重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的影响因素

利用细胞工程技术改造重组蛋白生产用CHO细胞的研究进展刘娜;袁宝珠【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】3页(P369-371)【作者】刘娜;袁宝珠【作者单位】100050 北京，中国食品药品检定研究院细胞资源保藏研究中心/卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室;100050 北京，中国食品药品检定研究院细胞资源保藏研究中心/卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室【正文语种】中文重组蛋白产品，即通过 DNA 重组技术使目的基因在相应宿主细胞中表达所获得的蛋白产品。

其中，E.coli 源的占 42%，酵母源的占 21%，中国仓鼠卵巢（Chinese hamster overy，CHO）细胞源的占 29%。

而在与治疗和预防相关的重组蛋白中，CHO 细胞源的已近 70%[1]。

CHO 细胞是在 1957年由美国科罗拉多大学Theodore T.Puck 从一成年雌性仓鼠卵巢中分离获得的，其增殖快，在体外传代上百次后仍保持增殖能力[2]。

该细胞染色体数为 22 条，性状和带型特征独特，因此早期多被用于遗传学研究。

在表达重组蛋白方面，与 E.coli、酵母菌相比，CHO 细胞具有相对完善的蛋白质翻译后修饰系统。

此外，由于生物技术发展和高产筛选方法的逐步优化，CHO 细胞已成为目前表达重组蛋白最为理想的细胞基质[3]。

然而，现阶段 CHO细胞的重组蛋白产品的产量及活性尚无法完全满足市场需求，传统的改良手段已很难再提高CHO 表达重组蛋白的能力。

而细胞工程技术，特别是基因沉默（RNAi）技术，具有提高重组蛋白产量和（或）活性的巨大潜力。

然而，在我国尚未见到利用此策略改造 CHO 细胞的报道。

本文就CHO 细胞改造，尤其是基于 RNAi 技术的改造作简要综述，为我国建立自主知识产权的细胞系奠定基础。

1 CHO 细胞生物学特性1.1 适于重组蛋白表达的生物特性CHO 细胞很少分泌内源性蛋白，但可高表达成熟的外源蛋白。

ISS N 100727626C N 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2005年4月21(2):282～286・研究简报・生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达张志谦3,　李金萍,　胡　颖(北京大学临床肿瘤学院暨北京市肿瘤防治研究所,北京　100034)Secretion of R ecombinant Proteins in Mammalian Cells Directedby G row th H ormone Signal PeptideZH ANG Zhi 2Qian 3,LI Jin 2Ping ,H U Y ing(Department o f Cell Biology ,Peking Univer sity School o f Oncology ,Beijing Institute for Cancer Research ,Beijing 100034,China )Abstract Signal peptide capable of efficiently directing many protein secretion in mammalian cells is one ofthe key elements in recombinant protein production ,gene therapy and the development of DNA vaccines.In order to explore the possibility of rat growth horm one signal peptide as such an element ,a new vector based on the mammalian expression vector pcDNA3was constructed by em ploying rat growth horm one (rG H )signal peptide as leading sequence ,followed by multiple cloning sites ,the myc epitope 2tag and 6×his purification tag in the expression cassette.The vector was validated by success fully expressing and secretion of chick M MP 22C 2terminal PEX domain ,a potential angiogenesis inhibitor ,and tandem peptide repeats of myc epitope 2tag in C OS 27cells.These results suggest that rat growth horm one signal peptide is effective in the mediation of recombinant protein expression and secretion ,and this vector provides a new tool for universal