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分子生物学在微生物生态学中的应用摘要：本文针对于分子生物学技术在微生物生态学中的研究进展进行了各方面的分析，首先探索了分子生物学技术的基本内容，并对微生物生态学中的一些问题进行了重点分析，接着便对分子生物学技术在微生物生态学中的研究进展进行了深刻的探索，对未来的发展情况做出了一系列的畅想。
关键词：分子生物学；微生物生态学；研究进展引言：其实探索分子生物学技术在微生物生态学中的研究进展，要对各方面情况进行重点探索。
首先要明白什么是分子生物学技术，自诞生以来有着怎样的重大突破，而微生物生态学中的主要问题主要矛盾又是什么，相对应的分子生物学技术有哪些应用，这样才能够相对应的去联系分子生物学技术，在微生物生态学中的研究进展。
1.分子生物学技术简介其实可以从一些基本的例子来分析，这样有助于更好的分析分子生物学的技术概念，在分子生物学诞生之前，在分析个体的时候，从最初的精神面貌以及身体状况来分析，其实这也就是从人体的一些表面来探索是否发生疾病，是否有一些潜在的问题。
而判断一个人是否健康，在分析各种各样生物的过程中也都是如此，如果一个生物的身体情况表现不佳，精神状态不好，就可以初步的判断其存在一定的疾病，或者是身体出现一定的问题，这种办法是比较科学的，但是相对来说依然是不够准确的。
在分析问题的时候，仅仅从表面来看是很难看到实质的，也很难针对性的进行分析，往往能够判断人们的疾病却不能够更好的治疗人们的疾病。
对于生物学的研究也是如此，很难有大的突破，但是在近些年来我们会发现，人们可以通过各种各样的方式来研究身体内的一些物质，可以通过手术的方式来研究身体内脏的病变以及动物的发展原理，也包括生物的进化情况。
在这一层次上分析则能够更好的去分析病灶，更好的去抓住问题，也能够进行相对应的治疗。
从最基本的概念入手，从最基本的内容入手，能够有效的发现问题，也能够有效的进行改善，这对于生物学的研究进展有着巨大的突破。
人们对于蛋白质体系，蛋白质核算体系，蛋白质脂质体系有了新的认识，在未来的几十年内，发展进一步有了新的突破，人们也能够更好的认识到生物学的本质。
分子生物学方法在食品微生物检测中的应用分子生物学方法是一种利用生物分子来进行检测、分析和研究的技术手段，已经广泛应用于食品微生物检测中。
这些方法的应用可以提高检测效率和准确性，并且对食品安全有着重要的意义。
在下面的内容中，我将详细介绍一些分子生物学方法在食品微生物检测中的应用。
1.基于PCR的方法：聚合酶链反应（PCR）是一种广泛应用的分子生物学方法，通过扩增特定DNA序列来检测食品中的微生物污染。
PCR可用于检测致病菌、变质菌和食品腐败微生物，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等。
此外，PCR还可以用于检测传统方法难以分离和检测的微生物，如非典型变形菌、嗜冷菌等。
2.实时荧光PCR：与常规PCR相比，实时荧光PCR可以实时监测PCR扩增的过程，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点。
该方法可以实时检测食品中微生物的数量，并能够快速准确地定量微生物的存在。
此外，实时荧光PCR还可以与其他分子生物学方法结合使用，如多重PCR和荧光探针技术，以提高检测效果。
4.基于基因芯片的方法：基因芯片是一种能够同时检测多个样本中多个基因组区域的技术，可以用于高通量的微生物检测。
通过基因芯片，可以同时检测和鉴定食品中多个微生物的存在，并能够快速、准确地确定微生物的种类和数量。
此外，基因芯片还可以用于快速筛选和鉴定食品中的污染物和有害物质。
5.其他分子生物学方法：除了上述方法外，分子生物学还广泛应用于食品微生物检测中的其他技术。
例如，流式细胞术可以用来快速检测食品中的细菌和真菌等微生物，并且能够对样品中细菌的数量、形态和大小等进行精确测量。
此外，分子生物学还可以与其他化学和免疫学方法结合使用，如PCR-ELISA、PCR-RFLP和PCR-DGGE等，以提高微生物检测的准确性和灵敏度。
总之，分子生物学方法在食品微生物检测中的应用极其广泛。
通过这些方法，我们可以高效、准确地检测和鉴定食品中的微生物污染，为食品安全的监测和控制提供有力的技术手段。
2017年04月分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用张晨曦(上海师范大学,上海200235)摘要：微生物多样性研究是生物多样性研究中的重要内容，由于微生物与动植物相比，存着这许多不同之处，因此其多样性研究也存在着许多不同之处，尤其是研究方法仍有待提升。
近些年来，越来越多的研究通过分子生物学方法观察微生物并取得了一定的成效。
因此，文章主要针对分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用价值展开分析。
关键词：分子生物学方法；微生物多样性；遗传多样性微生物主要包括细菌、放线菌、原生动物、真菌、部分藻类和病毒，是构成自然界的重要组成部分，其具有代谢多样性和遗传多样性，使得微生物在许多极端环境中都能够生存、繁衍。
微生物是生物链中的重要成员，对于动植物的生长发育、生态循环以及污染物的自然降解具有重要作用[1]。
