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结直肠癌KRAS和NRAS及BRAF基因突变状态分析沙如拉;李文新【摘要】目的检测结直肠癌组织KRAS、NRAS及BRAF基因突变状态,分析突变与临床特征的关系.方法收集结直肠癌手术切除或穿刺活检标本218例,提取DNA 经探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应扩增后,检测KRAS、NRAS及BRAF基因的突变状态,分析结直肠癌组织中3个基因间突变的内在关系,并分析KRAS突变与临床特征的关系.结果 218例CRC中,KRAS基因突变率为37.6％(82/218);NRAS 基因突变率为4.1％(9/218);BRAF突变率为3.7％ (8/218),在136例KRAS野生型病例中NRAS与BRAF的突变频率为6.6％(9/136)和5.9％ (8/136).BRAF与KRAS、NRAS基因突变相互排斥.KRAS基因突变更倾向发生于Ⅲ～Ⅳ期(P=0.014)和淋巴结转移的患者(P=0.049),与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度等病理特征无关(P＞0.05).NRAS和BRAF基因突变与病理特征无关(P＞0.05).结论结直肠癌患者的KRAS突变速率较高,KRAS突变与淋巴结转移和肿瘤进展相关.联合检测KRAS、NRAS及BRAF基因,能正确指导和选择抗EGFR单抗药,实现个体化治疗的目标.【期刊名称】《内蒙古医学杂志》【年(卷),期】2017(049)001【总页数】4页(P4-7)【关键词】结直肠癌;EGFR;KRAS;NRAS;BRAF【作者】沙如拉;李文新【作者单位】内蒙古自治区人民医院肿瘤内科,内蒙古呼和浩特 010017;内蒙古自治区人民医院肿瘤内科,内蒙古呼和浩特 010017【正文语种】中文【中图分类】R735.34结肠癌是常见的恶性肿瘤。
世界上结肠癌的发病率不断攀升,以每年超过130万新病例的速度递增[1]。
晚期的转移性结直肠癌患者5年生存率不到10%，化疗可以改善生活条件,但平均生存率仍不超过2年。
评估FFPERNA质量还在看RIN值？对于普通RNA样本质量评估，一般进行OD260/280检测纯度、Qubit检测浓度、Agilent2100 检测RNA Integrity Number（RIN）值评估完整度、电泳分析RNA降解程度等。
但对于FFPE样本，由于没有统一的处理和储存标准，过程中容易产生不同程度的核酸降解和损伤，同时RNA 比DNA更容易降解，上述传统方法并不能完全恰当的评估提取的FFPE RNA样本质量是否适合RNA-seq。
例如许多人用RIN值来判断FFPE RNA样本质量是否适合下游文库构建。
然而illumina 表示对于RNA文库构建，RIN值并不能有效评估RNA样本质量，因为相同RIN值的RNA样本片段分布可以相差很大。
如下图用Agilent 2100 分析肿瘤组织FFPE样本纯化的RNA与标准Universal Human Reference（UHR）对比。
可以看到这些样本即使RIN值非常接近（<3.2），RNA 的片段大小分布也相差非常大，大多数样本主要的RNA片段都小于200nt。
最近，基因有限公司独家代理的Covaris 的科学家们探讨了用于RNA-seq的FFPE RNA质量的具体评估指标，以期客观评价NGS级FFPE RNA。
Covaris 用Covaris truXTRAC® FFPE kit +AFA超声（自动聚焦声波技术）方法和用传统手动抽提方法抽提来源于肾、肝脏、子宫的相同FFPE 样本RNA。
除使用上述DV200值外，还用Qubit RNA IQ值评估提取的FFPE RNA质量，更严格的用Functional RNA Quantitation (FRQ)值评估了提取的RNA样本可扩增RNA量。
DV200值illumina 推荐用大于200nt RNA片段所占比值即DV200值来评估用于illumina文库构建的RNA样本质量（见下表），DV200值小于30%的样本不推荐用于文库构建，随着DV200值越高，RNA input 量可以减少。
