双黄连口服液化学成分含量测定及指纹图谱研究

黄连HPLC数字化指纹图谱研究及7种生物碱含量测定一、本文概述本文旨在通过高效液相色谱（HPLC）技术对黄连的数字化指纹图谱进行深入研究，并精确测定其中7种主要生物碱的含量。

黄连作为一种重要的中药材，具有清热解毒、燥湿止痢等功效，被广泛应用于中医临床。

其药效与其中的生物碱类成分密切相关，因此对黄连中生物碱的深入研究对于评价黄连质量、指导药材合理使用及优化生产工艺具有重要意义。

本研究将通过HPLC技术的精确分析，构建黄连的数字化指纹图谱，明确各生物碱在黄连中的含量，为黄连的质量控制提供科学依据。

本文还将探讨黄连中生物碱含量与其药效之间的关系，为黄连的药效评价和药物研发提供新的思路和方法。

二、材料与方法黄连药材购自全国各地具有代表性的药材市场，并经专家鉴定确保其质量。

甲醇、乙腈等色谱纯试剂购自公司，磷酸等分析纯试剂购自公司。

7种生物碱标准品（小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱、表小檗碱、非洲防己碱、木兰花碱）购自公司，纯度均大于98%。

高效液相色谱仪（HPLC，型号：）配备二极管阵列检测器（DAD）及化学工作站；电子分析天平（精度：01mg）；超声波清洗器；旋转蒸发仪；离心机等。

将黄连药材粉碎成细粉，过目筛。

精密称取粉末适量，加入甲醇，于室温下超声提取分钟，离心后取上清液，用甲醇定容至一定体积，得黄连提取液。

色谱柱为C18柱（mm×mm，μm）；流动相为乙腈-磷酸水溶液（梯度洗脱）；检测波长设定为nm；柱温为℃；进样量为μL；流速为mL/min。

将黄连提取液按设定的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图。

采用相似度评价软件对所得色谱图进行预处理和相似度计算，构建黄连的HPLC数字化指纹图谱。

精密称取7种生物碱标准品适量，分别用甲醇溶解并定容至不同浓度，按设定的色谱条件进行HPLC分析，记录峰面积。

以峰面积为纵坐标，生物碱浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

将黄连提取液按设定的色谱条件进行HPLC分析，根据标准曲线计算各生物碱的含量。

专利名称：一种双黄连口服制剂指纹图谱测定方法专利类型：发明专利
发明人：高燕,吕凌,刘青,丁晓彦,赵渤年
申请号：CN201810278928.4
申请日：20180330
公开号：CN108760903A
公开日：
20181106
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，属于药物分析技术领域。

该测定方法通过以下步骤实现：制备对照品溶液、供试品溶液，最后利用高效液相色谱‑质谱进行分析检测。

本发明采用不同的洗脱条件分进行HPLC检测，达到了良好的分离效果。

本发明选用外加内标法，对含有内标物质的供试液进行指纹图谱的测定，采用共有峰与内标峰的相对峰面积比值作为该指纹图谱的数学表达，这样比通常选用中药自身成分做参照计算各共有峰的相对峰面积，更能体现各共有峰含量的绝对变化与相对变化。

申请人：山东省中医药研究院
地址：250014 山东省济南市历下区燕子山西路7号
国籍：CN
代理机构：济南泉城专利商标事务所
代理人：李桂存
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双黄连口服液化学成分研究进展双黄连口服液化学成分研究进展摘要：双黄连口服液是由金银花、黄芩、连翘组成的纯中药制剂口服液，在临床上广泛应用于呼吸道疾病等的治疗。

本文通过总结分析金银花、黄芩、连翘的水提物化学成分以及双黄连口服液的化学成分，以期为双黄连口服液的进一步开发利用提供依据。

关键词：双黄连口服液；金银花；黄芩；连翘；化学成分双黄连方剂由银翘散（《温病条例》）精简化裁而来，是由金银花、黄芩、连翘组成，方中金银花为君药，辅以黄芩、连翘，具有辛凉解表、清热解毒的功效[1]。

双黄连口服液的主要成分有黄芩、连翘、金银花。

其中黄芩性寒、味苦,它有清热燥湿、清热解毒的功能，并且在治疗甲型性流感方面其黄芩水煎剂有着良好的抗病毒效果;连翘味苦、性微寒，有泻火、清热、的功能，是一种抗微生物的中药,十分适用于治疗风热感冒；金银花性寒、味甘，善于消除肺经邪热，有抑制柯萨奇病毒、埃可病毒、流感病毒的功能，还能减缓由病毒造成的细胞病变过程，十分适用于治疗风热感冒。