微生物种类数量仅次于昆虫，但目前已知微生物种类占其总估计量的比重仍较低，目前生物界中已知的细菌、真菌以及病毒占其总种类的比重仅有6%、11%和5%，微生物多样性的研究滞后于其他生物群。
1微生物多样性研究的重要性微生物在维持生态平衡中具有重要作用，但是我们对于维持生态平衡的微生物系统的结构以及有关参数知之甚少，究其原因是由于传统微生物培养方法是通过获得培养菌株才能了解其特征，但是在自然界中能够培养的微生物数量还不到微生物总量的百分之一。
传统微生物研究主要是通过观察菌株的表性特征以及细胞的性质（包括细胞形态学、生理生化反应以及细胞组成成分等方面）[2]。
由于实验室培养是观察这些微生物特征的重要前提，因此这使得许多无法培养的微生物都不能被具体描述。
此外，这种研究方式对于微生物的进化关系没有有效的作用，因此微生物进化研究受到影响，从而无法对微生物进行准确的分类以及系统关系图的创建。
DNA 技术以及微生物分子学的出现为微生物研究提供了新的道路，有助于现代微生物多样性研究的良好开展。
从理论层面上分析，微生物进化之间的关系主要是由于基因组的结构决定的，通过比较微生物基因序列之间的不同能够有助于分析微生物之间的进化关系，比较简单的方法就是比较不同微生物类似基因之间的碱基序列，碱基序列之间的差距越大，说明微生物之间的进化关系也就越小。
微生物生态学研究中的分子生物学方法微生物是地球上最为丰富、多样且广泛分布的生物，有着重要的生态功能。
在微生物生态学研究中，许多问题需要考虑微生物的多样性、生态学分布及其作用和适应性。
传统的微生物学研究通常依赖于纯培养和形态学特征进行分类和鉴定，但存在着很大的缺陷，许多微生物无法进行纯培养，而且在分布及功能上存在巨大的多样性和复杂性。
因此，利用分子生物学方法，在微生物生态学研究中推进更为深入的探索和解决问题尤为重要。
分子生物学方法已经成为微生物学研究中的常规手段。
其中，分子生态学作为微生物生态学研究的一个重要分支，是利用微生物群落的DNA序列来描述微生物的多样性和结构、分布模式、演化规律以及生态功能。
分子生态学是利用分子生物学技术，以微生物群落DNA为物质基础，分析微生物群落的结构及其变化和生态功能的研究领域。
常见的分子生态学方法有PCR-DGGE、PCR-SSCP、PCR-RFLP 等。
PCR-DGGE技术是一种评价微生物群落构成的分子生物学方法，也是分子生态学研究中最常采用的一种方法。
此技术通过扩增轮廓分析电泳，能够在不进行序列测定的情况下，迅速知道样品中微生物群落的构成情况。
DGGE是一种革命性的电泳技术，可以使得同样长度、不同序列的DNA分子发生不同程度的变性而达到不同的电泳迁移率，因此，能够从PCR扩增产物中分离出不同种群、不同数量的DNA序列，可用于分析种群的构成和动态变化。
PCR-SSCP技术是用来研究微生物群落中小亚基的分子生物学方法。
它可以通过分析不同峰的数量及大小，评估群落的多样性和结构。
其原理是在一定条件下，所有长度相同的PCR产物的突变体将由于核酸热变性、缺陷组态和电泳带电性质等不同而形成不同的电泳迁移率，从而显示在聚丙烯酰胺凝胶上。
PCR-RFLP技术是将PCR扩增的外显子或内含子序列用限制酶切法切开后，根据限制酶切后DNA片段的数目、大小、分布等特征，依据电泳迁移率或其他方式进行分离鉴定。
微生物分子生态学及其应用随着科技的不断进步和生物学研究的深入，微生物分子生态学逐渐成为了一个热门的研究领域。
微生物分子生态学是指通过分析微生物的分子组成和动态变化，揭示微生物间的相互作用及其与环境的关联，探索微生物生态系统的演变和调控机制的学科。
相较于传统的微生物学研究，微生物分子生态学能够更准确、更全面地研究微生物与环境间的关联，使得微生物的研究更具针对性。
微生物分子生态学通过分析微生物的分子生物学信息，可以深入探究微生物的生理、代谢、生态等各个方面，并进一步揭示微生物的生境分布、演化和生态功能。
这不仅有助于更深入地理解微生物的生态系统，也为微生物的应用研究提供了有力的支撑。
1. 微生物分子生态学的研究方法微生物分子生态学一般通过以下方法进行研究：（1）高通量测序技术高通量测序技术大大提高了微生物分子生态学研究的效率和准确度，尤其在微生物群落结构和功能的研究中应用广泛。
基于高通量测序技术，不仅能够分析微生物群落的构成，还可以揭示微生物间的相互作用及其与环境的关联。
（2）荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术常用于微生物群落结构和空间分布的研究。
该技术通过使用荧光标记引物，能够将特定细菌、真菌或病毒等微生物直接标记并固定在试样中，观察其在不同空间中的分布情况，进而分析微生物间的相互作用。
（3）质谱分析技术质谱分析技术可以分析微生物的代谢产物，并结合高通量测序技术或荧光原位杂交技术等技术，深入探究微生物的代谢途径和功能。
2. 微生物分子生态学在环境保护中的应用微生物在环境保护中有着重要的作用，而微生物分子生态学则为环境保护提供了更加有效的手段。
（1）土壤污染修复土壤污染是一个长期而严重的问题，微生物可以分解或转化污染物，促进土壤的简易修复。
通过微生物分子生态学的研究，不仅可以深入了解微生物的生理代谢机制，还能针对特定污染物的生态功能和代谢途径，实现更加精准的修复。