赛默飞测序原理赛默飞（Thermo Fisher）测序技术是一种基因组测序技术，其原理是通过构建DNA文库、DNA扩增和测序来获取DNA序列信息。
这种测序技术被广泛应用于基因组学、生物学研究、医学诊断等领域。
赛默飞测序技术的原理可以分为四个主要步骤：文库构建、DNA扩增、测序和数据分析。
文库构建是测序的第一步。
在这一步骤中，需要将待测序的DNA 片段连接到适当的载体上，形成DNA文库。
文库构建的关键是选择适当的载体和连接酶，以确保DNA片段的连接效率和稳定性。
DNA扩增是测序的第二步。
在这一步骤中，通过PCR（聚合酶链反应）或其他扩增方法，扩增DNA文库中的DNA片段。
扩增后的DNA片段将用于后续的测序反应。
测序是测序的核心步骤。
赛默飞测序技术采用Sanger测序方法，即通过DNA聚合酶合成链的过程中，加入低浓度的二进制特殊核苷酸（ddNTPs）作为终止子。
当ddNTPs被加入到新合成的DNA 链中，DNA合成将被终止。
这样，通过测量不同核苷酸的终止子，就可以确定DNA序列。
数据分析是测序的最后一步。
在这一步骤中，通过对测序仪输出的原始数据进行处理和解读，得到DNA序列。
数据分析包括去除测序误差、序列比对、变异检测等步骤。
最终，通过比对已知的基因组数据库，可以确定待测序的DNA片段的序列和可能的变异信息。
赛默飞测序技术具有高通量、高准确性和广泛的应用领域。
相比其他测序技术，赛默飞测序技术能够在较短的时间内测序大量的DNA 片段，并且具有较高的准确性。
这使得赛默飞测序技术在基因组学研究、生物医学研究、药物研发等领域得到了广泛的应用。
赛默飞测序技术利用文库构建、DNA扩增、测序和数据分析的步骤，能够高效、准确地获取DNA序列信息。
这种测序技术在基因组学研究和生物医学领域发挥着重要作用，为科学研究和医学诊断提供了重要的工具和方法。
微生物基因分型鉴定系统背景：分子生物学技术在近几年的迅速发展和普及，使得微生物学鉴定得以摆脱传统生化鉴定方法的局限，跨入新的历史进程。
较上世纪已经出现的生化鉴定法，基于分子生物学技术的微生物鉴定系统的优越性主要表现为：可鉴定的种属范围均大大扩展；可靠性和灵敏度显著提升；整体检测时间降低。
ThermoFisher 公司的MicroSEQ®自动微生物基因分型鉴定系统分型系统是目前技术最为成熟、应用最为广泛的基因分析鉴定系统，现已广泛应用在药品、食品及工业微生物的鉴定分析上，以下内容将对这一系统做更为全面的介绍。
2015版药典中指出，测序是微生物鉴定的最终解释方法1.在药品微生物鉴定领域的应用2008年度全球排名前25位的制药集团中，有22家集团已经将ThermoFisher公司的MicmSEQ®自动微生物基因分析鉴定系统用于其日常微生物检测中。
美国FDA在对生产无菌制剂和生物药品的指导性纲要《工业指南用无菌工艺生产的无菌产品一现行GMP》中更是明确提出“快速遗传类型测定方法被建议用于鉴别目的，因为这种方法已经证明比生物化学方法和表型技术更精确和准确。
”除美国之外，澳大利亚、日本及欧盟的药典中也已明确推荐使用基因分析的方法用于微生物的鉴定。
2.微生物鉴定基本原理:16S rRNA基因是伯杰氏手册(Bergey’Manual)细菌菌种分类的客观基础，也是DNA测序鉴定分型的基础。
MicroSEQ®微生物鉴定系统是专门为微生物测序分型所设计，结合最新的DNA测序技术、强大的分析软件，通过对细菌共有的16S rRNA基因进行自动化测序得到细菌鉴定结果；而对于真菌鉴定则通过对真菌26S rRNA基因上的D2基因片段进行测序。
3.检测平台：Applied Biosystems™基因分析仪以可靠性和值得信赖的结果为立足点。
作为Applied Biosystems™毛细管电泳(CE)基因分析仪产品系列的最新成员，SeqStudio基因分析仪同样基于这一理念，但同时又追求易用、易维护，易于存取和便于分享数据。
基于基因测序的肿瘤病理诊断随着基因测序技术的不断发展，肿瘤病理诊断也逐渐从传统的形态学诊断向分子水平的诊断转变。