cloning and secretion of ex ogenous proteins in mammalian cells.K ey w ords rat growth horm one ,signal peptide ,secretion vector ,mammalian cell中图分类号　R392收稿日期:2004210222,接收日期:2004212221国家自然科学基金(N o.30270658)、北京市自然科学基金(N o.7002009)、北京市肿瘤分子生物学高技术实验室、人事部留学回国人学重点项目、教育部留学回国人员启动基金、中华医学基金专项人才基金项目3联系人T el :010*********,E 2mail :zqzhang @Received :October 22,2004;Accepted :December 21,2004Supported by National Natural Science F oundation of China (N o.30270658),Natural Science F oundation of Beijing Municipal (N o.7002009),Beijing K ey High 2T echnology Laboratory of Cancer M olecular Biology ,and Chinese M edical Board F oundation3C orresponding author T el :86210266179250E 2mail :zqzhang @ 重组蛋白质的表达是生物医药开发、基因功能和作用机理研究中关键技术环节.虽然细菌表达体系由于表达量大、经济等而被广泛采用,但由于其不能提供许多蛋白质必需的翻译后修饰如糖基化等,所表达的蛋白又多以不可溶包涵体形式存在,变性复性过程复杂,产率低,因此真核细胞表达体系如CH O 、C OS 等成为活性要求高的蛋白质表达的首选[1].重组蛋白质在CH O 、C OS 等真核细胞的表达多需要由信号肽引导分泌至细胞培养基内.信号肽由15～30个疏水性氨基酸组成,位于表达蛋白的N 末端,在蛋白质表达过程中介导与粗面内质网的蛋白质翻译复合体作用,进一步转运入高尔基氏体的管腔.在转运过程中,该前导肽序列被肽酶水解切割释放,蛋白质完成糖基化和其它的翻译后修饰.如所表达的蛋白不具有跨膜结构域,则可以从细胞分泌至细胞外的培养基内[2,3].哺乳类细胞表达重组蛋白虽然从活性角度讲具有优势,但产量很低,在医药领域的大规模应用受到极大限制.目前主要从提高基因表达的量、信号肽顺序的优化、利用蛋白酶缺陷细胞系避免蛋白质的降解、宿主细胞改造适合高密度悬浮培养以及培养条件的优化等方面进行改进以提高产量和分泌的效率[4].小鼠IgG κ链[5]、前胰蛋白酶原[6]、红细胞生成素[7]、降钙素前体的前导肽序列[8]已被尝试用于重组蛋白质在哺乳类细胞的分泌表达,但实际表达过程中不同的蛋白分泌量具有较大差异.由于信号肽位于蛋白质的N 末端,其实际还决定着蛋白质的翻译起始,不同的信号肽一级结构可能还影响着蛋白质的折叠、细胞内的转运和分泌的效率[9],因此具有相对实用性广和可高效率引导蛋白质表达分泌信号肽的筛选是该领域有待解决的关键问题之一.我们推测在体液内存在的蛋白质或肽如各种激素、细胞因子的信号肽可能在诱导蛋白质的分泌表达方面具有优势.本文利用大鼠生长激素的信号肽尝试表达鸡M MP22C末端PEX片段,建立了以大鼠生长激素信号肽为前导肽、具有纯化标签的哺乳类细胞重组蛋白质分泌表达载体.1　材料和方法111　细胞、菌种和试剂中国仓鼠卵巢细胞C OS27细胞来源于美国AT CC,本室保存.所用限制性内切酶、Vent耐热DNA 聚合酶购自美国New England Biolabs;T4DNA聚合酶购自Promega公司.细胞培养基及血清均购自GI BC O/BR L公司.所用其它试剂除特别注明外均购自Sigma公司.112　大鼠生长激素信号肽RT2PCR扩增及载体构建用RT2PCR分别从大鼠脑垂体和11日龄鸡胚胎扩增大鼠生长激素(rG H)信号肽序列和鸡M MP22 C末端片段PEX序列.大鼠生长激素引物:正义:5’2 GG CAAG CTT(Hin dⅢ)AC AG AT C ACTG AG TGG23′、反义:5′2AG AGG AT CCT(Bam HⅠ)GG AC AAGGG C ATG2 3’;鸡M MP22C末端PEX引物:正义:5’2CGG AT CC (Bam HⅠ)T CTG C AAG C ACG23’,反义:5’2CCT CT AG A (XbaⅠ)G C AAG T CCT CTT C AG AAAT C AG TTTTTGCT CG AG(XhoⅠ)G C AACCC AACC AG T C.大鼠生长激素信号肽与PEX的PCR产物以约等分子比混合作为模板,以rG H的正义引物和PEX的反义引物PCR扩增使rG H信号肽与PEX相连接,再以该产物为模板用rG H的正义引物和引物5’2CTGGG CCC(ApaⅠ) T AATG ATG ATG ATG ATG ATGT CT AG A(XbaⅠ)C AAG T CCT CTT C AG23’在融合蛋白的C端PCR加上Myc抗原标签和6×His纯化标签的编码序列,Hin dⅢ与ApaⅠ酶切后,T4DNA聚合酶连接装入相应酶切的真核表达载体pcDNA310(美国Invitrogen公司产品).转化大肠杆菌DH5α,取酶解鉴定正确的克隆测序确认,用T ip2500(Qiagen公司产品)大量提取和纯化质粒备用.113　细胞培养、基因转染C OS27细胞常规生长在生长培养基(含10%胎牛血清的ME M),基因转染采用Lipofectamine (GI BC OΠBR L),按照厂家使用说明书进行.114　免疫荧光染色生长在盖片上的细胞经2%甲醛ΠP BS固定3 min,0.5%T riton X2100ΠP BS抽提3次,每次10min.