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第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。
◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。
1.细胞破碎细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。
表1细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。
1.2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。
(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。
常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。
(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
1.3化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。
常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。
1.4酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。
四、细胞破碎某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。
但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。
因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
(一)机械破碎法机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。
1．高压匀浆破碎法Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
细胞破碎技术
细胞破碎技术是一种将细胞壁破坏并使细胞内部成分释放出来的方法。
这种技术常用于提取和分离细胞内的蛋白质、DNA、RNA等分子。
常见的细胞破碎技术包括机械破碎、超声破碎、冻融破碎和化学破碎等方法。
1. 机械破碎：使用研钵、高速搅拌器、螺旋刀等机械设备对细胞进行破碎，通过物理力使细胞破裂，并释放出细胞内的分子。
2. 超声破碎：利用高频率的超声波对细胞进行振荡，产生剧烈的机械剪切力和微小气泡的崩溃，从而破碎细胞壁。
3. 冻融破碎：将细胞冷冻后迅速加热，重复冻结和加热的过程会使细胞壁破裂，并释放出细胞内的成分。
4. 化学破碎：利用化学试剂对细胞进行处理，如使用碱性溶液、表面活性剂或酶，以破坏细胞壁，使细胞破碎并释放出细胞内的分子。
细胞破碎技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学、生物化学等领域，可用于提取纯化目标分子、研究细胞内的代谢过程、检测疾病标志物等。
第二章细胞破碎和分离提取技术2．1细胞破碎技术许多生物产物特别是蛋白质、基因重组产品、胞内产品如：青霉素酰化酶，碱性磷酸酶等胞内酶，干扰素、胰岛素、生长激素等基因工程产物以及部分植物细胞产物等都是胞内物质，这类生物产物需要分离纯化的第一步是收集细胞及细胞破碎，使目标产物释放出来，然后进行分离纯化。
如图所示：图胞内产品的分离纯化过程2．1．1细胞破碎方法及机理破碎细胞的目的是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大渗透性）或破碎、释放其中的目标产物，主要采用的方法有机械法和非机械法两大类，图1列出了一些主要方法：破碎方法固体剪切作用液体剪切作用干燥处理溶胞作用珠磨法压榨法高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法撞击法图1 细胞破碎方法分类机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力，化学破碎则利用化学或生化试剂或酶改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率，或完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下，使细胞膜破裂而释放胞内物质，各作用力细胞破碎机理如图22.1.2机械方法破碎机械破碎处理量大，破碎速度较快，时间短，效率较高，是工业规模细胞破碎的重要手段，细胞受到挤压，剪切和撞击作用，易被破碎在许多情况下，细胞内含物全部释放出来，由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施，机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。
