蛋白质的提取、分离纯化及定量
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实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法
实验目的
1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示
Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)
只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。可根据Rf作为定性依据。 Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂
1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液
⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、
⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风
实验步骤
1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
3.点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这8个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。
4.扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中〔点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1㎝〕。待溶剂上升12㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界限，自然枯燥或用吹风机热风吹干。
5.显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟〔100℃〕或用热风吹干即可显出各层析斑点。
6.计算：计算各种氨基酸的比移〔Rf〕值。
精讲点播 -
1.利用逆流分溶或逆流分配的方法作为分配层析原理的说明：
2.物质的构造与极性对Rf值的影响
物质的构造不同，其分子的极性不一样，物质在水和有机溶剂两相中的溶解度就不同，分配系数的不同可通过Rf值反响出来，极性较强的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，相反极性较弱的物质，在有机溶剂中的溶解度就较大Rf值就大些，如中性AA的极性弱于酸碱性AA，故中性AA的Rf值较大。
考前须知、出现的问题及解决方法
1.取滤纸前，要将手洗净，并尽可能少接触滤纸，不得已时只能拿滤纸的一角，平放在干净的纸上。
2.点样点的直径不能大于0.5㎝，否则别离效果不好，样品用量大会造成"拖尾巴〞现象。
3.别离时间短使有些氨基酸的Rf值非常相似，分析时可以辅颜色不同加以区分。
4.样品在原点未移动，是因为展层剂出问题，在展层剂中混入了平衡溶液，因为平衡溶液是放置时间长了的展层剂，展层剂出现脂化现象，使分配系数发生变化。
思考题
1.何谓纸层析法？
2.何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？
3.怎样制备扩展剂？
4.层析缸中平衡溶剂的作用是什么？
实验二. 酶的特异性〔专一性〕及影响酶活性的因素
实验目的
1. 掌握检查酶特异性的方法和原理。
2. 了解温度对酶活性的影响。
3. 了解激活剂、抑制剂对酶活力的影响。
实验原理 32
32
16
16 8 8
4 4
16
16
16
16
12
12
8
8 8
8
12
12
12
12 2
2 4
4
8
8 2
2 48
16
12
4 3 1
0.75
0.25
36
12
18
6
6.75
2.25
2.25
0.75 27
9
20.25
6.75
10.1
3.4 0.19
0，06 20.25
6.75
20.2
6.8 15.2
5.4 -
1.酶的专一性
酶是生物体中一种具有催化功能的特殊蛋白质〔传统酶的概念〕，也常称为生物催化剂。它与一般催化剂的最主要区别就是具有高度的特异性，即专一性。根据各种酶对底物的选择程度不同，可分为绝对专一性、相对专一性、立体异构专一性，。例如唾液淀粉酶属于相对专一性酶，它只能随机作用于淀粉链内部的a——1，4糖苷键，使其分子迅速断裂成较短的链，称为糊精，糊精分子量递减，淀粉——大分子糊精——中分子糊精——小分子糊精——简单分子糊精——麦芽糖和a——糊精〔含a——1，6糖苷键的短链聚糖，平均分子量为8个残基〕。
由于淀粉酶催化所形成的产物都是复原糖，故可用灵敏度较高的Benedict试剂检测和观察。
2.温度对酶促反响速度的影响