与一抗鼠抗Myc10肽抗原标签单抗9E10细胞培养上清(1∶10稀释)(购自美国宾夕法尼亚大学细胞中心)37℃反应1h,0.5%T riton X2100ΠP BS洗涤3次,每次10min,与二抗罗丹明标记的山羊抗小鼠抗体(Jacks on ImmunoResearch Laboratories)37℃温育1h, 0.5%T riton X2100ΠP BS洗涤,封片,Olym pus BH22落射荧光显微镜观察,K odak T max2400胶卷照相.115　Western杂交分析细胞培养上清变性后经12%S DS2PAGE分离,电转移至PVDF膜(Milipore).5%脱脂奶粉ΠTT BS室温封闭1h,TT BS洗膜,一抗鼠抗Myc10肽抗原标签单抗9E10细胞培养上清(1∶1000稀释)作用1h, TT BS洗膜,二抗HRP标记的山羊抗小鼠抗体(1∶80000稀释)(Jacks on ImmunoResearch Laboratories)室温孵育1h,TT BS洗膜后,加入EC L化学发光试剂(Amersham公司),曝光,冲片.2　结果211　大鼠生长激素信号肽能改变重组蛋白的细胞内分布将PEX与pMyc2N融合构建MycPEX/pcDNA3载体,转染C OS27细胞,分别于转染后24h、48h利用Myc抗原决定基标签肽抗体9E10进行免疫荧光染色,结果在细胞质内可见大量大小不等、数量差异的聚集物(Fig.1),提示该蛋白在细胞内不可溶,斑块大小、数量与转染后的时间无关.选用人胃腺癌细胞MG C2803得到相同结果(结果未显示),说明不可溶性团块的形成与细胞类型无关.将PEX的N段通过DNA重组换为大鼠生长激素信号肽,免疫荧光结果显示PEX在核周呈帽状聚集分布,大小较为均匀,与高尔基氏体的细胞亚单位定位相一致,具备分泌蛋白的典型细胞亚区分布特征.提示大鼠生长激素信号肽可诱导外源重组蛋白进入细胞内分泌蛋白的加工、转运途径.212　大鼠生长激素信号肽可成功诱导重组蛋白分泌到细胞培养基取基因瞬时转染后48h的C OS27细胞的培养基,S DS2PAGE后,用Myc抗体进行Western杂交分析,结果如Fig.2所示.rG HPEX mycHisΠpcDNA培养基382第2期张志谦等:生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达　Fig.1　Immunofluorescent staining of M yc/PEX to dem onstrate the localization of expressed PEX in trans fected COS27cells(A)M ycPEXΠpcDNA3;(B)rG HPEX/pcDNA3.Bar:20μm15μl用Myc抗体即可检测到约26kD的阳性条带,与理论推导的PEX分泌蛋白的分子量吻合.不带信号肽的MycPEXΠpcDNA和空载体转染的培养基内均未检测到条带.这提示大鼠生长激素信号肽可诱导外源重组蛋白分泌到细胞外,同时改变蛋白的可溶性. 213　带有大鼠生长激素信号肽、Myc抗原以及6×H is纯化标签载体的建立和验证为使该载体适用于多数基因的克隆和表达,我Fig.2　W estern blot analysis of COS2culture supernatants48hours aftertransient trans fection probed with M yc antibody1.rG HPEX mycHisΠpcDNA;2.E.coli expressed PEX as positive control;3.M ycPEXΠpcDNA without signal peptide们将PEX序列置换成多克隆位点,构建成大鼠生长激素信号肽诱导的具有外分泌功能的真核细胞表达载体prG HSecmycHis(Fig.3).将Myc标签的十肽串重重复序列(含有多个Myc标签的十肽,构建过程将另文发表)用常规重组技术构建入prG HSecmycHis载体,使阅读框架吻合.基因瞬时转染C OS27细胞,Western杂交成功检测到转染48h后培养基内预期分子量的Myc标签十肽的串重重复序列重组蛋白(Fig.4),证明该载体亦可用于其它外源蛋白的真核细胞外分泌表达.Fig.3　Multiple cloning sequence of the eukary otic secretion expression vector prG HSecmycHisT o construct prG HSecmycHis,this sequence replaced the multiple cloning sites between Hin dⅢand ApaⅠof pcDNA3.Arrow:signal peptide cleavage site482中国生物化学与分子生物学报21卷Fig.4　W estern blot result of(M yc)nΠprG HSecmycHis trans fected COS27 culture medium probed with9E10M yc antibodyFifteen m icroliters of culture supernatants were loaded in each lane.1.untrans fected cell supernatants;2.