临床实践证实，双黄连在治疗细菌性呼吸道感染方面的效果良好，既能患者体征得到改善又能消除病原菌。

总而言之，双黄连口服液是治疗呼吸道感染的有效辅助药[2]。

双黄连口服液临床曾用于包括呼吸道感染、肺部感染、胃肠道疾病、肝胆疾病、泌尿系统疾病、妇科疾病、口腔疾病、皮肤科疾病、眼科疾病等疾病的治疗，疗效确切[3]。

双黄连口服液制备时按处方称取药材，用常水冲洗干净，加适量水煎煮2次，第一次煮1.5小时，第二次1小时，合并两煎液过滤，滤过减压浓缩至适量、冷至室温、加入2倍量95%乙醇充分搅拌冷放( 4~6℃)24小时滤除沉淀，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味加入稀释加入适量单糖浆及防腐剂并加水至足量搅匀、过滤分装，100℃流通蒸汽灭菌30分钟即得[4]。

因此，我们分析比较金银花、黄芩、连翘的水溶性化学成分与双黄连口服液的化学成分，期望从中找出能够抗菌、抗病毒、增强免疫功能的活性成分。

双黄连口服液中多种有效成分测定张斌【摘要】目的:建立HPLC法同时测定双黄连口服液中绿原酸、栀子苷、丹皮酚和黄芩苷的含量.方法:采用安捷伦C18的色谱柱(4.6mm×150mm,5μm),流动相采用乙腈-0.6％磷酸的水溶液,梯度洗脱的流速为1.0mL·min-1,色谱柱温为30℃,检测波长分别为238nm(栀子苷),274nm(丹皮酚),280nm(黄芩苷),327nm(绿原酸).结果:绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚进样量分别在0.005～0.173μg(r=0.9998)、0.026～1.231μg(r=0.9995)、0.041～1.682μg(r=0.9997)、0.006～0.249μg(r=0.9994)与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率(n=6)分别为98.24％、99.10％、98.46％、98.65％,精密度RSD均小于1.0％,重复性RSD均小于1.0％,供试品溶液放置24h内稳定.含量测定的结果表明了不同生产企业之间各成分的含量不尽相同,部分生产企业不同生产批次之间也有较大的差异.结论:本法适用于同时测定双黄连口服液中绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚的含量.【期刊名称】《化工中间体》【年(卷),期】2017(000)011【总页数】3页(P137-139)【关键词】双黄连口服液;绿原酸;栀子苷;黄芩苷;丹皮酚;HPLC【作者】张斌【作者单位】西北民族大学化工学院甘肃 730030【正文语种】中文【中图分类】R双黄连口服液于中国药典2005、2010、2015版中均有收录，其具有辛凉解表，疏风解热作用，适用于感冒所引起的咳嗽、发热、咽痛。

处方由金银花、连翘、黄芩这3味药材组成，标准规定是以栀子苷和黄芩苷为指标成分，利用HPLC法测定其含量，但不能有效的多样的测定其内部含量。

目前中外文献中关于双黄连口服液的含量测定已有很多的研究和报道，但是大多都集中在测定其某种单一成分的含量，仅有少数的研究和报道使用单波长测定2-3个成分的含量，鲜有同时测定其四种或以上成分的报道，而且测定药品中各种成分所需要的色谱条件也都不尽相同。

实验八高效液相色谱法测定双黄连口服液中黄芩苷的含量一、目的要求1．练习使用高效液相色谱仪2．学会用外标法定量分析二、实验原理外标法可分为外标一点法、外标二点法及标准曲线法。

当标准曲线截距为零时，可用外标一点法进行定量。

利用高效液相色谱法进行分离双黄连口服液中的黄芩苷，在λmax274nm 处进行检测。

在药物分析中，为了减小实验条件波动对分析结果的影响，采用随行外标一点法定量，即每次测定都同时进对照品与供试品溶液。

三、仪器与试药1．仪器高效液相色谱仪、超声波提取器、分析天平、微量注射器、ODS-C18反相色谱柱、容量瓶（25ml，50ml）2．试药黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所）、双黄连口服液（三精制药）、甲醇（色谱纯）、冰醋酸（A·R）、双蒸水。

四、实验内容与步骤1．色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇－水－冰醋酸（50：50：1）为流动相；检测波长为274nm。

理论塔板数按黄芩苷峰计应不低于1500。

2．对照品溶液的制备精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含0.1mg 的溶液，0. 45μm滤膜滤过，即得（浓度为0.1216mg/ml）。

3．供试品溶液的制备精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20分钟，放置至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，0. 45μm滤膜滤过，即得。

