环境监测中的微生物检测方法研究

微生物的测定方法

微生物的测定方法是科学研究者用来确定环境中或生物体内存在的微生物数量和种类的方法。微生物包括细菌、真菌、病毒等微小的生物体，它们在生态、环境、医学等许多领域中具有重要的作用。因此准确测定微生物的数量和种类对于研究和控制微生物相关问题具有重要意义。

测定微生物的方法可以分为直接方法和间接方法。直接方法主要通过直接观察和统计小样本或全部微生物来获得结果，而间接方法则通过测定与微生物相关的物理、化学或生物学特征来推测其存在与数量。

直接方法包括：

1. 显微镜观察：显微镜可以放大微生物的形态和结构，例如细菌的形态、真菌的菌丝和孢子等。显微镜观察通常需要对样本进行染色，常用的染色方法有革兰氏染色、培养基染色、荧光染色等。

2. 细胞计数：细胞计数是一种直接测定微生物数量的方法，可以通过显微镜或自动计数器来进行。这种方法适用于测定细菌、酵母等微生物的数量。

3. 培养方法：培养方法是一种将微生物转移到培养基上并培养出可见菌落的方法。通过培养，可以对微生物进行纯化、鉴定和数量统计。常用的培养基有琼脂培养基、肉汤培养基、大肠杆菌选择性培养基等。

4. 分子生物学方法：分子生物学方法是一种利用微生物的DNA或RNA序列信息进行测定的方法，包括聚合酶链反应（PCR）、DNA杂交、DNA测序等。这些方法可以确定微生物的种类、亲缘关系和相对数量。

间接方法包括：

1. 生化方法：通过测定微生物活动释放的代谢产物，如酶活性、产气能力、菌落形态等，来推测微生物的存在与数量。例如，通过测定酸碱变化、色素生成和特定凝固酶的产生来检测特定菌株。

2. 分离方法：通过将微生物转移到特定培养基上，利用其特定生长需求来筛选和鉴定微生物。例如，使用麦康凯琼脂和大肠杆菌选择性培养基来分离肠炎弧菌。

3. 抗体检测：利用特异性抗体与微生物抗原的特异性结合来进行测定。例如，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）或荧光抗体方法来检测病毒或细菌的存在和数量。

生物监测技术在环境监测中的应用研究

生物监测技术是通过研究污染物对环境中的生态系统产生影响的技术，本文通过对其在大气污染、土壤污染、水污染的监测应用进行阐述，分析其优点。与理化监测相比，生物监测技术具备对环境污染毒害性更客观、科学的优点，具有良好的发展前景。

标签： 生物监测技术；环境监测中；应用研究

一、生物监测技术概述

生物监测技术的理论基础来自生态监测理论，当污染物进入环境系统后，会影响环境中的生态系统，改变生物原有结构和功能。对生物体影响表现为生物死亡、抑制其生长发育与繁殖等；对植物体影响表现为生长速度变化，发育受阻，黄化及早熟等。对于生物菌种群影响表现为种群数量或密度的改变，物种比例的变化，竞争关系和遗传基础的改变，引起群落中优势种群、数量、以及种群多样性的改变。生物监测技术不仅用于环境监测，还用于劳动卫生人体生物监测、口岸及医学病媒生物监测等。生物监测的应用方法主要有：基因工程技术、电泳分离纯化技术、DNA探针技术和PCR技术等。

二、生物监测在环境监测中的应用

（一）生物监测在土壤污染中的应用。

土壤为微生物，植物等提供生存所必须的营养物质，土壤发生了污染导致一系列生物发生连锁反映，会造成地下水，矿物质等发生污染。应用生物监测可以检测出污染物对于那些土壤中的生物生长发育有什么影响。动物监测法：动物监测即时选取在土壤中生存繁殖速度快，对土壤变化比较敏感的生物作为对象，来检测土壤中是不是存在污染物，污染物对于生物的生长发育存在什么影响。在生物监测的动物监测中，通常选取蚯蚓作为研究对象，蚯蚓在土壤中种群量巨大尤其蚯蚓对土壤的变化非常敏感，对土壤污染的判断具有实质的作用。植物检测法：植物对于土壤的污染非常敏感，可以通过观察植物的生理状态，形态等判断土壤的污染程度。当土壤污染时表现最明显的是植物，植物的叶子变黄，叶子掉落严重，树干出现很深的疤痕等等。植物的反季节变化是土壤受到污染最明显的表现，在夏季绿叶变黄脱落，树干上存在明显的伤疤，通过这些植物的生理表现监测出环境受到污染。根据植物生理变化的强弱，判断環境污染的程度。微生物检测法：

