单糖基白头翁皂苷的分离纯化_张小愚

文章编号:1005-4014(2006)02-0079-04单糖基白头翁皂苷的分离纯化*张小愚,王　伟,刘　琳,鱼红闪,金凤燮(大连轻工业学院生物与食品工程学院,辽宁大连　116034)关键词:单糖基白头翁皂苷;分离;纯化摘要:用柱层析法在氯仿和甲醇液中对白头翁皂苷酶解产物进行分离纯化,得到1种单糖基皂苷和皂苷元。

经薄层层析和高效液相色谱检测确定:单糖基皂苷为3-O-α-L-阿拉伯糖-3β,23-二烃基-Δ20(29)-羽扇豆烯-28-酸,其得率为5.1%。

高效液相色谱检测结果显示所得纯品纯度可达95%以上。

中图分类号:Q946.49 文献标识码:ASeparation and purification of Monosaccharide Pulsatilla saponin Z H A NG X iao-y u,W A NG Wei,LIU Lin,YU Hong-shan,J I N Feng-x ie (Schoo l o f Bio lo gical&F oodstuff Enginee ring,Dalian I nstitute o f Light Industry,D alian116034,China)Key words:Mo no saccharide Pulsatilla saponin;separation;purificationA bstract:Mo no saccharide Pulsatilla saponin pro duct and ag ly co ne fro m enzy me reactio n are separated and purified by silica gel column gradient elutio n w ith the so lvent of chlo roform and me thano l.The monosaccharide Pulsatilla saponin(3-O-α-L-ara-3β,23-dihydroxy lup-20(29)-en-28-oic acid)and agly-cone are obtained in the product fro m enzym e reaction by T LC and H PLC.T he monosaccharide Pul-satilla sapo nin yield is5.1%w ith a purity over95%. 中药白头翁是常用中药,为毛莨科白头翁属植物白头翁的干燥根[1],具有清热解毒、凉血止痢的功效[2]。

白头翁粉能杀灭阴道滴虫,白头翁的水煎剂和醇提总皂苷具有抗阿米巴原虫的作用,它的乙醇提取液和新鲜药材榨取液具有抑菌活性,临床上用白头翁治疗阿米巴痢疾[3]。

白头翁主要的药理作用有:抗菌作用、抗阿米巴原虫作用、抗其他病原体作用、抗癌作用、杀精子作用、镇静镇痛作用等。

白头翁鲜汁、煎剂、乙醇提取物等于体外均有明显的抗菌作用,它能抑制金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、伤寒杆菌、沙门菌等的生长[4]。

白头翁素对白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、结核杆菌之M IC在8×10-5～2×10-6之间[5]。

另外据最新研究表明[6-7],将白头翁五个糖基的皂苷改变成低糖基皂苷,有利于人体吸收,并且白头翁皂苷的酶解产物明显促进皮肤纤维芽细胞的胶原蛋白合成,该物质和化妆品中常用物质混合制备皮肤抗老化化妆品,使皮肤中胶原蛋白量明显增多,有效改善皮肤弹性,抗皱纹抗老化[8]。

白头翁的主要有效成分为五糖基皂苷,如图1所示。

根据白头翁(皂苷)口服后,经消化系统在(R1和R2为糖的侧链)皂苷1:R1=α-L-rha-(1→2)-α-L-ara- R2=α-L-rh a-(1→4)-β-D-g lc-(1→6)-β-D-glc-皂苷2:R1=α-L-ara-;R2=H-皂苷元:R1=H-;R2=H-(glc,葡萄糖;ara,阿拉伯糖;rha,鼠李糖)图1　白头翁皂苷分子式第25卷第2期2006年06月 大连轻工业学院学报Journal of Dalian Institute of Light IndustryV ol.25,N o.2Jun.2006*收稿日期:2005-12-23基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371744;20476017;30470055).作者简介:张小愚(1981～),男,硕士研究生.肠道菌的作用下转化为低糖基皂苷被吸收的现象,本文主要研究了酶转化法生产单糖基白头翁皂苷、皂苷元的分离提纯方法。

1　材料与方法1.1　实验材料白头翁原生苷、次生苷标准品,暨南大学药学院叶文才教授提供;白头翁总皂苷,实验室自制;薄层层析板Silica g el60-F254,德国Merck公司制品;AB-8大孔吸附树脂,南开大学化工厂产品;硅胶,青岛海洋化工厂产品;实验所用化学试剂均为分析纯。

1.2　实验方法1.2.1　白头翁皂苷酶解产物的制备取适量浓度为2mg/m L的白头翁皂苷溶液,加入等体积的酶液,于40℃下进行酶解反应,并间歇搅拌,反应结束后冷冻离心,上清液置于水浴锅中蒸干即得白头翁皂苷酶解产物。

1.2.2　白头翁皂苷酶解产物的硅胶分离首先称取白头翁皂苷酶解产物,放入瓷碗中并倒入适量氯仿和甲醇(1∶1)混合液搅拌使固体粉末充分溶解后,与适量80～100目的硅胶混合,样品被硅胶吸附,在水浴锅中蒸干,磨成均匀粉末,制成样品胶。

然后,在底部塞有棉花的硅胶柱里装入200～300目的硅胶(分离胶),保持上表面水平,抽真空使之细密均匀,再装入干燥好的样品胶并在其表面铺上棉花层。

柱装好后,首先用纯氯仿通柱,柱子打通后,开始用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的流动相洗脱,而后逐渐增加甲醇浓度,最终以V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1的流动相洗脱。