酶的催化作用受温度的影响很大，与一般化学反响一样，提高温度可以增加酶促反响的速度，通常温度每升高10℃，反响速度加快一倍左右。另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反响速度到达最大值以后，随着温度的升高，反响速度反而逐渐下降，以至完全停顿反响。反响速度到达最大值时的温度称为酶作用的最适温度。大多数动物酶的最适温度为37—40℃，植物酶的最适温度为50—60℃。但一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间称短有关，反响时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。最适温度不是酶的特征性物理常数。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。大多数酶在枯燥的固体状态与比拟稳定，能在室温下保存数月至一年，溶液中的酶，易被微生物污染，常难长期保存，在高温的情况与，如100℃即可失活。低温降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。
3.激活剂和抑制剂对酶活力的影响
酶的活性常受*些物质的影响，有些物质能增加酶的活性，称为酶的激活剂；另一些物质则会降低酶的活性，称为酶的抑制剂。例如氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子则为该酶的抑制剂。通常情况下，很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性，但是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质对不同的酶所起的作用不同，如镁是脱羧酶烯醇化酶的激活剂，但是肌球蛋白ATP酶的抑制剂，同一种酶也可因激活剂的浓度不同而作用不同，如CL-在低浓度时是激活剂，达三分之一饱和度时则变为抑制剂。
器材和试剂
1.配制的溶于0.3％氯化钠的0.5％淀粉溶液：
2.新配制的溶于0.3％氯化钠的0.1％淀粉溶液：
3.新配制的溶于0.3％氯化钠的0.2％淀粉溶液：
4.新配制的溶于0.3％氯化钠的1%淀粉溶液：
5.稀释的新鲜唾液。漱口后将唾液吐入量筒内收集约10ml加水至200ml，取0.2%的淀粉2ml，唾液2ml混匀，每间隔1分钟取1-2滴于白磁反响板内，加KI-I检测，控制酶的浓度使反响刚好在4-5分钟内完成。
6.碘化钾－碘溶液:将碘化钾20克及碘10克溶于100毫升水中。使用前稀释10倍。
7.本尼迪克特〔Benedict〕试剂: 取86.5克柠檬酸钠〔Na3C6O7·2H2O〕和50克无水碳酸钠溶于450毫升蒸馏水中；再取硫酸铜〔CuSO4·5H2O〕8.7克溶于50毫升蒸馏水中；然后将硫酸铜溶液慢慢到入前液，边加边摇动；最后加蒸馏水稀释至500毫升〔本试剂可长期保存〕。
8.1％氯化钠溶液：10、铜溶液：11、%硫酸钠溶液 -
12恒温水浴锅、沸水浴、移液管、电子天平
操作步骤
淀粉→分子糊精-→中分子糊精→小分子糊精→麦芽糖和α-糊精
KI-I 蓝蓝紫褐红不呈色不呈色
一、酶的专一性
取5支试管，编号并按下表操作：
管号 1 2 3 4
1%淀粉溶液 4滴 — 4滴 —
2%蔗糖溶液 — 4滴 — 4滴
稀释唾液 1毫升 — 1毫升 —
蒸馏水 — 1毫升 — 1毫升
37℃恒温水浴15min
Benedict试剂 1毫升 1毫升 1毫升 1毫升
沸水浴5min
现象
二.温度对酶活力的影响
〔一〕淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。
〔二〕取三支试管，编号后按下表参加试剂：
管号 1 2 3
淀粉溶液(ml) 1.5 1.5 1.5
稀释唾液(ml) 1 1 -
煮沸过的稀释唾液(ml) - - 1
(三)摇匀后，将1、3号两支试管放入37℃恒温水浴锅中，2号试管放入冰水中。10分钟后取出〔将2号管内液体分为两半〕，用碘化钾－碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10分钟，再用碘液检验，结果如何？
三.酶的激活与抑制
〔一〕取三支试管，按下表编号参加相应试剂：
试剂
管号 0.1％淀粉 1％NaCI 1%CuSO4 H2O 1:20唾液
1 2ml 1ml － － 1ml
2 2ml － 1ml － 1ml
3 2ml － － 1ml 1ml
〔二〕加毕，摇匀，同时置37℃水浴锅中保温，每隔2分钟取液体1滴置白瓷板上用碘液试之，观察那支试管内液体最先不呈蓝色反响，那一管次之，说明原因。
考前须知
1.所用唾液，应在收集前用蒸馏水漱口，以去除食物残渣，再含一口蒸馏水，约半分钟后将其流入量筒并稀释。由于不同人或同一个人不同时间采收的唾液内淀粉酶的活性并不一样，有时差异很大。所以稀释倍数可根据各人的唾液淀粉酶活性进展调整〔一般在50~300倍〕。另外，稀释好的新鲜唾液假设泡沫多，可进