(M yc)nΠprG HSecmycHis trans fected cell supernatants3　讨论许多分泌蛋白质具有其特有的信号肽序列,一些分泌性细胞因子有时可具有相同的信号肽序列.信号肽在体内分泌型蛋白质的成熟过程中十分重要,近年来发现其亦可使本不具有分泌功能的蛋白质或短肽分泌到细胞外[5,8],并具有生物活性,这一策略在生物医药工程中的应用价值日益引起人们的重视并得到广泛应用.然而,一种信号肽能否成功引导蛋白质的高效表达和分泌,受许多因素影响,具体调控机制不清,Li等人的工作提示含有较多阳性氨基酸的信号肽可能不利于蛋白质的分泌表达[9].我们感兴趣的是不同的信号肽在诱导同一种蛋白的表达和分泌上是否具有相同的效应,希望最终筛选到具有相对广泛适用性的信号肽.作为该工作目标的第一步,本工作初步研究结果发现,大鼠生长激素信号肽作为前导肽序列,可以分别将鸡源M MP22的C 末端片段PEX以及Myc标签十肽串重复序列分泌到细胞培养基中.氨基酸顺序分析表明,大鼠生长激素信号肽不含有任何带正电荷氨基酸,其一级结构特点符合文献报道的具高效率分泌功能的信号肽的特性,表明以其作为真核细胞外分泌表达载体中的前导肽序列是可行的.初步研究结果表明,在分泌的表达量上,该信号肽高于人干扰素信号肽,与lgGκ链等已知信号肽的比较需要进一步的工作.PEX是近年来发现具有抗肿瘤血管发生的由M MP22降解产生的内源性因子[10,11],PEX在细菌表达体系里以不可溶包涵体形式存在[10],变性复性过程复杂,产率也比较低.当不用信号肽以哺乳类细胞C OS27表达时,表达蛋白也以细胞内聚积体形式存在,亦提示高度不可溶,这使得获得大量具有活性的PEX相对较为困难.大鼠生长激素信号肽在诱导PEX进入蛋白质分泌途径时,可以对蛋白质进行诸如糖基化等修饰,以可溶形式分泌到细胞培养基中,使蛋白既容易保留其原来的自然状态和活性,下游的纯化又可容易进行.由于所构建的载体含有6×His纯化标签,当要表达的蛋白与其形成融合蛋白时可以利用Ni2NT A亲和柱进行纯化.我们已成功利用其从转染的细胞培养基中纯化到表达分泌的PEX (未发表结果).在所构建的表达分泌载体prG HSecmycHis的Myc抗原决定基标签、6×His标签前后均有常用内切酶位点,在构建过程中可以根据实验目的和需要很容易对标签肽随意选择,有利于重组过程. PcDNA3是应用较为广泛的真核细胞表达载体, prG HSecmycHis构建以其作为骨架,继承了该载体已有特点,如以C MV为启动子、含有S V40复制子(可以在含S V40大T抗原的细胞如C OS27多拷贝复制)和Neomycin筛选标志等.这些特点使prG HSecmycHis 在核酸疫苗载体开发、基因治疗、蛋白质表达等领域有广阔的应用前景.参考文献(R eferences)1　Y an S C B,G rinnell W,W old F.P ost2translational m odifications of proteins:s ome problems left to s olve.Trends Biol Sci,1989,14:2642　V on Heijne G.Patterns of am ino acids near signal2sequence cleavage sites.Eur J Biochem,1983,133:17～213　Perlman D,Halv orors on H O.A putative signal peptidase recognition site and sequence in eukary otic and prokary otic signal peptides.J Mol Biol, 1983,167:391～4094　Schm idt F R.Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry.Applied Microbiol.Biotechnol,2004,65(4):363～3725　C oloma M J,Hastings A,W ims L A,M orris on S L.N ovel vectors for the expression of antibody m olecules using variable regions generated by polymerase chain reaction.J Immunol Methods,1992,152:89～1046　Chubet R G,Brizzard B L.Vectors for expression and secretion of F LAG epitope2tagged proteins in mammalian cells.BioTechniques,1996,20: 136～1417　Herrera A M,Musacchio A,Fernandez J R,Duarte C.E fficiency of erythropoietin’s signal peptide for HIV m m21gp120expression.Biochem Biophys Res Commun,2000,273:557～5598　Liu Y C,K awagishi M,M ikayama T,Inagaki Y,T akeuchi T,Ohashi H.Processing of a fusion protein by endoprotease in COS21cells for secretion of mature peptide by using a chimeric expression vector.