（2）环境监测微生物群落是环境中的重要组成部分，通过对微生物群落的组成、分布和转化过程的研究，可以更加精准地评估环境状况。
分子生物学技术在临床微生物检验中的应用一个人如果出现感染之后，医生都会为病人先做微生物学感染诊断。
以明确疾病感染物。
以往的检验方式通常都是比较单一的，一般都是采用类似于酶活性等相关特征来进行检验。
这种检验手段很难满足现代微生物检验的需要，同时也很难达到预期检验要求。
可以说存在着一些弊端。
采用分子生物学技术来检验便能突破传统检验中的一些难题。
今天就为大家做一番介绍。
一、质粒指纹图分析法质粒指纹分析技术是目前临床微生物检验中最常用的一种技术，这种技术最大的优点就是能通过技术分析来病菌纹图来进行分析，然后再结合不同的病菌图纹来找出相对应的感染源。
因而，这一种检验方法，才能够被越来越多的人们所熟悉。
在进行检验检疫的过程中，医学人士首先对病人做抽提纯化质粒DNA工作，然后在对纯化质粒DNA做检验，经琼脂糖凝胶电泳之后的DNA分析，根据分子量大小来作分析，以质粒指纹图来做判断，这也是一个重要的一个标志。
这也帮助医学人士更好来做分析。
如：医学人士可以利用紫外灯来进行光照检测，而在等下可看见菌群下呈现一条条，或者是多条质粒带构成突破。
这即是质粒指纹图形。
质粒指纹技术可用于检测多种不同的病菌，同时还能够用于分析类似于革兰阴性菌在不同的属的、种间之间的传播，目前也主要用到革兰阳性菌之中，如：金黄色葡萄球菌等。
主要还是因为凝固酶阴性葡萄球菌常含有数个不同的质例等。
质粒指纹图分析主要原理是根据质粒大小与数理相同的菌株，这其中还是有很多相似的图形，即质粒指纹图。
当细菌有多个质粒，特别就是在分子量还较小的时候，质粒指纹图就成为一个相对的稳定的标志。
二、染色体DNA指纹图分析染色体DNA指纹图分析是一种现代生物检验技术，这种技术最早被著名遗传学家Jefferys及其合作者所发明出来，当时，Jefferys与众多学者在前人的研究基础上，将离析的提取出来的人源小卫星DNA使用到检验当中，即采用基因探针检验，然后，与人体里面所提取出来的的核DNA的酶切片段作杂交处理，最终获取了几个位点上的等位基因组成的长度不相等的杂交带图纹，这一种图纹一般来说都是很少出现完全相同的图谱，因而也就能够帮助医学人士开展医学研究工作，因此在当时也被称之为"DNA指纹"。
分子生物学和基因工程技术在生态学研究中的应用生态学是对生物和环境之间相互作用的研究，而分子生物学和基因工程技术则是现代生物学中的重要分支，它们的结合为生态学研究带来了新的思路和方法。
在本文中，我们将探讨分子生物学和基因工程技术在生态学研究中的应用，并介绍一些具体的案例。
DNA条形码技术DNA条形码技术是一种基于遗传密码的生物鉴定方法，它利用物种特有的DNA序列区别不同的生物个体或物种。
DNA条形码技术在生态学研究中有广泛的应用，可用于物种识别、群落结构和演化等方面。
举例来说，在野生动物监测中，DNA条形码技术可以通过分析动物粪便或采集的毛发等不同样品中的DNA序列，区分不同物种的动物，从而了解它们的栖息地、生态角色以及种群数量等信息。
同样，DNA条形码技术还可以用于土壤微生物、水生生物、植物等不同领域的生物多样性研究。
基因编辑技术基因编辑技术是一种通过修改DNA序列来改变生物个体性状的技术，常用于改良作物品种、设计新药和治疗遗传病等方面。
在生态学研究中，基因编辑技术也有重要的应用。
例如，科学家可以利用基因编辑技术改变植物的根系结构、生长速度或对环境的适应能力，从而增强植物抗逆性和生态恢复能力。
类似地，利用基因编辑技术可以改善农业生态系统的稳定性和可持续性，从而提高农业产量和品质。
基因组学研究基因组学研究是对生物基因组结构、序列、功能和表达等方面的综合研究。
为了更好地理解生物间的遗传和进化关系，生态学家也开始利用基因组学研究工具。
例如，利用基因组学研究可以揭示不同物种之间基因组结构和功能的相似性和差异性，进而了解它们之间的演化关系。
基因组学研究还可以揭示生态系统中不同物种之间的相互作用关系和信息流动，从而为生态平衡的维护和管理提供更为精细的方案。
关于生态和环境问题的研究一直是重大挑战，而快速发展的分子生物学和基因工程技术则为生态学研究带来了新的机遇和挑战。
作为研究生物和环境间关系的生态学家，我们应该不断学习和应用新技术，为生态学研究做出更大的贡献。
分子生物学方法在微生物遗传学中的应用微生物是地球上最早出现的生命形式之一，以其简单、多样的遗传学特征备受研究者关注。
在微生物遗传学的传统研究中，遗传元件的克隆、探究以及遗传改造主要依靠转座子、限制性内切酶和自然转化等常规手段。
然而，分子生物学方法的出现，为这一研究领域带来了新的发展机遇。
1. PCR在微生物遗传学中的应用聚合酶链反应（PCR）是一种极为敏感的 DNA扩增技术，可从体外扩增少量DNA。
在微生物遗传学研究中，PCR技术得到广泛应用。
以大肠杆菌为例，通过PCR扩增菌株的某些特殊基因，可实现本地化定位并鉴定与该基因有关的新的突变变异体或插入元件。
此外，PCR可利用不同的引物对微生物进行快速、准确的鉴别。
例如，以内源性16S rRNA基因为靶标，反向PCR检测革兰氏阴性或革兰氏阳性菌群的草案已被广泛报道。
2. 基于CRISPR-Cas系统的遗传改造普通的CRISPR-Cas系统可用于检测外来 DNA和转染物。
