考题1、简述克隆载体具备的基本条件。

2、以大肠杆菌为例，解释利用α互补筛选重组质粒的原理。

1、有关基因工程 PPT 中出现的概念术语的英文写法需掌握genetic engineering 基因工程open reading frame, ORF 开放读码框exon 外显子intron 内含子recombination 重组replication 复制transcription 转录translation 翻译expression 表达purpose gene 目的基因functional cloning 功能克隆phenotypical cloning 表型克隆differential screening 差异筛选法subtractive hybridization, SH 差减杂交法DDRT-PCR mRNA 差别显示技术representative differentiation analysis, RAD代表性差异分析suppression subtractive hybridization, SSH抑制性差减杂交mapbased gene cloning 图位克隆transposon tagging cloning 转座子标签克隆denaturation 变性anealling 退火extension 延伸polymerase chain reaction PCR 聚合酶链反应anchored PCR 锚定PCR Inverse PCR 反向PCR gene library 基因文库vector 载体restriction endonuclease 限制性内切酶ligase 连接酶intermediate expression vector 中间表达载体chimeric gene 嵌合基因disarmed vector 卸甲载体Co-integrated vector 共整合载体Cis-vector 顺式载体binary vector 双元载体trans vector 反式载体green fluorescent protein,GFP 绿色荧光蛋白Part4purpose gene 目的基因totipotency 全能性vitrification 玻璃化agrobacterium- mediated 农杆菌介导genetic transformation 基因转化leaf disc transformation 叶盘转化法DNA-Direct Introduction DNA 直接导入liposome 脂质体liposome fusion 脂质体融合法liposome injection 脂质体注射法electroporation 电穿孔法gene gun, particle gun, biolistics,biological ballstics, microprojectile 基因枪法germ line transformation 种质转化microinjection 显微注射法direct injection or macroinjection 直接注射法pollen–tube pathway 花粉管通道法Part5transgenic plant 转基因植物total DNA 植物细胞总DNA CTAB (cetyltriethylammonium bromide)十六烷基三乙基溴化铵SDS (Sodiumn-Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠gus β- 葡萄糖苷酸酶基因gfp 绿色荧光蛋白基因antigen 抗原antibody 抗体ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay):酶联免疫吸附法Part6GMOs 转基因生物gene transfer 基因逃逸via gene-deletor technology 外源基因清除male sterility 雄性不育seed sterility 种子不育marker free 无标记2、第一章绪论中关于基因工程发展历史中关于理论发现和技术发明的几个重要事件、全球转基因作物现状概况理论发现：(1)遗传物质的化学本质是DNA (Avery等，1944)(2)DNA双螺旋结构模型和半保留复制机制(Watson and Crick, 1953)(3)遗传密码的破译(Nirenberg等，1964)和“中心法则”(Crick, 1957)技术发明：(1)限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割技术(Smith和Wilcox, 1970)、(2)DNA连接酶的发现(Weiss和Richardson，1966)与DNA片段的连接(Berg和Jackson, 1972)、(3)基因工程载体的发现与应用(Cohen,1973)为基因工程技术提供了技术保障。

1．1 DNA重组技术的基本工具1．基因工程是在水平上进行设计施工的，因此又叫做技术，这种技术是在生物体外，通过体外和等技术，赋予生物新的遗传特性。

2．基因操作的工具包括基因的“剪刀”――；基因的“针线”――；基因的“运输工具”――。

3．限制酶主要来源于。

限制酶的作用特点是能够识别DNA 中，切开两个之间的。

限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：和。

4．DNA连接酶的作用是，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的。

根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：和。

5．目前基因工程中经常使用的运载体有、和。

6．质粒是一种、、独立于之外，并具有能力的DNA分子，除了存在于细菌中还存在于酵母菌等生物中。

7．作为基因进入细胞的载体，必须具备的条件是、、、、。

1．2 基因工程的基本操作程序1．基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：、、、。

2．目的基因主要是指，也可以是一些。

获取目的基因的途径有、、。

3．PCR是利用的原理，将基因的核苷酸序列加以复制，使其数目呈方式增加。

需要的前提是，扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，相应互补序列结合，然后在的作用下进行延伸，如此重复循环多次。

4．基因工程的核心是，其目的是。

5．一个基因表达载体的组成有：、、和。

6．将目的基因导入植物细胞的方法有、和。

采用最多的方法是，通过农杆菌的转化作用，就可以使进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中的上，使的遗传性状得以稳定维持和表达。

7．基因工程选取原核生物作为受体细胞的原因是由于其具有其他生物没有的一些特点，如、、等。

8．大肠杆菌常用的转化方法是：先用处理细胞，再将与此种细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

9．检测目的基因是否成功插入到转基因生物的染色体上的方法是采用，此方法使用的探针是，与检测目的基因是否转录出mRNA所用的探针。

检测目的基因是否翻译成蛋白质，检测方法是从转基因生物体内提取蛋白质，用相应的进行杂交，若有出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。

分子生物学与基因工程复习提纲第一章绪论1、分子生物学简史理论上的三大发现生物的遗传物质是DNADNA双螺旋模型遗传信息的传递方式技术上的三大发现基因操作的工具酶的发现载体的应用逆转录酶的发现2、证明遗传物质是DNA的三大经典实验肺炎双球菌转化实验噬菌体感染实验病毒重建实验3、1953年，Watson/Crick 提出了DNA双螺旋结构模型。

4、遗传信息的传递方式的发现1961 年Monod 和Jacob 提出了操纵子学说；1964 年Nirenberg 等提出了“三联体密码说”；Crick 提出了遗传信息流向和表达的中心法则。