4．样品测定分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1ml含黄芩以黄芩苷计不得少于8mg。

五、思考题1、HPLC中常用的定量方法有几种？外标一点法有何优缺点？2、紫外检测器的优缺点是什么？教你如何用WORD文档(2012-06-27 192246)转载▼标签：杂谈1. 问：WORD 里边怎样设置每页不同的页眉？如何使不同的章节显示的页眉不同？答：分节，每节可以设置不同的页眉。

文件――页面设置――版式――页眉和页脚――首页不同。

双黄连口服液的质量分析一、实验目的1.掌握对照品对照法和对照药材对照法鉴别复方制剂中药材的方法。

2.掌握双黄连口服液中金银花、黄芩和连翘的质量检验方法。

二、仪器与试药1.仪器美国PE-60型高效液相色谱仪KQ-300E型超声波清洗器Mettler AL204电子天平ZF-2型三用紫外仪HHS型电热恒温干燥箱容量瓶规格：25mL 移液管规格：25mL 滤纸规格：直径10cm研钵硅胶G薄层板聚酰胺薄膜(5cm×7cm)2..试药双黄连口服液规格：每支装10mL黄芩苷、绿原酸对照品连翘对照药材乙醇二氯甲烷甲醇硫酸醋酸三、实验原理采用对照品对照法和对照药材对照法分别鉴别双黄连口服液中的金银花、黄芩和连翘三味主药。

四、实验内容【处方】金银花375g 黄芩375g 连翘750g【制法】以上三味，黄芩切片，加水煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩并在80℃时加入2mol/L盐酸溶液适量调节PH值至1.0～2.0，保温1小时，静置12小时，滤过，沉淀加6～8倍量水，用40%氢氧化钠溶液调节PH值至7.0，再加等量乙醇，搅拌使溶解，滤过，滤液用2mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，60℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗至PH值7.0，挥尽乙醇备用；金银花、连翘加水温浸半小时后，煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对蜜度为1.20～1.25(70～80℃测)，冷至40℃时缓缓加入乙醇，使含醇量达75%，充分搅拌，静置12小时，滤取上清液，残渣加75%乙醇适量，搅匀，静置12小时，滤过，合并乙醇液，回收乙醇至无醇味，加入黄芩提取物，并加水适量，以40%氢氧化钠溶液调节PH值至7.0，搅匀，冷藏（4～8℃）72小时，滤过，滤液加入蔗糖300g，搅拌使溶解，再加入香精适量并调节PH值至7.0，加水制成1000mL，搅匀，静置12小时，滤过，灌装，灭菌，即得。

实验三 高效液相色谱法测定双黄连口服液中黄芩苷的含量【实验目的】（1）初步掌握福立FL-2200高效液相色谱仪原理及其使用方法；（五号宋体） （2）掌握高效液相色谱对流动相、样品处理的要求及注意事项；（3）能根据测定数据计算双黄连口服液中黄芩苷的含量；（4）了解中药制剂质量检测的方法。

【实验原理】双黄连口服液由金银花、黄芩及连翘经提取精制而成，具有辛凉解表、 清热解毒功效，对于上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎、病毒性肺炎等细菌 和病毒感染性疾病有一定疗效。

其中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素 是其主要活性成分。

本试验根据《2010版中国药典》方法对双黄连口服液中黄芩苷含量进行测 定，以便控制制剂质量。

【仪器和试剂】1. 高效液相色谱仪（福立FL-2200）：2. 黄芩苷对照品（中食品药品检定所）【实验步骤】1.按操作说明书使用仪器，其色谱条件如下：色谱柱：C18 反相色谱柱流动相：甲醇-水-冰醋酸（50:50:1）检测波长：274nm。

柱温：30℃流速：1.0ml/min理论板数：按黄芩苷峰计算应不低于 1500。

2.【含量测定】 黄芩照高效液相色谱法（附录ⅥD）测定。

对照品溶液的制备精密称取黄芩苷对照品 10mg，置 100ml 量瓶中，加 50%甲醇适量， 置水浴中振摇使溶解，放置至室温，稀释至刻度，摇匀，即得（每 1ml 中含黄芩苷 0.1mg）。

供试品溶液的制备精密量取装量项下的本品 1ml，置 50ml 量瓶中,加 50%甲醇适量,超声处理 20 分钟，放置至室温，加 50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即 得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 5μl，注入液相色谱仪， 测定，即得。

本品每支含黄芩按黄芩苷(C21H18O11)计，不得少于 80mg。

【数据处理】采用外标法进行含量计算。

【思考题】1. 高效液相色谱仪在样品检测过程中设置的主要仪器参数有哪些？2. 高效液相色谱仪在使用过程中应注意些什么？3. 高效液相色谱仪在样品检测中与紫外-可见分光光度计相比，具有哪些不同和优势？。