基于CRISPR-Cas系统的遗传编辑技术使科学家们可以将外源或内源 DNA序列精确地插入到一个特定的位点中，从而实现微生物遗传学上的新改造。
例如，利用Cas9核酸作为核酸坑，并指定特异性guide RNA，可使肠杆菌中的β-内酰胺酶基因轻松地发生点突变。
3. 基于高通量测序的菌株鉴定高通量测序技术是一种快速、高效测序方法，可用于对微生物的遗传信息进行全面、准确的阅读和解码。
在微生物遗传学的研究中，高通量测序可以作为一种强大的分子分析技术，准确地鉴别菌株并建立其基因组信息的蓝图。
同时，它还可以使用元数据分析法检测菌株与人类、环境等资源之间的相互作用。
4. 基因工具箱的应用近年来，一些基因工具箱逐渐进入微生物遗传学的研究中心，提供了许多实用的工具用于微生物的遗传研究。
例如，竞争-传递系统可用于揭示某些群体中基因的横向转移，DNA序列基因辨识器可帮助快速鉴定遗传元件中的真正基因。
总之，分子生物学方法在微生物遗传学中的应用不断发展，推动了这个领域的各种改进和新文件的出现。
微生物多样性的研究方法和应用微生物是指眼不能见的微小生物，包括细菌、真菌、病毒和藻类等。
微生物广泛存在于地球上的各个角落，是地球上最重要的生物群落之一。
微生物的多样性研究对生态学、生物技术、医学等领域具有重要意义。
本文将介绍微生物多样性的研究方法和应用。
一、微生物多样性研究方法1、分子生物学方法分子生物学方法是对微生物多样性研究的主要方法之一。
该方法主要是通过分析微生物的DNA序列进行分类。
例如，通过对16S rRNA基因序列的测序可以研究并鉴定微生物群落中的细菌。
16S rRNA基因是细菌中所有菌种都具有的基因，其序列的差异可以用来辨识不同的菌属和种类，因此被广泛应用于微生物多样性研究中。
2、传统的形态学方法传统的形态学方法是对微生物多样性研究的常用方法之一。
这种方法通过研究微生物在形态上的差异进行分类。
例如，通过观察细菌在显微镜下的形态特点，可以分辨出不同的菌属和种类。
但是，这种方法的主要缺点是不能对细菌进行详细的鉴定和分类。
3、生化反应试验生化反应试验是对微生物分类和鉴定的重要方法之一。
生化反应试验的主要原理是当微生物接受某些化合物时，会发生特定的反应，如乳糖分解、葡萄糖分解等。
这些反应的差异可以用来辨识不同的微生物种类。
二、微生物多样性研究应用1、环境保护微生物在土壤、水体中具有重要的功能，如分解污染物和提高土壤肥力。
研究微生物多样性可以为环境保护提供重要的科学依据。
例如，通过分析水体中微生物的群落结构，可以推测出水体中的特定物质浓度和水质等级。
2、临床医学微生物是人类身体内的常见细菌，它们既能够维持生理平衡，也会引起人体多种疾病。
针对于微生物的研究在临床治疗和预防感染病方面具有很大的意义。
例如，通过研究肠道微生物群落的结构和功能，可以提供新的方法来治疗一些肠道相关疾病。
3、食品工业食品行业中的微生物研究主要是针对于食品中自然存在的微生物及与食品科学相关的新型微生物进行的。
这些研究可以提供新的方法，使食品更加安全。
分子生物学方法在生态学中的应用生态学是对生态系统及其成分，以及它们之间相互作用与演变规律的研究。
分子生物学则是以分子水平研究生命现象的分支科学，包括了DNA、RNA、蛋白质等。
随着生态学和分子生物学的深入发展，两者的交叉越来越多。
分子生物学技术的广泛应用，使得生态学研究手段更加多样化和精细化。
本文将从DNA条形码、基因测序、蛋白质组学、转录组学等方面，阐述分子生物学方法在生态学中的应用。
一、DNA条形码：增强物种鉴定和生物多样性研究DNA条形码是指对物种特异性和识别性的一小段DNA序列进行测序，从而实现物种鉴定和生物多样性研究的方法。
从生物体中提取DNA后，采用PCR扩增特定的DNA片段，如COI （mtDNA细胞色素c氧化酶亚单位I），再将测序结果与数据库比对，即可鉴定物种。
DNA条形码适用于各种生物体，无需人为处理，还可以通过高通量测序技术实现快速鉴定大量生物样品。
它的优点在于方便、快速、经济，在生物多样性调查、食物链点分析、生物入侵、野生动物保护和控制疾病传播等方面有广泛应用。
二、基因测序：深入解析群体遗传结构、生物演化和生态系统功能基因测序是对DNA序列的全面测定，由于不同基因的存在，基因测序与DNA条形码相比更广泛地涵盖了生命现象。
借助高通量测序技术，各种生物的基因组和全面基因特征都可以得到解析，不仅可以更深层次地研究人类、动植物遗传学，还可以解析全球范围内不同生物种群的遗传变异和群体遗传结构。
通过对DNA序列的分析，还可以进行生物演化和生态系统功能的研究，如分析属间物种间的遗传分化、地理分布格局等，以及了解生态系统的演变和稳态调控机制等。
三、蛋白质组学：探究物种适应和响应环境变化蛋白质组学指对一个生物系统中所有蛋白质的总体分析，并对蛋白质组的变化进行定量分析和系统分析，揭示蛋白质间的相互作用、信号传导、功能调控与代谢等。
在生态学中，蛋白质组学可以帮助研究人员更好地了解物种对环境变化的适应性、响应性和适应度的转变，提高对生态系统的精细把握。