5、限制性核酸内切酶的定义、特点以及在基因工程中的意义；DNA连接酶6、克隆载体和表达载体第二章染色体与DNA1、核酸、核苷酸、核苷、碱基、嘌呤、嘧啶、DNA、RNA、磷酸二酯键2、染色体、核小体、组蛋白、非组蛋白3、基因组大小与C值矛盾、重复序列4、真核基因组结构的特点；与原核基因组的差异5、DNA双螺旋结构的要点、氢键、碱基堆集力、A、B、Z型结构6、超螺旋结构、正/负超螺旋7、DNA复制、半保留复制、半不连续复制、冈崎片段、拓扑异构酶、Klenow片段8、真核生物DNA复制的特点9、转座、转座子、转座子的分类和共同特点、转座的遗传效应第三章RNA合成1、转录、转录泡、有义链、反义链、RNA聚合酶2、启动子、终止子、增强子、依赖ρ因子的终止、不依赖ρ因子的终止3、原核生物转录的过程4、真核生物mRNA转录后的加工5、真核生物成熟mRNA的结构特点第四章蛋白质的合成1、遗传密码、密码子、反密码子、密码子偏好性、简并性2、起始密码子：AUG 终止密码子：UAA、UAG、UGA3、错义突变、无义突变、同义突变、移码突变4、tRNA的结构：两个关键部位3ˊ端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA；与mRNA的结合部位—反密码子。

5、SD序列、反SD序列6、蛋白质合成过程（翻译的过程）7、蛋白质转运的机制、信号肽第五章基因表达调控1、基因组、管家基因、组成性表达、可诱导基因（奢侈基因）、诱导、阻遏2、操纵子、顺势作用元件、反式作用因子3、原核生物基因调控模型乳糖操纵子调控的机制：阻遏蛋白负调控以及CAP正调控色氨酸操纵子调控的机制：反馈抑制和衰减子调控4、RNA干扰、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA (miRNA)第六章基因工程的酶学基础1、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和反转录酶、DNA修饰酶、外切核酸酶、单链内切核酸酶、RNA酶2、回文序列、II型限制性内切酶、粘性末端、同工酶、同尾酶、同裂酶3、TaqDNA聚合酶的特点以及在PCR中的应用第七章基因工程载体1、载体、克隆载体、表达载体2、质粒、噬菌体、柯斯质粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体3、标记基因（报告基因）、插入失活、α-互补、蓝白斑筛选4、质粒作为基因工程载体的优点5、碱变性抽提法提取质粒的原理6、穿梭载体第八章基因操作的主要技术原理1、提取核酸的一般程序2、碱变性法提取质粒DNA的步骤3、核酸浓度与纯度测定的方法：紫外吸收4、核酸电泳：琼脂糖电泳、脉冲场凝胶电泳第九章目的基因的获取1、PCR的原理和步骤2、基因组文库、cDNA文库、鸟枪法、DNA化学合成第十章基因工程的操作过程1、表达载体的结构特征2、将目的基因导入受体：植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法动物：显微注射法微生物：化学转化法、电转化法3、重组子筛选：双抗生素法、蓝白斑筛选4、重组子鉴定：核酸分子杂交法裂解细菌电泳鉴定分子大小限制性内切酶法PCR法基因产物检测法序列分析5、Northern杂交、Southern杂交、Western Blot、Elisa（酶联免疫吸附）第十一章基因工程的应用1、植物基因工程2、动物基因工程3、基因工程药物4、基因治疗5、基因工程与环保第十二章基因工程及其产品安全性管理1、基因工程产品对人类健康的影响2、基因工程产品对生态系统的影响3、基因工程生态安全性评价的指标复习题：简答题：1、分子生物学历史上，具有重要意义的理论上和技术上的三大发现分别是什么？2、什么叫转座子？列举转座子的类型及其共同特点。

基因工程复习提纲-完善复习提纲1．什么是基因？基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。

2．基因工程的诞生基因工程诞生于1973年。

1973－1974年，美国科学家科恩等以大肠杆菌为材料，成功地进行了三次基因工程试验。

试验结果证明，用基因工程可以打破不同物种间在亿万年中形成的天然屏障，任何不同种类生物的基因都有可能通过基因工程技术而组合到一起。

人类进入了激动人心的基因工程时代。

3．基因工程的定义及三大基本元件。

定义：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。

上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

三大基本元件：限制性核酸内切酶（restriction enzymes）/DNA连接酶（ligase）/基因工程载体（vector）4．基因工程的研究内容(1) 从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段；(2) 在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子;(3) 将重组DNA分子引入（转）到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞);(4) 从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆;(5) 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出所需要的物质。

5．基因工程的技术准备及技术支撑。

技术准备技术支撑：核酸凝胶电泳技术核酸分子连接技术/细菌转化技术/DNA序列分析技术/寡核苷酸合成技术/基因定点突变技术/聚合酶链式反应（PCR）技术5．基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种基因工程在农业生产中的应用1.提高植物的光合作用效率2.提高豆科植物的固氮效率3.转基因植物4.转基因动物基因工程在工业中的应用1.纤维素的开发利用2.酿酒工业基因工程在医药上的应用1.用转基因植物或动物生产药物2.用微生物生产药物3.设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗5.基因诊断6.法医鉴定7.基因治疗基因工程在环境保护中的应用1.检测水污染2. 生物降解7．核酸酶的分类1）根据核酸底物分RNA酶（Rnase）/DNA酶（Dnase）/底物非专一性核酸酶；2）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）/外切核酸酶（exonuclease）；3) 根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）8．细菌中的防卫系统：限制与修饰现象。