2.1.2.1 珠磨法（Bead milling ）珠磨法是一种有效的常用的机械破碎方法，珠磨机是珠磨法所采用的设备，其结构示意图3，细胞悬浮液与玻璃珠（或石英砂，或氧化铝）一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎，在珠磨机中，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起的。
珠磨法破碎细胞可采用间歇式连续操作，研究表明，两种情况下，细胞破碎动力学可近似表示为：t k l S 11n ⋅=-其中， t 在间歇操作时，为破碎操作时间，连续操作时为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间，即R Vt =，其中V 为悬浮液体积m 3，Q 为悬浮液流量m 3/S ，S 为破碎率，k 为破碎速率常数，与许多因素有关。
珠磨法破碎受许多操作参数的影响，总结在表1中：同一进料速度，细胞浓度越高，则破碎率越高，所需能耗越低；同时我们也能发现，破碎率越高所需能耗越大（同一悬浮液中）即破碎的能耗与破碎率成正比，提高破碎率，需要增加装珠量，或延长破碎时间，或提高转速，这些措施不仅导致电能消耗增加，且产生较多热量，引起浆液温度升高增加制冷量，因而总能量消耗增加。
珠磨法操作简便稳定，破碎率可控制，易放大，在实验室和工业规模上已得到应用，适用于绝大多数微生物细胞破碎，特别是对于有大量菌丝体的微生物和一些有亚细胞器（质地坚硬）的微生物细胞。
2.1.2.2高压匀浆法（high-pressure homogenization ）高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，高压匀浆器是该法所采用的设备，它由高压泵和匀浆阀组成，结构简图见图5，它是利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然简压和高速冲击撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放，高速匀浆破碎的动力学方程为：()b a S 11n P N k l ⋅⋅=-其中S 为破碎率，且max R RR =；k 为破碎速度常数，p 为动力，且上述参数s,k,a,b,p 等随微生物种类和培养条件的不同而有所差异。
影响高压匀浆破碎的因素主要有压力、温度和通过匀浆器阀的次数，图6是操作压力和循环次数对破碎的影响。
由图可知，操作压力对细胞破碎的影响要比匀浆次数的影响大得多。
从提高破碎效率的角度应选择尽可能高的压力；而从降低能耗及延长设备寿命的角度应避免很高的压力，因此，工业生产中常采用的压力为55－70Mpa 。
高压匀浆法操作参数少，且易于确定；且样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好，在实验室和工业生产中都已得到应用，适用于酵母和大多数细胞的破碎。
对于易造成堵塞的团状或丝状真菌以及一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用。
2.1.2.3超声波破碎法(Ultrasanication)超声波法是一种很强列的破碎方法，细胞破碎是利用声频高于15－20KHz的超声波在高强度声能输入下进行的，普遍认为其破碎机理是与空化现象引起的冲击波和剪切力有关，即空穴作用产生的空穴泡由于又受到超声波的冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击力压力，由此而引起悬浮细胞上产生了剪切应使细胞内液体产生流动而使细胞破碎。
超声波的细胞破碎与细胞种类、浓度、处理时间以及超声波的声频有关。
本法在处理少量样品时操作方便，液体损伤量少，破碎率高。
但本方法的有效能量利率极低，操作过程中产生大量的热，故操作时需在冰水中进行或通入冷却剂而增加成本，不易放大，它适用于大多数微生物的破碎，不适于大规模操作，主要用于实验室规模的细胞破碎。
机械破碎虽已广泛应用于工业大规模生产，但它仍有许多不足之处，如大量细胞碎片的产生，胞内所有可溶性杂质蛋白的释放，发酵液粘度增加等。
这给后处理工艺带来了很大难度，而非机械破碎方法，其条件比较温和，有利于存在细胞膜附近目标产物的高活力释放回收，适用于所有微生物细胞的破碎，包括物理法、化学法和酶溶法。
2.1.3细胞物理破碎方法2.1.3.1渗透压冲击法（Osmotic Shock）渗透压冲击法是各种细胞破碎方法中最为温和的一种。
将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞，引起细胞壁和膜膨胀破裂，从而使细胞通透性增大。