3 [收稿日期]2007-05-24 [作者简介]周晓杨(1976-),女,四川内江人,硕士研究生,助教,主要从事鱼类疾病与微生态学研究.E -mail:xr pxp@ 2007年8月重庆文理学院学报(自然科学版)Aug 1,2007 第26卷 第4期Journal of Chongqing University of A rts and Sciences (Natural Science Editi on )Vol 126 No 14分子生物学方法在微生物生态学研究中的应用周晓杨1,肖仁普2(1.河南师范大学 生命科学学院,河南 新乡 453007;2.西南大学 生命科学学院,重庆 北碚 400715)[摘 要]由于传统分离培养微生物的局限,分子生物学技术避开了传统微生物培养分析的环节,直接从样品中抽取总DNA,然后通过PCR 扩增及其相关技术、核酸杂交技术、RNA 基因序列分析等方法对直接提取的总DNA 进行分析,了解其中微生物信息.这些通过遗传物质进行研究的分子方法,为微生态的研究开辟了新的途径,并已经得到广泛的应用.[关键词]微生物生态学;分子生物学技术;核酸杂交;PCR -DGGE;RF LP;F I SH[中图分类号]Q938 [文献标识码]A [文章编号]1673-8012(2007)04-0057-04 在DNA 分子技术出现之前,人们对微生物的认识大多数是直接观察来获得部分信息.1990年,W ard[1]等人利用对环境微生物的16Sr RNA 序列分析,揭示了环境中存在大量未能培养的微生物.因此,大量基于16Sr RNA 的分子微生物学方法被发展应用于复杂的微生物生态研究,以获取更多的微生物信息,从而推动了微生物生态学研究的进一步发展.下面就微生物生态学研究中一些分子生物学方法的应用进行介绍.1 基于PCR 技术的DNA 指纹图谱技术对于复杂或动态变化的微生物区系,例如肠道或者环境微生物区系,遗传指纹技术依据独特核酸物质的分离提供微生物群落多样性的图案或轮廓,在分析时有直观、快速、高通量的特点.1.1 PCR -DGGE /PCR -TGGEDGGE 技术是由Fischer 和Ler man 于1979年最先提出的,用于检测DNA 突变的一种电泳技术.它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异.1985年,Myers R M[2]等人首次在DGGE 中使用“cc 夹板”和异源双链技术,使该技术日臻完善.1993年,M uzyers [3]等首次将DGGE 技术应用于分子微生物学研究领域,并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和菌群差异方面具有独特的优越性.近年来,此技术被广泛应用于各种环境微生物生态的研究.其原理是:DNA 双螺旋解离条件与变性剂浓度相关,到达解离最低优选温度(T M )时,DNA 双链将部分解离,分开的DNA 将会使它在聚丙烯酰胺凝胶中的移动速度显著下降,而双螺旋部分解离的条件又是由DNA 碱基序列所决定的.因此,即使是大小相同,但碱基排列有差异的DNA 片段,在不同浓度梯度的变性剂(脲素和甲酰胺)凝胶中电泳,根据部分解离的条件不同,其移动速度不同而得到分离.通过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带.因此,该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片断序列差异,可以用于检测单一碱基的突变和遗传多样性以及PCR 扩增DNA 片段的检测.时间温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gel electr ophoresis ,TGGE )是在DGGE 基础上发展起来的,但它无须变性剂,更加简便、快速、易操作.通过物理温度的变化将双链DNA 部分解离,使其在电场中泳动速度发生变化,根据泳动速率的不同区分不同的微生物种类.该技术主要包括以下步骤:①样品的采集;②DNA 提取及纯化;③样品16Sr DNA 或18Sr DNA 片段的PCR 扩增;④选择最佳化学变性剂浓度范围核电泳温度时间进行分析;⑤制胶,染色⑥样品的DGGE /TGGE 分析.1.2 限制性片段长度多态性分析(RF LP )限制性片段长度多态性(Restricti on frag ment lengthpoly mor phis m ,RF LP )分析,最初用于有性繁殖后代的分离以构建遗传图(Botsteietal ,1980年),也是第一代以DNA 指纹图谱为基础用于微生物分型鉴定的方法.其原理是用限制性内切酶将细胞基因组DNA 进行切割,然后在琼脂糖凝胶上电泳分离,通过指纹图谱来检测分析基因组中内切酶限制性切点的变化,从而比较不同基因组之间的核苷酸差异,以显示不同种群基因组DNA 的限制性片段长度多态性.RF LP 产生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定.由于RF LP 产生的DNA 指纹图谱比较复杂,在分析菌群时耗时且费力,而且该技术依赖S outhern bl ot技术,需要克隆基因探针,DNA的用量大且纯度要求很高.因此,在应用此技术时,常与PCR技术结合,即PCR-RF LP 技术.此技术可以使图谱的带型简单化,易于分析.该技术主要包括的几个步骤:①选用r DNA的恒定区序列设计引物;②选择性扩增r DNA片断;③对扩增产物用适当的限制性内切酶进行酶切;④琼脂凝胶电泳分离产生限制性片断;⑤用所得到的指纹图谱进行分析,根据片段的大小以及标记片断种类和数量的不同,分析群落的结构及组成多样性.