海军总医院学报年月第卷第期鬓翼蒸基因工程抗体的体外亲和力成熟汪保安王攻海军总医院中心实验科北京以刃摘要抗体库技术的出现使得改造基因工程抗体更方便更有效利用不同方法在抗体基因中引人突变构建抗体突变库通过筛选过程在体外模拟抗体生成过程进行体外亲和力成熟关键词抗体突变亲和力成熟中图分类号文献标识码文章编号姗义阵胆抗体技术的发展到现在已经历了三代第一代多克隆抗体直接由抗原免疫动物获得第二代单克隆抗体通过杂交瘤技术获得第三代基因工程抗体开始于用重组技术改造抗体包括小分子抗体如〕及双多价或双持异性抗体抗体融合蛋白等世纪年代初出现了抗体库技术使抗体工程进人了新的阶段抗体库技术的出现不仅使人们可在体外模拟抗体生成过程使人源抗体的制备获得突破而且对抗体性能的改善提供了强有效的技术手段其中包括在体外通过突变建库筛选过程提高抗体的亲和力抗体的体外亲和力成熟是在体外模拟抗体的体内成熟过程即以某种抗体为改造模板通过构建其突变体库对突变体库进行筛选获得生物特性大大改善的抗体体外抗体亲和力成熟包括以下方面对低亲和力抗体可变区基因进行突变产生高亲
和力变种有效的筛选方法使高亲和力克隆优势选择即通过随机方式引人多样性经由筛选步骤富集扩增并最终筛选出亲和力提高的变种现对这些方法和技术综述如下抗体基因突变体内抗体的亲和力成熟是机体在初次抗原的刺激下产生低亲和力抗体在随后抗原的刺激下抗体可变区基因发生体细胞突变可产生高亲和力变种而高亲和力的变种具有选择优势而被最终选择在体外可通过以下多种方法使抗体基因发生突变致突变株大肠杆菌细胞内突变常用的大肠杆菌突变株是此菌株的聚合酶缺乏的校正性外切酶活性因而造成突变率较正常菌株高护一护倍其引发的突变在整个抗体可变区中随机分布突变类型主要是单碱基置换只有很少量的单碱基移码突变将带有抗体可变区基因的载体转化到此菌株中培养一段时间后可得到突变抗体库川〕等利用对一株单链抗体进行了胞内突变经筛选得到亲和力提高倍的突变体但这种突变方法需要长时间的稀释传代培养才能达到合适的突变率从而获得性能改善的变种川错配多聚酶链反应在标准多聚酶链反应的基础上适当改变反应条件可提高核昔酸的错配率是造成基因突变的一种有效方法增加聚合酶的用量至风可促进延伸链在碱基错配位置继续延伸提高才的浓度可以稳定错配的减基对增加三磷酸脱氧胞昔和三磷酸脱氧胸昔‘甲的浓度可以促进碱基错误掺人添加平可降低聚合酶对模板的特异性应用这些措施可使错配率达到一左右医利用高错配倾向的扩增可变区基因对其进行随机突变构建它的次级突变库替换替换是一种体外同源重组技术先将多种同源核昔酸序列组成的混合模板用工随机片段化产生不同的末端在不加入引物的反应中它们互为引物扩增出一段较长的核昔酸产物以此为模板利用加人两端引物的反应扩增出基因重排的全长产物此过程可将不同核昔酸序列上的突变点随机组织在一条核昔酸链上使不同核昔酸序列上的突变点发收稿日期《
三、 体外基因表达水平的分析（讨论稿）：
近年来的科学研究越来越多地将疾病与mRNA的表达水平联系起来，所以越来越多的实验者在进
行研究时，除了进行免疫组化、Western、Elisa等蛋白水平的定量和定性实验，往往会进一步深入研
究基因表达与疾病变化的关系。 与PCR相关的技术包括：RT-PCR，巢式PCR，反向PCR，不对称PCR，原位PCR等。
（一）、单基因半定量RT-PCR实验：
在细胞内mRNA的表达水平直接与蛋白的表达水平相关，所以实验者往往是检测某基因
mRNA的表达与某种疾病的相互关系，从而研究并探讨疾病的致病机理。
1、RT-PCR实验：
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
A）、巢式PCR：巢式PCR既是采用巢式引物进行的PCR实验，在实验过程中不管是内参
基因还是目的基因，均设计成巢式引物。巢式引物一般有4条引物（上游两条，下游两条），进行
一次PCR扩增时，可以有三种组合，如果进行两次扩增，还可以有五种组合，合计共有9种组合。
这不仅使实验成功机率会大大提高，还可以加快实验的速度，节约时间。更重要的是提高扩增的特