TLC 跟踪检测结果,根据结果分别收集。

1.2.3　单糖基白头翁皂苷的薄层层析(TLC)检测将薄层层析板在110℃烘箱活化30～60min,用刻度毛细管吸取标准品及样品,点样于薄层层析板上。

每次的点样量依照样品浓度确定点样次数,每次点样后均须用电吹风吹干。

将点好样品的薄层板放入层析缸的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm(切勿将样点浸入展开剂中),密封盖,待展开至规定距离(一般为5.5cm)后,取出,吹干溶剂,喷10% H2SO4水溶液后,用电吹风吹干显色。

所用展开剂为V(CH Cl3)∶V(M eOH)∶V(H2O)= 7∶3∶0.5,显色剂为10%硫酸溶液。

1.2.4　单糖基白头翁皂苷的高效液相色谱(HPLC)检测将白头翁次生苷标准品和硅胶柱分得的单糖基白头翁皂苷分别配成1mg/m L的甲醇溶液待用。

制流动相时,乙腈、超纯水配制完成后需要用超声波振荡除气。

打开高效液相色谱分析仪,预热20～30min;打开检测器调整波长到201nm,将流速调整到1.0mL/min,用流动相洗柱,直至吸光值稳定。

用25μL进样注射器,准确量取20μL待测样品溶液,于进样阀中进样。

关闭进样阀的同时,检测器开始检测和记录。

2　结果与讨论2.1　白头翁总皂苷及酶解产物白头翁中所提取的总皂苷主要为五糖基皂苷,其得率为8.9%,TLC检测如图2所示;白头翁皂苷酶解产物如图3所示,主要产物为低糖基皂苷和皂苷元。

本实验对20g总皂苷进行酶解,得到粗产物约20g左右(含杂质)。

1.白头翁五糖基皂苷标准品;2.白头翁中提取的总皂苷图2　白头翁总皂苷TLC图谱1.白头翁五糖基皂苷标准品;2.白头翁皂苷酶解产物图3　白头翁皂苷酶解产物TLC图谱2.2　白头翁皂苷酶解产物的硅胶分离为了得到白头翁皂苷酶解产物的单体,用硅胶柱法分离提纯。

首先称取20g白头翁皂苷酶解产物,放入瓷碗中并倒入适量氯仿和甲醇(1∶1)混合液搅拌使固体粉末充分溶解后,与80 大　连　轻　工　业　学　院　学　报 第25卷60g 80～100目的硅胶混合,样品被硅胶吸附,在水浴锅中蒸干,磨成均匀的粉末,制成样品胶。

然后,在底部塞有棉花的硅胶柱里装入400g 200～300目的硅胶(分离胶),保持上表面水平,抽真空使之细密均匀,再装入干燥好的样品胶并在其表面铺上棉花层。

柱装好后,首先用纯氯仿通柱,然后用V (氯仿)∶V (甲醇)=9.5∶0.5的流动相洗脱,而后逐渐增加甲醇浓度,最终以V (氯仿)∶V (甲醇)=9∶1的流动相洗脱,对洗脱液进行分部收集,每次收集约200mL 。

对所收集的样品进行T LC 跟踪检测,结果如图4所示,其中“底”代表白头翁总皂苷,数字代表各瓶号。

图4　硅胶分离白头翁皂苷酶解产物TLC 图谱 按照TLC 结果收集相同单点蒸干,所得到的样品归纳,如表1所示。

表1　白头翁皂苷酶解产物分离收集表瓶号成分m /g 得率/%2～3苷元0.76 3.804～9杂质0.27 1.3510～38主要酶解产物12.5662.80 从表1中可以看到,主要酶解产物(单糖基白头翁皂苷)的得率为62.80%(质量分数),皂苷元得率为3.80%。

2.3　单糖基白头翁皂苷的鉴定为了确定所得单糖基白头翁皂苷的种类和纯度,对其进行T LC 和H PLC 检测。

其TLC 检测结果和H PLC 图谱分别如图5、6所示。

从图5中可以看到,所分离得到的白头翁次生苷是单点,并且其斑点位置及显色行为与单糖基白头翁皂苷一致,所以可以初步确定其为单糖基白头翁皂苷。

1.单糖基白头翁皂苷标准品;2.白头翁次生苷图5　单糖基白头翁皂苷标准品和白头翁次生苷TLC 对照图谱图6　白头翁皂苷的HPLC 图谱 从图6可以看到,对比单糖基白头翁皂苷、白头翁次生苷标准品在相同条件下H PLC 的保留时间可以确定所得的白头翁次生苷为单糖基白头翁皂苷。

根据标准品色谱峰峰面积可知所得的单糖基白头翁皂苷纯度为95%左右。

3　结 论白头翁中提取的皂苷主要为五糖基皂苷,即3-O -[α-L -鼠里糖基(1→2)-α-L -阿拉伯糖基]-3β,23-二烃基-Δ20(29)-羽扇豆烯-28-O -[α-L -鼠里糖基(1→4)-β-D -葡萄糖基(1→6)]-β-D -葡萄糖酯苷,其得率为8.9%,酶解后主要产物为低糖基白头翁皂苷和皂苷元,其产物用硅胶层析法进行分离,得到皂苷元和单糖基皂苷。

酶解产物低糖基白头翁皂苷经TLC 检测,可初步确定单糖基白头翁皂81第2期 张小愚等:单糖基白头翁皂苷的分离纯化 苷,经高效液相色谱(H PLC )检测,确定为单糖基白头翁皂苷,即3-O -α-L -阿拉伯糖-3β,23-二烃基-Δ20(29)-羽扇豆烯-28-酸,其纯度可达95%以上。