双黄连口服液指标成分体内外相关性研究【摘要】目的：围绕双黄连口服液创建内外HPLC指纹图谱：方法：选用Welchrom C 18柱（150 mm×4.6 mm,5μm）规格的色谱柱，选用甲醇和0.2%磷酸水混合之后溶液作为流动相，进行梯度洗脱，针对不同段落选择适应波长完成检测；调整柱温至30℃，每次进样量控制在10ul左右；结果：对不同制备方法生成的产品和不同方法之间的相似度进行评价，最终测定相似度超过0.93，口服液所涉及的3种指标成分体内外相关性较好；结论：该方法便于操作，结果精准，形成的图谱真实可靠。

【关键词】双黄连口服液；指标成分；体内外相关性双黄连口服液是由黄芩、金银花、连翘等多种中药制成的产品，具备清热解毒的作用，在临床方面主要用治疗感冒发烧、咳嗽咽痛等病症，疗效显著具有较高的药用价值。

当前已有业内人员通过药血清化学的方式对药物进行了体内外探究，但实际操作中采取静脉注射的方式实现给药，缺少体内吸收这一环节。

此次试验以中药血清图谱为研究主体，确定不同制备方法下口服液中体内外之间的相关性，绘制HPLC血清指纹图谱，以此作为基础针对中药以及复方剂质量提供参考。

1仪器与材料Dionex高效液相色谱仪、Chromeleon 6.8工作站；WelchromC 18色谱柱；AS3120A超声清洗器；BS124S电子天平；HH—4恒温水浴锅；18790干热样品浓缩装置-氮吹仪；TDL—5—A型离心机、TGL—16B型离心机；真空采血管和一次性采血针。

黄芩、金银花、连翘，依次为唇形科植物黄芩的干燥根、忍冬科植物忍冬的干燥花蕾、木犀科连翘属植物连翘的干燥果实；对照品黄芩苷、绿原酸、连翘苷；双黄连口服液（自制，按照《中国药典》方法、单煎法、混煎法制成）；甲醇、乙腈（色谱醇）；纯净水，其他试剂均为分析纯。

Wistar大鼠，雄性健康，体质量230～270 g。

2方法与结果2.1双黄连口服液的制备2.1.1药典法根据《中国药典》2020年版方法制备，即得。

双黄连口服液中有效成份含量测定技术目的利用HPLC法对双黄连口服液中黄芩苷的含量进行科学测定。

方法其固定相主要是在结合实际的基础上对十八烷基键合硅胶进行选择。

其中流动相为甲醇：水：冰乙酸（60：50：1）。

结果黄芩苷所呈现的线性良好，但是为范围在25～220μg范围内，注意其平均回收率需要控制在100.59%。

结论该种方法不仅可实现对杂质的有效分离，对该制剂中黄芩苷的含量测定工作的顺利开展有积极意义。

标签：高效液相色谱法；黄芩苷；双黄连口服液金银花、黄芩和连翘是双黄连口服液处方的主要成分，辛凉解表、清热解毒是双黄连口服液的主要功效，在缓解外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛症状方面也起着相当重要的作用。

中国要药典针对双黄连口服液中黄芩苷含量测定工作所使用的质量指标为HPLC法。

通过实验发现黄芩苷峰与杂质峰之间呈现出无法分离的状态。

效果好，快速准确，重现性好是改变流动相比例的明显优势，因此我我们说将其用于制剂质量控制工作过程中至关重要。

一、仪器与试药1.SSIⅣ型液相泵是在实际实验过程中所使用的主要仪器，该仪器由美国生产，M525紫外检测器，Anastar色谱工作站也是同一公司所提供的试验仪器。

电子天平也是试验过程中不可缺少的工具之一，其型号为赛多利斯BP-211D。

2.中国药品生物制品检定所，批号200512的黄芩苷是本次试验的对照品。

双黄连口服液主要由哈高科白天鹅药业集团有限公司、江苏吴中实业股份有限公司苏州长征制药厂以及中国黑龙江完达山制药提供，批号分别为05117-1、050114以及050301。

甲醇（色谱纯）、冰乙酸（AR）以及重蒸水也是在试验过程中所必须使用的材料，在实际准备过程中必须对其质量进行严格检验。

KromasilC18柱（5μm，250mm×4.6mm）是药典流动相样品的HPLC色谱条件色谱柱，甲醇：水：冰乙醇（60：50：1）作为流动相存在于上述试验中，注意其温度最高不可超过40°C，检测波长也需要借助必要的措施与手段控制在274nm。