张旋等[4]人用该方法对204份体液标本中的菌进行了检测,结果与培养法相比,其灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为95.7%、88.6%、88.0%和99. 4%.PCR-RF LP在菌种鉴定中具有特异、敏感、快速、准确等特点,但对于混杂样品,如粪便标本中菌群的分析还需进行优化,如特异性引物的选择等.该方法常与标记的r RNA探针结合,进行核糖类型分析.如已经成功地用于B rucella、Hae m ophihls、L egionella等物种的鉴定.1.3 随机扩增DNA多态性分析(RAP D)随机扩增DNA多态性(RAP D)分析又称随意引物PCR(AP-PCR),是一种DNA指纹多态性分析技术.它应用随机设计的短的引物,通过PCR方法获得随机扩增的DNA片断,菌种之间DNA的变异可以通过RAP D片断大小和数量的不同加以区别.其理论依据是:不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列位点和数目可能不同,因而用人为设计的核苷酸作为引物,通过PCR随机扩增可产生物种特异性DNA 带谱.因此,RAP D技术可用于细菌种间、亚种间乃至株间的亲缘关系分析,未知菌株快速鉴定和流行病学调查等.V incent[5]等应用RAP D技术,采用5个不同单一引物反应对6种双歧杆菌进行区别,他们认为与传统方法相比,RAP D有用且快速.Kullen[6]等采用这种方法对从人体内分离的各种双歧杆菌进行鉴别.此外,RAP D的PCR产物还可作为探针,与Southern杂交技术结合,用于基因组或菌落杂交,可以填补基因组遗传图谱和物理图谱间的空缺.该技术的主要步骤:①细菌基因组DNA制备;②PCR引物选择;③聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳分离AP2PCR产物以及片段分析.1.4 扩增片段长度多态性(AF LP)AF LP是RF LP技术和PCR技术相结合发展而成的一种新型DNA指纹图谱技术.此技术作为一种新的分子技术,它依据RF LP的可靠性和PCR的高效性,其实质利用2种以上的酶,一种是罕见切割酶,一种是常用切割酶,切割DNA形成不同酶切位点的限制酶切片断,在所得到的酶切片段上加上双链人工接头,作为扩增的模板. AF LP对扩增引物作了修饰,从而实现选择性扩增,使某一品种中出现特定的DNA带谱,而在另一品种中可能无此带谱出现.扩增产物经变形聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示扩增片断长度多态性.AF LP技术通过特异性PCR引物设计和内切酶组合的选择,来调整AF LP图谱中限制性片段的适宜数目,具有一定的灵活性.严格的PCR条件和高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳,使AF LP重复性好,分辨率高.而且AF LP 标记具有比RF LP、RAP D标记更为可靠、有效地揭示微生物多态性水平的能力,为研究微生物属以下物种之间的亲缘关系,乃至菌株间差异提供了有效手段.但由于AF LP引物需要用同位素标记,给操作带来不便,目前,改进后用荧光素标记,即荧光素标记的扩增片段长度多态性,如对尿路菌、大肠埃希菌、空肠弯曲菌和不动杆菌在基因水平作出了鉴定[7].该技术的主要步骤:①样品染色体DNA的提取和纯化;②DNA的修饰和模板的制备;③AF LP反应;④聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物;⑤放射自显影及数据的数值分析.1.5 末端限制性片段长度多态性(T-RF LP)该方法实质是用荧光燃料标记PCR引物的5′端,对DNA片段扩增后,用适当的限制性内切酶消化PCR产物,然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳分离,再用荧光检测仪检测标记片段的大小、种类和数量,并用GeneScan软件加以分析.该方法可降低图谱的复杂性,使结果易于分析,且重复性好,结合克隆、测序,不仅可对已知菌进行鉴定,还有助于发现新的未知菌,是细菌培养或F I SH检测前大量筛查粪便标本菌群的有用方法.1.6 单链构象多态性(Single Stranded Confor mati on Poly2 mophis m,SSCP)分析SSCP在对细菌r DNA分析时经常与PCR结合,即PCR-SS CP.该方法灵敏度极高,能鉴别一个碱基的差异.在研究微生物多样性时,SSCP可将序列长度相同但碱基排列不同的片段区分开,这样不同种的微生物便可通过图谱显示出来.同时可以切胶纯化直接测序,与Gen Bank上的已知序列比较,得到特异的基因序列,从而达到分类的目的.此法的原理是:DNA单链构象具有多态性,由于碱基序列不同而影响其空间构象,它的正常序列与变异序列的单链构象不同,因此在电泳上的迁移率也不同.从而可以在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中来分析DNA单链中的基因突变.