实时荧光等温扩增技术

实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。

但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。

但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。

例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。

在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。

1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。

在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。

等温扩增是PCR的补充还是代替？？来看看他们的优劣势！近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于人类疾病的实验室检测中，等温扩增技术便是其中一种，与其他的核酸扩增技术相比，等温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用的设备，所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR媲美的检测方法。

相信以等温核酸扩增技术为基础的诊断仪器和试剂盒的开发和应用会是未来一，二十年的方向。

本文总结了目前常见的等温核酸扩增技术：LAMP、NERA、NASBA、RCA、HDA、RPA和ERA。

同时对PCR和几种恒温核酸扩增技术进行了比较。

为了更好地有选择地开发利用这方面技术，现就这些等温扩增技术的原理、特点及应用进行简要总结。

聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（PCR）是利用耐高温的DNA聚合酶（Taq 酶），将模板DNA，引物，脱氧核苷三磷酸（dNTP）和缓冲液等在不同温度间循环，从而达到双链DNA分离，引物粘合到模板上的互补区间，最后在DNA聚合酶作用下脱氧核苷三磷酸逐个添加到新合成的DNA 链上的过程。

PCR是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

环介导等温扩增 (LAMP )环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3`末端末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。

实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。

它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。

二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。

实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。

根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。

实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。

三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。

（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。

实时荧光恒温扩增技术实验流程实时荧光恒温扩增技术是一种常见的分子生物学实验技术，常用
于检测DNA序列的扩增、定量和分析。

其实验流程大致如下：
1. 样品制备：将待分析的DNA样品获取并纯化，通常采用常规的
提取方法，如血液、组织、细胞等。

2. 扩增反应体系：制备PCR反应混合液，包括DNA模板、引物
（一对）和扩增酶等，其中引物的设计及选择需根据具体实验需要。

3. 反应条件设定：设定反应的温度和时间等参数，如反应温度通
常设在60-65°C左右，时间取决于扩增片段的长度和PCR反应的效率。

4. 实时监测反应：在恒温扩增仪中，根据反应体系的不同，选择
合适的荧光染料，实时监测扩增过程，可得到扩增曲线，确定扩增产
物的数量和质量等信息。

5. 数据分析：根据实时监测得到的扩增曲线，可利用软件对扩增
产物的数量、含量进行定量和分析，比如利用常用的标准曲线法等方法。

总之，实时荧光恒温扩增技术是一种高效、快速、灵敏的分子生
物学实验技术，可广泛应用于医学、生物学等领域，为许多研究提供
了有力的工具。

实时荧光核酸恒温扩增技术在妇女生殖道病原体感染诊断中的应用价值摘要】目的：分析实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)在妇女生殖道病原体感染诊断中的应用价值。

方法：我院2015年1月至2017年12月疑似生殖道病原体感染的女性患者200例为研究对象，分别采取免疫层析胶体金检测法、SAT比较沙眼衣原体（CT）的阳性检出率。

采用培养法和SAT比较解脲支原体（UU）的阳性检出率，采用SAT检测生殖支原体（MG）的阳性率。

结果：在CT检测中SAT的阳性率为6%，胶体金阳性率为4%，经卡方检验，χ2=0.01,P>0.05差异无统计学意义。

对4份SAT阳性而胶体金阴性的差异样本进行双脱氧酶终止法检测，结果：4份均为阳性。

在UU检测中SAT的阳性率为35.5%，培养法阳性率为30.0%，经卡方检验，χ2=0.01,P>0.05差异无统计学意义。

对4份培养阳性而SAT阴性的差异样本进行双脱氧酶终止法检测，结果1份为阳性，3份为阴性；对15份培养阴性而SAT阳性的差异样本进行双脱氧酶终止法检测，结果14份为阳性，1份为阴性。

SAT检测MG的阳性率为3.5%（7/200）。

结论：培养法是UU检测的临床金标准，然而却存在一定的不足之处，如费时、操作繁琐、敏感性低等，更需要进一步确认。

胶体金法检测CT则耗时较长，且检测工艺较为繁琐。

采用SAT检测女性生殖道沙眼衣原体、解脲支原体、生殖支原体具有较好的应用效果，检测时间短、成本低，在临床可作为病原体感染判断依据。

【关键词】实时荧光核酸恒温扩增技术；病原体感染；生殖道【中图分类号】R711 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）30-0126-02解脲支原体（UU）、沙眼衣原体（CT）、与生殖支原体（MG）为临床中泌尿生殖道疾病的常见致病病原体，正确的诊断疾病的感染类型，实施针对性治疗是对抗女性生殖道病原体感染疾病的重要途径[1]。

以往采取培养法检测，但现有研究提出SAT在病原体诊断中具有更好的效果，敏感度更高[2]，为进一步探索SAT在CT、UU、MG 3种病原体感染中的诊断价值，本研究将SAT与其他检测方法进行对比，获得一些收获，现将本研究报道如下：1.资料与方法1.1 一般资料我院2015年1月至2017年12月女性患者共200例为研究对象。

在实验室检测核酸的方法
实验室中常用的检测核酸的方法有以下几种：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种常用的核酸检测技术，主要用于扩增目标DNA序列。

通过PCR可以在短时间内扩增出大量目标DNA，使其能够被进一步分析和检测。

2. 实时荧光定量PCR（qPCR）：qPCR结合了PCR和荧光探针技术，可以在PCR的同时进行定量检测。

通过检测PCR反应过程中荧光信号的强度，可以实时监测并定量目标核酸的数量。

3. 等温扩增：等温扩增是一种在常温或接近常温下进行的核酸扩增方法。

常用的等温扩增方法包括LAMP（循环介导等温扩增）和RPA（递归螺旋扩增）等。

等温扩增技术具有快速、敏感、简便等特点。

4. 测序技术：测序技术是一种用于确定核酸序列的方法。

常用的核酸测序技术包括Sanger测序和新一代测序技术（如Illumina测序、Ion Torrent测序等）。

这些技术可以通过对目标核酸序列进行测序，实现对其序列信息的分析和检测。

5. Northern blot：Northern blot是一种利用电泳分离和检测RNA的方法。

通过将RNA样品经过电泳分离后，利用亲和性探针进行靶向检测，可以确定目标RNA在样品中的存在和相对数量。

这些方法在实验室中广泛应用于核酸的检测和分析，并且可以根据具体需求进行选择和组合使用。