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:8957～8961582第2期张志谦等:生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达　9　Li Y,Luo L,Ras ool N,W agner R R,K ang C Y.Viral lipos omes released from insect cells in fected with recombinant baculovirus expressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus.J Virol,1993,7:584～588 10　Brooks P C,S illetti S,v on Schalscha T L,Friedlander M,Cheresh D A.Disruption of angiogenesis by PEX,a noncatalytic metalloproteinase fragment with integrin binding activity.Cell,1998,92(3):391～400 11　李金萍,张光谋,柯杨,林本耀,赵威,胡颖,宁涛,林仲翔,张志谦.基质金属蛋白酶22C端片段PEX的原核表达及其对血管发生的抑制作用.生物化学与生物物理进展(Li Jin2Ping,Zhang G uang2M ou,K e Y ang,Lin Ben2Y ao,Zhao W ei,Hu Y ing,Ning T ao,Lin Zhong2X iang,Zhang Zhi2Qian.Prokary otic expression of PEX:a C2 term inal fragment of matrix metalloproteinase2and its effect on the inhibition of angiogenesis.Prog Biochem Biophys),2002,29(1):120～123《中国生物化学与分子生物学报》第五届编辑委员会名单The Fifth Editorial Board of Chinese Journal of Biochemistryand Molecular Biology顾　问(Advisors)郑　集　ZHE NGJi 张昌颖　ZH ANG Chang2Y ing 邹承鲁　Z OU Cheng2Lu(Chen2lu TS OU)主　编(Editor2in2Chief)贾弘 J I A H ong2T i副主编(Associate Editors2in2Chief)昌增益　CH ANG Z eng2Y i李　林　LI Lin尚永丰　SH ANG Y ong2Feng孙志贤　S UN Zhi2X ian王琳芳　W ANGLin2Fang王志珍　W ANG Zhi2Zhen杨福愉　Y ANG Fu2Y u查锡良　ZH A X i2Liang编　委(Members of the Board,alph abetically)昌增益　CH ANG Z eng2Y i陈清西　CHE N Qing2X i耿运琪　GE NG Y un2Qi顾　军　G U Jun杭海英　H ANG Hai2Y ing赫荣乔　HE R ong2Qiao黄　力　H UANGLi贾弘 J I A H ong2T i蒋澄宇　J I ANG Cheng2Y u焦炳华　J I AO Bing2Hua柯　扬　KE Y ang金由辛　J I N Y ou2X in李伯良　LI Bo2Liang李　刚　LI G ang李根喜　LI G en2X i李桂源　LI G ui2Y uan李　林　LI Lin李　宁　LI Ning李载平　LI Z ai2Ping梁爱华　LI ANG Ai2Hua梁宋平　LI ANG S ong2Ping林其谁　LI N Qi2Shui刘德富　LI U De2Fu刘德培　LI U De2Pei刘国琴　LI U G uo2Qin刘进元　LI U Jin2yuan缪时英　MI AO Shi2Y ing彭景 PE NGJing2Pian钱关祥　QI AN G uan2X iang强伯勤　QI ANG Bo2Qin屈良鹄　QU Liang2Hu饶子和　RAO Z i2He施蕴渝　SHI Y un2Y u阮康成　RUAN K ang2Cheng尚永丰　SH ANG Y ong2Feng寿成超　SH OU Cheng2Chao孙志贤　S UN Zhi2X ian王嘉玺　W ANGJia2X i王琳芳　W ANGLin2Fang王志珍　W ANG Zhi2Zhen魏　群　WEI Qun温进坤　WE N Jin2K un许根俊　X U G en2Jun杨福愉　Y ANG Fu2Y u杨克恭　Y ANG K e2G ong杨晓明　Y ANG X iao2M ing药立波　Y AO Li2Bo姚仁杰　Y AO Ren2Jie叶棋浓　YE Qi2N ong袁勤生　Y UAN Qin2Sheng查锡良　ZH A X i2Liang张　今　ZH ANGJin张　蘅　ZH ANG Nai2Heng张旭家　ZH ANG Xu2Jia张　翼　ZH ANG Y i周春燕　ZH OU Chun2Y an周海梦　ZH OU Hai2Meng周筠梅　ZH OU Jun2Mei朱大海　ZH U Da2Hai朱卫国　ZH U Wei2G uo朱玉贤　ZH U Y u2X ian特邀编委(Specially I nvited Members of the Board)吴　瑞　Ray W U(US A)于宽仁　R obert K.Y U(US A)682中国生物化学与分子生物学报21卷。