对细胞进行渗透压冲击与超声波破碎比较Cystain C的释放量比较结果如下表：高渗压溶液的快速稀释和高盐浓度溶液中细胞的快速重新悬浮，由于细胞壁的结构，对微生物细胞影响比较小，对停滞期的细胞影响更小，渗透压冲击法选择性很高，且释放速度快，工艺简单，易放大，具有很大的工业潜力。
本法适用于易破碎的细胞或细胞壁预先受到酶处理的细胞，及合成受抑制而强度减弱的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌，但它同时还存在着高盐浓度对产品污染问题。
2.1.3.2 冷冻－融化法(Freczing an thawirg)冷冻－融化法是通过水结晶的形成和随后的融化而进行细胞破碎。
冷冻的目的是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性，而且由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂。
对E-coli K12在30～90℃温度范围内热溶性的研究显示，在90℃下处理20min会释放出大量蛋白，可以看到，提高蛋白释放可通过短时间高温渗透来获得，而不是低温（30－70℃）长时间处理。
这些结果的解释很难用提高温度改变蛋白质的可溶性来解释，在电子显微镜下，90℃下的细胞破碎有大量的细胞碎片，但本法不能定量地测定细胞破碎的程度。
目前小规模工厂工艺过程用于生产生物可降解热熔物质，PHB是通过升高温度和压力相结合破碎A eutrophus获得的，相似的工艺过程是用于食品工业的酵母蛋白的提取生产被报道，操作可以是分批或连续，然而，由于提高温度大多数生物产品失活，使得细胞破碎中热量的应用是很有限的。
本法对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效，但由于本法成本高，只能进行小规模应用，且释放速率慢、产量低，另外酶易失活也限制了它的更进一步利用。
2.1.4化学法2.1.4.1碱处理蛋白质是两相物质，利用酸碱调节pH值，可提高目标产物溶解度。
PH11.5-12.5碱处理20－30min可导致细胞溶解，Wade报道了一改进工艺，通过用最佳PH11.0-12.5碱处理代替机械破碎法从Erwinia中提取L-asparaginase，则L-asparaginase以可溶形式释放出来，再如，破碎Alcaligenes eutrophus回收PHB，在PH10和45℃条件下处理，50％的可利用的可溶蛋白释放出来。
本法的优点是价格便宜，易适于任何规模的操作，但实际上大多数蛋白是不能忍受这种条件的PH11－11.5的碱浓度破坏了许多生物活性，使蛋白酶失活，故本法常伴随着蛋白的变性和降解。
2.1.4.2化学试剂法化学渗透取决于试剂的类型和细胞壁、细胞膜的结构与形成。
下表列出了不同化学试剂对不EDTA作为螯合剂，可用于处理革兰氏阴性菌如E-coli，对细胞的外层膜有破坏作用。
二价阳离子，尤其是Mg2＋对革兰氏阴性军细胞被膜以外层膜的稳定作用是重要的，EDTA的螯合作用导致外层膜不稳定或去除。
在EDTA处理时，大肠杆菌有33－50％脂多糖，少量蛋白质和磷脂损失，外层的这些变化也影响细胞质膜。
EDTA单独处理可导致Psendomenas aeruginosa广泛的溶解，这性质对Pseadmonads是特有的，对E－coli，EDTA有助于诱导自溶，在其它革兰氏阴性菌，EDTA可提高细胞通透性。
2).有机溶剂法许多研究者发现，有机溶剂处理细胞，细胞膜表面发生变化，胞内产物可以释放出来，由于有机溶剂没有整体破碎细胞，因而有可能实现选择性释放，如采用异丙醇处理酵母，释放超氧化物歧化酶，处理后，超氧化物歧化酶释放率达90％，纯化因子提高25，即在3).表面活性剂通常使用的清洁剂象SDS、CTAB、Triton-X等能够作用细胞质和细胞壁膜，膜结构中的脂蛋白成分被或多或少地溶解，使细胞渗透作用有利于某些蛋白的通过，Helenius等人认为清洁剂溶解膜的作用是蛋白质溶解和蛋白－脂界面的扰乱。
E-coli实验研究显示了阴离子清洁剂SDS、Sarkosyl和非离子型清洁剂Triton X-100溶解细胞、细胞外膜、细胞壁和细胞质膜不同的敏感性，无Mg2+条件下，细胞外膜和内膜很容易被SDS和Triton X-100 溶解。
Sarkosyl专门作用内膜，Mg2+存在会抑制Triton X-100，仅对内膜溶解的作用阻止了Sarkosyl 脱掉内膜，膜的去除与0.5－2.0％清洁剂浓度无关，内膜和外膜的溶解随着温度从4－37℃增大而升高。
Hectwer和Wang研究了非离子型Trition X-100和变性剂盐的结合作用，盐酸能从膜碎片中溶解蛋白Triton X-100对疏水物质有很高的亲和力，因而对结合和溶解内膜和外膜碎片中的磷脂很有效，在Triton X-100浓度0.5-2.0％，盐酸0.1M条件下，会发生明显的协同效应，两者缺少任何一种情况下，蛋白释放量少于10％，当发生协同作用时，蛋白释放量提高到505，用清洁剂渗透细胞的缺点是易使蛋白质变性，尤其表现在蛋白质复杂的四级结构上。