微生物学免疫学进展２０１５年６月第４３卷第３期Ｐｉｎｇ　ｉｎ　Ｍｉｃｒ０ｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｊｕｎ．２０１５，Ｖｏ１．４３　Ｎｏ．３　・９・　

ＶＩＴＥＫ　２　Ｃｏｍｐａｃｔ微生物检测系统　

在生物制剂无菌环境监测中的应用　

房世娣，赵小洁，刘晓凡，宣俊文，钱秋娟，马军兰，魏然　

兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州７３００４６　・论著・　

摘要：目的通过收集生物制剂生产中洁净间环境微生物、微生物限度检测样品，应用全自动微生物检测系统　

（ＶＩＴＥＫ　２　Ｃｏｍｐａｃｔ）进行监测分析，评价其适用性。方法利用革兰染色法和ＶＩＴＥＫ　２　Ｃｏｍｐａｃｔ系统对４种标准菌　株和２９１个纯菌鉴定样本进行方法学验证；对人员及设备表面微生物、沉降菌及微生物限度样本共３１３个进行菌型　鉴定，确认此系统在生物制剂生产中的应用价值。结果共在收集的３１３个样本中，共检出微生物２６８株，其中人　

员及设备表面微生物１８株、沉降菌１８８株、微生物限度６２株。可信度均在９３％以上。其中革兰阳性菌：藤黄／里　拉微球菌４６次，库克菌属３５次，葡萄球菌属７Ｏ次；阴性菌：少动鞘氨醇单胞菌３８次，鲁氏不动杆菌７次。结　论ＶＩＴＥＫ　２　Ｃｏｍｐａｃｔ微生物检测系统具有高度特异性、敏感性和重复性，并具有操作简便、检测速度快等优点，可　广泛应用于医院及疾控中心，尤其对无菌生产环境中微生物的质控和微生物数据库的建立具有重要意义。　关键词：ＶＩＴＥＫ　２　ｃｏｍｐａｃｔ；微生物数据库；生物制剂；细菌鉴定　中图分类号：Ｒ１２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００５—５６７３（２０１５）０３－０００９—０６　ＤｏＩ：１０．１３３０９／ｊ．ｃｎｋｉ．ｐｍｉ．２０１５．０３．００３　

Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　０ｆ　ＶＩＴＥＫ　２　ｃｏｍｐａｃｔ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　

ｉｎ　ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ　ｏｆ　ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　

微生物试验检测

设备仪器：

酶标仪、显微镜、恒温培养箱、干燥箱、冰箱、冰柜、恒温水浴锅、离心机、离心沉淀器、微量振荡器、电子天平、生物天平、高压锅、超净工作台、煤气灶、煤气罐、移液器、酒精灯、手术剪、止血钳、镊子等。

实验检测项目：

一、 血清学

1. 红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）操做方法

2．凝集反应

⑴鸡白痢和鸡伤寒的诊断

⑵鸡霉形体的诊断

3．免疫扩散试验（AGP）操作方法

⑴鸡传染性囊病的诊断

⑵鸡淋巴白血病的诊断

二、孵化厅的微生物学检测

1.种蛋表面的细菌检测

2.绒毛的细菌检测

3.终止胚的细菌检测

4.一日龄雏鸡的健康检测

5.空气中细菌的检测

6.设备表面细菌的检测

7.水样的细菌的检测 三、鸡舍的细菌检测

1.空气中细菌的检测

2.物体表面细菌的检测

3.水样的细菌检测

4.垫料的细菌检测

5.饲料的细菌检测

四、消毒剂及其使用效果的测定

五、细菌对药物的敏感性试验

检测流程

一、 血清学

1. 红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）操做方法

1.1 红细胞凝集试验（HA）

1.1.1 在“V”型微量反应板上进行。每孔加入50微升（用微量进样器或将16号注射针头磨去斜尖，调整针头孔径使每滴恰好25微升）pH 7.2的0.01摩尔／升PBS液或生理盐水，向第1孔滴加新城疫抗原50微升，吸放3～5次混匀，然后从第一孔吸出50微升加入第二孔，以相同方法混匀，再从第二孔吸50微升加入第三孔，如此做倍比稀释至倒数第二孔，再从倒数第二孔吸出50微升弃去，最后一孔不加病毒（抗原）作为红细胞对照。

1.1.2 吸取0.5％鸡红细胞悬浮液，每孔滴加50微升，加毕后在微量振荡器上振荡15～30秒，使其混合均匀，静置室温下或37℃温箱中作用20～40分钟。 1.1.3 当对照孔红细胞全部沉入孔底中间，即可判定各孔的红细胞凝集情况。以病毒最大的稀释度孔出现100％凝集现象者为这个病毒的凝集价，即一个血凝单位。