生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 5 期 698 ~ 703Current Biotechnology ISSN 2095‑2341进展评述Reviews不同亚型CHO 宿主细胞对抗体表达的影响曹辉 ， 董静 ， 贾宇 ， 江一帆*华北制药集团新药研究开发有限责任公司，抗体药物河北省工程研究中心，抗体药物研究国家重点实验室，石家庄 050015摘要：CHO 细胞作为宿主细胞广泛应用于生物药工业化生产中。

其中，CHO -K1、CHO -DG44和CHO -S 是最常见的3种亚型。

虽然这些亚型是从共同的原始CHO 细胞分离出来的，但在不同的实验室或生物医药公司、研究人员、培养基或培养方式下连续传代、驯化和保存，使得CHO 细胞积累了大量变异，导致宿主细胞应用于抗体药生产时会在细胞生长状态、抗体表达量及以糖型为代表的质量属性方面表现出较大差异。

综述了CHO 细胞不同亚型的染色体差异、生长状态、表达差异以及糖型差异，以期为抗体药物研发中宿主细胞的选择提供参考。

关键词：CHO 细胞；抗体；表达量；糖型DOI ：10.19586/j.2095‑2341.2023.0064中图分类号：Q28, R392-33 文献标志码：AEffects of Different Sources of CHO Host Cells on Antibody ExpressionCAO Hui ， DONG Jing ， JIA Yu ， JIANG Yifan *State Key Laboratory of Antibody Drug Development ， Hebei Engineering Research Center of Antibody Medicine ， New Drug Research and Development Co. Ltd ， North China Pharmaceutical Corporation ， Shijiazhuang 050015， ChinaAbstract ：CHO cells comprise a variety of lineages including CHO -K1， CHO -DG44 and CHO -S ， which have been widely used in the industrial production of biological drugs. All CHO cell lines share a common ancestor ， however ， during the process of cell pas­sage cultivation ， cell domesticated ， and preservation by different laboratories or companies ， substantial genetic heterogeneity among them has been produced ， that showed great differences in cell growth state ， antibody titer ， glycosylation and other product quality attributes. This article reviewed the difference in chromosome ， growing status and expression ， and glycoform in different sources ofCHO host cells ， which was expected to be helpful in host cell selection during antibody drug research and development process.Key words ：CHO cells ； monoclonal antibody ； antibody titer ； glycosylation生物药物在国际医药市场中占据主导地位，截至2023年，全球范围内已有100多个抗体药物被批准上市，近1 200个抗体药物处于不同临床试验阶段［1］。

世界最新医学信息文摘 2021年 第21卷 第5期163投稿邮箱：zuixinyixue@·基础研究·CHO 细胞表达重组DNA 蛋白制品病毒污染风险管理研究魏哲学1，2，武志昂1，3＊（通信作者）（1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110023；2.沈阳三生制药有限责任公司，辽宁 沈阳 110027；3.北京亦度正康健康科技有限公司，北京 100055）0　引言生物制品基于来源可以分为3类：第1类是从人或者动物组织制得的产品，包括从人或动物的器官、组织、血液或其他生物体液当中提取的生物制品。

第2类是病毒疫苗和基因治疗的病毒载体。

第3类是从全面鉴定过的动物细胞表达的生物制品[1]。

中国仓鼠卵巢细胞（CHO ）是常用的细胞系。

这类制品包括细胞因子、单抗和重组亚单位疫苗等。

本文讨论的对象主要是第3类中的细胞因子类产品生产过程中病毒污染的控制问题，拟以风险管理理论为指导，采用失效模式和影响分析（Failure Mode & Effect Analysis ，FMEA ）方法，提取并确立导致失败模式发生的影响因素以及影响的严重程度，进而提出风险管理的建议。

CHO 细胞表达重组DNA 蛋白制品的病毒污染可以分为两类，即内源性病毒污染和外源性病毒污染[2]。

除内源性逆转录病毒样颗粒外，CHO 细胞在细胞培养过程中有可能发生外源性病毒污染，因此需要从物料的质量控制到细胞培养及纯化的全过程进行必要的控制，以降低外源性病毒污染的风险。