基于基因测序的肿瘤病理诊断已经在肿瘤的临床诊断和治疗中发挥了越来越重要的作用。
一、基因测序技术在肿瘤病理诊断中的应用基因测序技术可以用来确定肿瘤的遗传变异，从而帮助医生做出更精准的诊断和治疗建议。
基于基因测序的肿瘤病理诊断主要有以下几种方法：1.基于单基因测序的检测这种方法主要用于检测与某一具体肿瘤相关的基因变异，比如BRCA1和BRCA2基因在乳腺和卵巢癌中的突变。
华大基因、完美世界、和信元、易生信等国内公司都提供这种基因检测服务。
2.基于全外显子组测序的检测全外显子组测序包括测定元件和整个基因组序列。
这种方法可以同时检测多个基因，从而更全面地了解肿瘤的遗传变异情况。
目前，在全外显子组测序领域，Illumina、Thermo Fisher Scientific、BGI和华大基因等公司处于领先地位。
3.基于RNA测序的检测这种方法主要用于检测肿瘤的基因表达谱，从而帮助医生更深入地了解肿瘤的分子机制和生物学特性，制定更合适的治疗方案。
这种方法主要由家族技术、Illumina和Thermo Fisher Scientific等公司提供。
二、基于基因测序的肿瘤病理诊断的意义基于基因测序的肿瘤病理诊断具有很多优势。
首先，基因测序可以在肿瘤的早期诊断中发挥重要的作用。
肿瘤的早期诊断对于治疗和预后都有很大的意义。
其次，基因测序可以为肿瘤治疗提供更精确的预测和预测。
通过更全面、更精确地了解肿瘤的遗传变异情况，医生可以更准确地选择治疗手段。
三、基于基因测序的肿瘤病理诊断存在的问题虽然基于基因测序的肿瘤病理诊断具有很多优势，但它还存在着一些问题和挑战。
首先，基因测序技术目前还存在着质量问题，如测序过程会产生各种误差等。
其次，在基因测序的结果分析和解释方面，目前还需要更多的专家和更多的经验。
四、未来的发展趋势未来，基于基因测序的肿瘤病理诊断仍将在临床诊断和治疗中扮演重要的角色。
流式细胞术整体解决方案Attune流式细胞仪|16,000+种流式抗体|60+种荧光染料|明星样品制备试剂|细胞功能试验|PrimeFlow 流式RNA分析2流式细胞术能够从单细胞水平同时分析细胞样本中的基因表达和蛋白表达，还可以检测细胞活性、细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖和细胞氧化等细胞功能。
该技术不仅能获得在单个细胞水平上具有统计学意义的海量数据，还可以更加深入地了解异质性细胞群的详细信息。
无论进行细胞亚群鉴定还是细胞功能研究，流式细胞术都发挥着重要作用，大大推动了科学研究的发展。
前言图1. 流式细胞术实验流程。
合理进行实验设计是保证流式实验成功的关键。
• 免疫学• 炎症• 肿瘤免疫• 实体肿瘤• 神经炎症• 基因编辑• 微生物学了解更多多色流式实验相关信息，请访问 thermofi/flowcytometry完成流式实验通常需要将多种抗体搭配成多色流式实验方案。
这本流式细胞术整体解决方案手册不仅介绍了Invitrogen ™ eBioscience ™ 流式抗体和Invitrogen ™ 流式细胞功能检测试剂，还展示了Invitrogen ™ Attune ™ 流式细胞仪在以下不同研究领域中的应用：流式细胞术整体解决方案实验流程样品制备确定免疫分型抗体选择缓冲液细胞功能检测活细胞死细胞实验对照上机检测3免疫细胞通常需要刺激活化后才能快速增殖或分化为成熟细胞（图2）。
处于活化状态的细胞经常高表达转录因子、细胞因子、趋化因子以及其他调节因子，这些指标均可通过流式细胞术进行检测。
选择合适的激活剂/刺激剂需要根据细胞类型、目的蛋白的表达水平和表达动力学以及具体实验条件而定。
样品制备：免疫细胞刺激试剂图2. 各种免疫细胞刺激试剂。
(A) 功能级抗体（如CD3抗体和CD28抗体）可用于T 细胞的活化和扩增。
(B) eBioscience 细胞刺激剂（Cell stimulation cocktail ），包括PMA 和离子霉素（ionomycin ），可刺激T 细胞产生γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-2（IL -2）和白介素-4（IL -4）。