其主要步骤是:①提取细菌基因组DNA;②用PCR 扩增16Sr DNA或16S～23Sr DNA间隔区片段;③将特异的PCR扩增产物变性,而后快速复性,使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;④该单链DNA分子进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;⑤银染或放射自显影;⑥分析得到的特异指纹图谱,与标准菌株的图谱相比较,即可分析菌群,对菌株进行鉴定.亦可对特异条带回收、测序,进行菌种鉴定和分类.2 核酸杂交及其相关技术按碱基的互补配对原理,用人工方法对两条不同来源的单链核算进行复性(即退火),以构建新的杂交双链核算的技术,称为核酸杂交.此法用于DNA-DNA,DNA -r RNA,r RNA-r RNA分子间的杂交.核酸杂交是测定核酸分子同源程度和不同物种间亲缘关系的有效手段. 2.1 DNA-DNA/DNA-r RNA分子杂交DNA-DNA分子杂交的基本原理是根据双链DNA 分子解链的可逆性和碱基配对的专一性,将不同来源的待测DNA在体外分别加热使其解链成单链DNA,然后在合适条件下再混合,使其复性形成杂和的ds DNA,然后再测定其间的杂交百分率.DNA-DNA分子杂交的具体方法很多,常用的固体杂交法(直接法)是把待测菌株的ds DNA先解链成ss D2 NA,把它固定在硝酸纤维素滤膜或琼脂等固相支持物上,然后把它挂到含有经同位素标记、酶切并解链过的参照菌株的ss DNA液中,在合适的条件下,让它们在膜上复性,重新配对成新ds DNA.再洗去膜上未结合的标记DNA片段后,最终测定留在膜上杂合DNA的放射性强度.最后,以参照菌株自身复性的ds DNA的放射性强度值为100%,计算出被测菌株与参照菌株杂合DNA的相对放射强度值,此即期间的同源性或相似性强度.DNA-DNA杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径,解决了以表型特征为依据所无法解决的一些疑难问题.但对于许多属以上分类单位间的正确关系及细菌进化问题仍不能解决,这就需要研究RNA的碱基序列.实验表明,在细菌细胞中RNA碱基序列的变化比整个基因组的变化要慢得多,保守得多,这是因为RNA的功能一直没有发生变化.如果两菌株的关系比较近,用DNA-DNA杂交方法可判断它们是一个种还是属于关系比较近的两个种.如果两株菌的关系比较远,它们的DNA不能杂交,这时就应该研究它们的RNA的碱基序列的相似性.通过研究RNA碱基序列的相似性,可以把细菌各群之间的关系追溯得很深很远.在以往的20年中,DNA-r RNA杂交方法主要用于解决革兰氏阴性菌之间的分类关系.De Leg等花了10多年时间,用DNA-r RNA杂交方法研究了上千株属于不同科属的400多种菌株,最后根据RNA相似性图把它们分成5个r RNA超科,每个超科中都有许多r RNA类似的分支.Stachebrandt 等也将DNA-r RNA杂交技术应用于放线菌的分类中,他们的实验进一步证实了DNA同源性在20%以上的不同种,可被认为是关系比较密切的同一属的种.Denis Roy等人[8]用此法对73株乳酸菌进行了分类鉴定,并说明它们之间的亲缘关系.2.2 荧光原位杂交技术(F I SH)荧光原位杂交(F I SH)技术是根据已知微生物在不同分类级别上种群特异的DNA序列,以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针,与环境基因组中DNA分子杂交,检测该特异微生物种群的存在与丰度.该方法的特点是可以进行样品的原位杂交,应用于环境中特定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测等.它提供了微生物形态学、数量、空间分布与环境方面的信息,可以对自然生态环境中的微生物进行动态地观察与鉴定.目前,基于16Sr DNA的荧光原位杂交被广泛应用于定量环境微生物生态系统中的细菌.此法结合荧光标记的16Sr DNA探针和表面荧光显微镜,或者流式细胞仪直接定量微生物区系中的细菌[9].在肠道微生物区系组成研究中,荧光原位杂交结合不同的特异性探针已被用于定量不同种属的胃肠道细菌,包括拟杆菌、双歧杆菌、乳杆菌、链球菌、梭菌、真杆菌和瘤胃球菌[10].但F I SH技术的应用要受到环境样品微生物的生理状态的影响,如芽孢、放线菌及休眠时期细胞的细胞膜通透性降低,都会影响群落中部分种属丰度的正确估计,而且不能检测出环境样品中的未知种属.3 r RNA基因序列同源性分析r RNA在所有的微生物中,功能和进化上是同源的,同源物种之间r RNA结构是相当保守的.因此,为了确定一个分离物为一个分类单元,或证明属于一个新的分类单元,r RNA基因序列分析还是最可靠的方法.基因同源性分析方法综合应用多种分子生物学技术,如DGGE/ TGGE、基因文库的筛选、序列的测定及其分析等对微生物中r RNA基因进行分析,揭示微生物多样性,被广泛地应用于微生物多样性的研究中.3.1 r RNA技术16Sr RNA扩增片段核苷酸序列分析技术是分子微生物生态学研究最早应用的方法之一.目前,已有上百个物种的部分或者全部16Sr RNA序列已经探明,几乎所有已知细菌的16Sr RNA碱基序列已被测定并存入基因库.