基于质量源于设计的原理，产品的质量源于良好的工艺设计，良好的病毒控制效果同样源于病毒控制及除病毒工艺设计。

本文不讨论工艺设计及工艺验证问题，仅就如何确保一个经过良好设计的工艺持续稳定的运行进行讨论。

1　理论与方法简介1.1　风险管理理论。

质量风险管理的过程就是风险最小化的过程[2]，在此过程中我们应当识别风险，选择最有效的方法来降低风险。

风险降低措施得以实施之后，需要进行定期的风险回顾，确认风险降低措施的有效性，确认之前的评估结论及风险降低措施是否符合最新技术和法规的要求。

cho细胞表达系统及筛选原理Cho细胞表达系统及筛选原理一、引言Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。

本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。

二、Cho细胞表达系统的原理Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。

Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。

1. 转染将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。

质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。

病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。

2. 选择性筛选为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。

只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。

3. 扩增和表达经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模蛋白质表达。

通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。

4. 蛋白质纯化经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。

三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。

1. 高表达水平Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。

这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。

2. 真核细胞表达与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。

这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。

3. 可选择性筛选通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。

这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。

4. 灵活性Cho细胞表达系统可以应用于多种类型的蛋白质，包括单链抗体、重组蛋白、酶等。

CHO细胞无血清培养基的筛选与优化在生物制药领域，CHO 细胞（Chinese Hamster Ovary Cell，中国仓鼠卵巢细胞）因其能够高效表达重组蛋白而被广泛应用。

然而，传统的含血清培养基存在诸多问题，如血清成分复杂且批次间差异大，易引入外源病毒和支原体污染等。

因此，开发和优化 CHO 细胞无血清培养基成为了提高生物制品质量和安全性的关键环节。

一、CHO 细胞无血清培养基的重要性血清在细胞培养中曾被广泛使用，但其存在的问题不容忽视。

血清中的成分复杂且不稳定，这使得细胞培养过程难以控制和标准化。

不同批次的血清质量差异较大，可能影响细胞的生长、代谢和产物表达。

此外，血清中可能携带的病毒、支原体等污染物会给生物制品带来潜在的安全风险。

相比之下，无血清培养基具有明显的优势。

它的成分明确且稳定，便于质量控制和优化。

无血清培养基可以减少外源污染物的引入，提高生物制品的安全性。

同时，它能够为细胞提供更适宜的生长环境，促进细胞的生长和产物表达，从而提高生产效率和产品质量。

二、筛选 CHO 细胞无血清培养基的方法1、基础培养基的选择首先需要选择合适的基础培养基作为起点。

常见的基础培养基如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium，杜氏改良伊格尔培养基）、RPMI 1640 等，它们在营养成分和离子浓度等方面有所不同。

需要根据 CHO 细胞的特性和培养需求，初步筛选出几种可能适用的基础培养基。

2、添加剂的筛选在基础培养基的基础上，需要添加各种营养成分、生长因子、激素等添加剂来满足 CHO 细胞的生长和代谢需求。

例如，胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等对于细胞的生长和存活至关重要。

通过单独或组合添加这些添加剂，并检测细胞的生长情况、代谢指标和产物表达水平，来筛选出最优的添加剂组合。

3、化学成分的优化除了添加剂，培养基中的化学成分如氨基酸、维生素、无机盐等的浓度和比例也需要进行优化。

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)的克隆及其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞
中的表达
作者：黄妙容， 阳建辉， 刘德武， 黄晓灵， 蔡更元， 吴珍芳， HUANG Miao-Rong， YANG Jian-Hui， LIU De-Wu， HUANG Xiao-Ling， CAI Geng-Yuan， WU Zhen-Fang
作者单位：黄妙容,HUANG Miao-Rong(华南农业大学动物科学学院,广州510642;肇庆大华农生物药品有限公司,广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室,肇庆526238)， 阳建辉,YANG Jian-Hui(岳阳职业技术学院
,岳阳,414000)， 刘德武,黄晓灵,吴珍芳,LIU De-Wu,HUANG Xiao-Ling,WU Zhen-Fang(华南农业大学动物
科学学院,广州,510642)， 蔡更元,CAI Geng-Yuan(广东省农业科学院畜牧研究所,广州,510642)
刊名：
农业生物技术学报
英文刊名：Journal of Agricultural Biotechnology
年，卷(期)：2012,20(12)
本文链接：/Periodical_nyswjsxb201212012.aspx。