异性，在一次被扩增的产物中，只有在其序列中有内侧引物结合位点地扩增片段，才能在第二次PCR中被扩增，否则不被扩增。这对表达相当低的目的基因mRNA的扩增，这几乎是唯一的选择。 B）、定量法：
定量PCR技术有广义和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以内参或外参为标准，通过
对PCR放大后的DNA产物的含量来推导原来标本中特定DNA或mRNA的含量。
所谓外参法是指样本与阳性参照在两个反应管中进行。内参法是指样本与阳性参照在同一个反
应管内进行。外参法未对样品进行质控监测，也未监测扩增效率，定量不准。内参法能对样品进行
质控监测，样本与阳性参照也能保持相同的扩增效率，但无法保证每管中起始模板数相同，难以进
行对比分析，下面简单说明一下外参法和内参法的优缺点： 1）、选择一种作为内标准的模板将其测定出绝对含量后，作一系列稀释，然后将样品cDNA
基因工程与基因体外表达复习提纲
一、 名词解释
1. DNA 重组
2. 基因克隆
3. 基因工程
4. 限制性内切酶
5. 粘性末端
6. DNA聚合酶I
7. 逆转录酶
8. 连接酶
9. 载体 10. 克隆载体
11. 表达载体
12. 质粒
13. λ噬菌体载体
14. 病毒载体
15. 酵母人工染色体
16. 重组病毒
17. 基因组文库
18. cDNA文库 19. 转化
20. 转染
21. 蓝白筛选
22. Tac启动子
23. T7启动子
24. 成熟型表达
25. 融合型表达
26. 分泌型表达
二、 问答
1. 基因工程常用的工具酶有哪些？其主要用途是什么？
2. 基因工程常用的载体有哪些？各自有什么提点？
3. 请简要阐述基因克隆的基本流程。
4. 基因的体外表达有哪些主要方式？
第十三章 基因工程与基因体外表达
第一节 基因克隆
一．限制性核酸内切酶
二．基因克隆中具有不同功能的工具酶
第二节 基因克隆中特定的DNA载体
一．常用克隆载体（质粒和病毒）
二．表达载体将外源基因带入宿主并进行表达
第三节 基因克隆的过程
一．获取目的基因
二．选择和准备载体
三．DNA片段的连接
四．重组DNA导入宿主细胞进行扩增
五．筛选与鉴定
第四节 真核细胞基因转染
一．真核细胞转染的方法与原理
二．转染细胞利用抗性标记进行筛选
第五节 利用重组DNA技术对基因进行改造
一．对特定基因的定点诱变
二．利用基因定点诱变技术改变基因工程蛋白的特性
第六节 克隆基因在适当的宿主细胞表达
一．大肠杆菌表达系统
二．哺乳动物细胞外源基因的表达
三．其他宿主细胞中也表达制备真核蛋白
第七节 电子克隆
本章重点:
掌握：DNA克隆概念，限制性内切酶的定义及其特点，基因载体的种类。重组DNA技术的基本过程，目的基因获取的方法，外源基因与载体的连接方式，重组DNA分子导入受体菌的方式，重组体筛选的方法。
熟悉：基因组DNA文库和cDNA文库的概念，目的基因表达体系的种类及其特点
了解：自然界基因转移的方式：接合作用、转化及转导作用、转座；重组有两种类型，即位点特异性的重组和同源重组
本章难点
两种类型基因重组的机理；限制性内切酶的作用特点，基因载体的种类；重组DNA技术的基本环节中，目的基因的获取方法，外源基因与载体连接的方法，重组DNA导入受体菌的方法，重组体的筛选方法，以及原核和真核表达体系的优缺点比较
核心词：DNA重组 基因克隆 载体 宿主细胞
基本概念：
DNA重组（DNA recombination）：不同来源DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子的过程。
基因克隆（gene cloning）：主要是进行制备DNA片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制，扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝的过程。
