实验33 过氧化氢酶的活性测定
目的意义
过氧化氢酶（catalase，CAT）普遍存在于植物所有的组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定联系，故常加以测定。
本实验的目的在于掌握过氧化氢酶活性测定的方法、原理及操作技术。
一、高锰酸钾滴定法
（一）原理
过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂，因此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准KMnO4溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5H2O2 + 2KMn04 + 4H2SO4 ──→ 502 + 2KHS04 + 8H20 + 2MnS04
（二）实验材料、仪器与试剂
1. 实验材料：小麦叶片。
2. 仪器：恒温水浴、研钵、三角瓶、酸式滴定管、容量瓶等。
3. 试剂：
（1）10％ H2SO4
（2）0.2mol·L-1 pH 7.8磷酸缓冲液
（3）0.lmol·L-1 KMnO4标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，再用0.lmol·L-1草酸溶液标定。
（4）0.lmol·L-1 H2O2：市售30％ H2O2大约等于17.6 mol·L-1，取30％ H2O2溶液5.68mL，稀释至1000mL，用标准0.l mol·L-1 KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。
（5）0.lmol·L-1草酸：称取优级纯H2C2O4·2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000mL。
（三）操作步骤
1. 酶液提取：称取小麦叶片2.5g加入pH 7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容至刻度，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
【高中生物】高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定
高中生物
实验：过氧化氢酶活性的测定
原理
过氧化氢酶广泛存在于所有植物组织中。它能将过氧化氢分解为氧气和水，保护生物体免受过氧化氢的毒性影响。测定过氧化氢酶的方法包括测压法、滴定法和分光光度法。氧电极法是一种灵敏、快速的氧释放速率测量方法。氧释放速率与过氧化氢酶活性成正比。
仪器药品
氧电极记录仪
电磁搅拌器 超级恒温水浴
注射器、微量注射器和容量瓶
反应杯 亚硫酸钠
过氧化氢酶
50mmol/l磷酸缓冲液，ph7.0(见附表2)。
50mmol/L过氧化氢溶液：取30%过氧化氢1.4ml，用磷酸缓冲液稀释至250ml。
标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(sigma)1.0mg(110u/mg)，溶于50mmol/l磷酸缓冲液(ph7.0)11ml中，使酶浓度为10u/ml。
操作步骤
1.仪器的标定
按照实验步骤88校准仪器，以获得记录纸上每个小网格的等效氧含量。
2.绘制酶活性标准曲线
（1） 在反应杯中加入过氧化氢磷酸缓冲液，打开电磁搅拌器搅拌10分钟，插入电极，吸收电极外溢出的溶液，调整换档旋钮，使记录笔约满刻度的10-20%，使记录纸四处移动，温度在1-2分钟后达到平衡，记录笔画出一条直线。
(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110u/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。 （3） 按照上述相同步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μL（例如，浓度为20、30、40、50U/ml），并记录氧释放曲线。
(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。
（5） 以过氧化氢酶活性单位为横坐标，以每分钟释放的氧气量为纵坐标绘制标准曲线。
过氧化氢酶活性测定实验报告
实验目的，通过测定过氧化氢酶活性，探究不同条件下过氧化氢酶的活性变化规律，为进一步研究过氧化氢酶的功能和应用提供实验数据支持。
实验原理，过氧化氢酶是一种重要的酶类，在生物体内起着重要的氧化还原作用。本实验采用比色法测定过氧化氢酶活性，其原理是过氧化氢酶催化过氧化氢分解成水和氧气，过氧化氢酶活性与生成的氧气量成正比。
实验材料与方法，实验中所需材料包括过氧化氢酶、过氧化氢、磷酸盐缓冲液、吡啶甲酸钠盐等。首先，按照一定比例将过氧化氢酶和过氧化氢混合，然后加入磷酸盐缓冲液和吡啶甲酸钠盐，使混合液在一定温度下进行反应。接着，通过比色法测定生成的氧气量，进而计算出过氧化氢酶的活性。
实验结果与分析，在不同温度、pH值、底物浓度等条件下，测得过氧化氢酶的活性数据。通过对比分析不同条件下的活性数据，发现过氧化氢酶在不同条件下呈现出不同的活性变化规律。在温度较低时，过氧化氢酶活性较低；在酸性环境下，过氧化氢酶活性受到抑制；随着底物浓度的增加，过氧化氢酶活性呈现出逐渐增加的趋势。
结论与讨论，通过本实验，我们得出了过氧化氢酶活性与温度、pH值、底物浓度等因素之间的关系。这些结果对于深入研究过氧化氢酶的功能机制，以及在生物医学、生物工程等领域的应用具有一定的指导意义。同时，我们也发现过氧化氢酶在不同条件下表现出不同的活性变化规律，这为进一步探究过氧化氢酶的调控机制提供了重要的实验数据支持。
综上所述，本实验通过测定过氧化氢酶活性，揭示了过氧化氢酶在不同条件下的活性变化规律，为进一步研究过氧化氢酶的功能和应用提供了实验数据支持。希望本实验结果能够为相关领域的研究工作提供一定的参考价值。
过氧化氢酶活性测定
过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
紫外吸收法
一、原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与设备与试剂】
1、材料
小麦叶片等。
2、仪器设备
研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；
3、试剂
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
【方法】
1.酶液提取：
称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2.酶活性测定
取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。
表2-14-1 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管 号 S1 S2 S3 管号 S0 S1 S2
粗酶液(ml) 0.2 0.2 0.2 蒸馏水/ml 1.0 1.0 1.0
pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5
将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入0.3ml
0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