CHO细胞生产蛋白糖基化影响的研究作者：杜秀冬来源：《科技风》2020年第23期摘要：蛋白质的糖基化对于其作为生物治疗剂至关重要，已经展开了许多对中国仓鼠卵巢细胞生产蛋白糖基化的研究。

生物过程参数和培养基添加剂可调节蛋白质的糖基化。

本文介绍了工程策略方面的进展。

关键词： CHO细胞;糖基化;蛋白中国仓鼠卵巢（CHO）细胞被广泛用于生物治疗药物的生产中，部分原因是它们能够产生糖基化的蛋白质。

糖基化通过影响分子的半衰期和效率而在蛋白质功能中起关键作用，并有可能对糖蛋白的安全性产生不利影响[1]。

研究人员采用不同的方法包括改变工艺条件、补充培养基添加剂以及宿主细胞系的修饰来调节蛋白质分子的糖基化谱。

糖蛋白通常是指各种翻译后修饰，尤其是蛋白质N-糖基化，它对蛋白质的功效和免疫原性起着至关重要的作用。

蛋白质功能受糖基化作用，在结合、溶解度、稳定性和折叠等方面有影响。

1 通过工艺优化控制糖基化通过优化工艺条件如溶解氧（DO）、pH、温度和培养持续时间等从而影响蛋白质的糖基化。

Chotigeat及其同事发现，将重组人CHO的卵泡刺激素（hFSH）的表达受β肌动蛋白启动子控制的重组CHO细胞系在无蛋白质培养基上稳定灌流培养。

增加DO浓度提升了唾液酸转移酶的活性，FSH亚型向较低的pI部位转移，这使得唾液酸含量的增加。

随着hFSH比生产率的增加，其亚型分布向低pI亚型转移[2]。

相反，对Epo-Fc融合蛋白[3]和rEPO[4]的研究发现DO对唾液酸化没有影响。

对表达EPO的CHOK1细胞的进一步研究表明，DO对触角程度没有影响，但是有一个最佳的DO范围可使岩藻糖基化最大化。

对于IgG1的末端半乳糖基化，随着DO浓度的降低观察到聚糖链半乳糖基化程度降低[5]。

CHO培养过程中向较低培养温度的转变也会影响糖基化。

使用表达人组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的CHO细胞进行的研究与多糖位点占有率的增加和温度的降低相关[6]。

综述重组人促红细胞生成素的研究进展王丽，周勇*(中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京100050)人促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO），是一种高糖蛋白类激素，也是最早发现的细胞因子之一。

EPO主要是在肾脏合成分泌，进入血液循环系统，作用于骨髓中的红系祖细胞，促进红系祖细胞增殖、分化和成熟为红细胞。

它能够刺激骨髓造血功能，及时有效地增加红细胞的数量，从而提高血液的携氧能力，增强机体对氧的结合、运输和供应能力，改善缺氧状态，是哺乳动物调节红细胞生成的主要调控因子。

1989年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了Amgen公司生产的rHuEPO上市，在临床上主要用于治疗肾性贫血以及肿瘤等各种慢性疾患所伴发的贫血。

继重组人促红细胞生成素（rHuEPO）出现之后，出现了很多新型的EPO，如新促红血球生成蛋白NESP(new erythropoietin stimulating protein，亦称高度糖基化Epo-Darbepoetin），CERA，EPO 模拟肽EMP（EPO mimeticpeptide）等，为临床治疗提供更好的条件。

rHuEPO自从上市以来，rHuEPO可以减少病人输血次数，提高病人的生活品质，成为迄今为止用基因工程代替体液因子治疗人类疾病的一个最成功的范例之一。

1. 人促红细胞生成素的发现人们对EPO的认识可以追溯到上个世纪初，1906年Carnot 和Deflandre发现：将放血后兔子的血浆注射给正常的兔子，正常兔子的外周血中的红细胞数量增多。

他们认为贫血兔血浆中存在一种体液因子能够刺激红细胞生成,并称其为生成素[1]。

这对EPO的发展无疑是一项突破。

1948年，Bonsdorff和Jalavisto等将这种调控因子命名为红细胞生成素。

1950年Reissman用连体鼠试验观察到，给连体之一呼吸低氧空气，另外一只鼠呼吸正常空气，结果两只均呈现同样程度的骨髓红细胞增生现象，这是由于红细胞生成素从低氧鼠进入非低氧鼠从而刺激红细胞的生成。