它在分子微生物系统学、微生物的分类鉴定等研究方面作出了重要贡献,使微生物学家对原核生物系统发育有了新的认识,导致了三界系统的出现,也为物种之间亲缘关系的鉴定找到了更为迅速有效的手段.16Sr RNA序列分析主要步骤:①提取基因组DNA;②利用16Sr RNA基因两端的保守序列作为PCR的引物, PCR扩增且纯化;③以PCR的产物为模板直接进行16Sr RNA序列分析;④T A克隆建库或直接测序;⑤用BLAST对所得序列进行比对分析.r RNA序列分析技术与其它分子生物技术以及传统的纯种培养相结合,具备分析微生物多样性及其发现新物种的能力,而且提供了一种摆脱传统的纯种培养方法鉴定环境微生物的途径,并已被广泛应用于对诸如共生细菌和古细菌(其中包括医学上对病原菌的检测和鉴定)、趋磁细菌、海洋微型浮游生物以及土壤细菌等微生物类群的研究,并发现了众多未知的新序列.但是在实际应用中,存在基因文库构建、全部序列测定周期长,工作量大,费用高等问题.3.2 16S～23Sr RNA基因间隔区序列16Sr RNA在原核生物中高度保守,对于相近种或同一种内的不同菌株之间的分辨率低.23Sr RNA分子比较大(约3000bp左右),并且只有少数种的核酸序列有报道,尚未在细菌的分类核鉴定中得到广泛应用.而16S～23Sr RNA间隔区(I ntergenic s pacer regi on,I SR)由于没有特定功能核进化速率,比16Sr RNA大10倍,近年来在细菌鉴定核分类方面备受关注.r RNA间隔翻译区核苷酸序列分析方法的检测方法同16Sr RNA,利用PCR技术直接从所分离到的菌株进行I TS标记,引物则采用针对将16Sr RNA和23S r RNA基因分开通用保守区的序列.Anu Til—sala—Ti m isjarvi等人[11]首先利用这种方法,分别设计出针对Lact obacillus paracasei,Lact obacillus rh—0m,sl act obaci U us del2 brueckii,Lact obacillus aci—dophilus,Lact obacillus helvetic2 us和Strep t ococcus ther mophillus的特异性引物,来对这些菌株进行鉴定,目前在临床和流行病学上应用非常广泛.分子生物学研究技术给比较微生物生态学的研究带来了光明的前景,它的应用克服了微生物培养技术的限制,能对样品进行客观地分析,更精确地解释微生物种类和遗传的多样性.但在实际的解决问题过程中,各种方法所能解决的问题各有侧重,如核酸杂交或荧光原位杂交可以测定菌群中特定菌种的丰度及分布,指纹图谱技术可以分析菌群结构,r RNA序列分析可以在基因水平鉴定菌群的组成.因此,各种方法综合利用,可以更加全面地提供群落组成及其变化方面的信息.[参考文献][1]W ard DM,W eller R,Bates on MM.16Sr RNA sequencesreveal nu mer ous uncultured m icr oorganis m s in a natural community[J].Nature,1990,345:3673-3682.[2]M yers R M,Fischer SG,Ler man LS,et al.Nearly all sin2gle base substituti ons in DNA 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i fe Sc i ence,Hena n No r m a l U ni ve rs ity,Xi nxi ang He nan453007,C h i na;2.S choo l o f L i fe Sc i ence,So uthw e s t U ni ve rsity,B e i be i C hongqi ng400715,C h i na)Abstract:Because of the difficulty ass ociated with traditi onal is olating and culturing bacteria,but the molecu2 lar techniques based on culture-independent techniques,extract directly the variable genom ic DNA fr om m icr obial sa mp les and then analysis the genetic infor mati on,by the a mp lificati on of poly meric chain reacti on (PCR)nucleic acid hybridizer RNA sequence and other methods.A t p resent,these molecular techniques have opened up the ne w way and been widely used in the research of m icr obial ecol ogy.Key words:m icr obial ecol ogy;molecular techniques;nucleic acid hybridize;PCR-DGGE;RF LP;F I SH。
