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Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG摘要：本实验利用Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG，主要包括利用SDS-PAGE进行蛋白质分离之后，将其转移至NC膜上进行蛋白免疫印迹并进行检测，实验中我们用了正常人血清蛋白，肺炎患者，白血病人患者三种血清，使用彩虹Marker，并用其作出标准曲线，以此求出其余IgG的分子质量，并根据不同样本条带颜色，面积等简要判断不同样本LgG含量的多少并给予解释。

关键词：免疫印迹技术；免疫球蛋白；SDS-PAGE引言：蛋白质免疫印迹技术,是1979年斯坦福大学乔治.斯塔克发明的蛋白质印迹法,继southern-blotting 之后起名 Western-blotting,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究,抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面，是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术，其分析容量大，敏感度高，特异性强，是检测蛋白质性质、表达与分布的一种最常用的方法。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使其去折叠。

聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺和N,N’-亚甲基双丙稀酰胺经共聚合而成。

此聚合过程是由四甲基乙二胺和过硫酸胺激发的。

被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。

人血清中含有人类免疫球蛋白，根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类: lgG、lgA、lgM、lgD、lgE、lgG 是血清的主要抗体成分，占血清免疫球蛋白总量的70%~75%。

在电泳之后，利用抗原抗体结合的特异性，进行蛋白免疫印迹。

1.目的与要求a)掌握SDS-PAGE电源分离蛋白的实验技术和操作；并绘制蛋白质标准曲线,求目的蛋白分子量的方法；b)垂直板电泳装置的安装及灌胶；电泳所用试剂的配制；c)了解电泳过程中常见问题的原因及处理办法，不连续电泳系统分离蛋白质的原理以及垂直板电泳装置的安装和灌胶。

wb实验报告结果WB实验报告结果一、实验目的和背景WB实验是一种常见的实验方法，用于检测和分析蛋白质的表达水平和相对分子量。

通过电泳分离蛋白质样品，再利用特定的抗体与目标蛋白结合，最后通过化学反应显色，可以得出蛋白质的表达情况。

二、实验设计和步骤本次实验旨在探究某种蛋白质在不同条件下的表达情况。

实验设计如下：1. 实验组和对照组的设置：将实验组和对照组分别处理不同的条件，以观察其对蛋白质表达的影响。

2. 细胞培养和处理：将细胞分成实验组和对照组，分别在不同培养基中培养，并添加相应的刺激物。

3. 蛋白提取和电泳：将培养的细胞收集，进行蛋白质提取，并进行电泳分离。

4. 转膜和抗体结合：将电泳分离后的蛋白转移到膜上，并与特定的抗体结合。

5. 显色和成像：利用化学反应显色，观察蛋白质的表达情况，并进行成像。

三、实验结果和分析通过实验的步骤，我们得到了以下结果：1. 实验组和对照组的蛋白质表达情况有明显差异。

在实验组中，某种蛋白质的表达水平较高，而在对照组中较低。

2. 不同刺激物对蛋白质表达的影响不同。

在实验组中，添加A刺激物后，蛋白质的表达水平显著增加；而添加B刺激物后，蛋白质的表达水平几乎没有变化。

3. 蛋白质的相对分子量也存在差异。

在实验组中，蛋白质的相对分子量较大，而在对照组中较小。

通过对实验结果的分析，我们可以得出以下结论：1. 实验组中的某种蛋白质在特定条件下表达水平较高，这可能与刺激物的作用机制有关。

2. 不同刺激物对蛋白质表达的影响不同，这可能是由于刺激物的不同性质和作用方式导致的。

3. 蛋白质的相对分子量差异可能与其结构和功能有关，进一步研究可以揭示这种差异的原因。

四、实验的局限性和改进方向本次实验虽然取得了一定的结果，但仍存在一些局限性：1. 样本数量较少：由于实验条件的限制，我们只能使用有限的样本进行实验。

进一步扩大样本数量可以提高结果的可靠性。

2. 实验条件的控制：虽然我们尽力控制实验条件的一致性，但仍可能存在一些未知因素的干扰。

Western Blot 实验技术手册Western Blot是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达情况。

目前Western Blot已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一.一、Western Blot基本操作流程图细胞/组织蛋白提取↓蛋白定量、蛋白变性上样、电泳↓一转膜↓封闭↓孵育一抗↓洗膜孵育二抗↓洗膜底物孵育↓曝光或显色二.Western Blot操作步骤1.蛋白提取、处理蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。

使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品.对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，然后吸净PBS，加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力），轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).，4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法，Bradford法、和Lorry法或BCA法，一般推荐用BCA法.BCA测定方法如下:A．酶标板操作2、根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；3、各孔加入200μL BCA工作液；4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。

T2拟南芥阳性植物的western blot检测实验报告册一、实验原理Western Blot（WB）是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

WB可用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析，该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，具有SDS—PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。

WB采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

二、实验用物1.实验试剂30%丙烯酰胺、4X分离胶缓冲液、4X浓缩胶缓冲液、上样缓冲液（Loading Buffer）、电泳缓冲液Tris—甘氨酸缓冲系统、电转缓冲液、过硫酸铵溶液（AP，10%）、TEMED、考马斯亮蓝染色液R250、TBST溶液、PBST溶液、封闭液：PBST溶液+5%奶粉。

2.实验器材：孵育盒，剪刀，镊子，小滚子，小绿铲，电转夹子，厚滤纸，海绵，尺子，小梳子，枪头盒，离心管架，小烧杯，量筒，离心管，广口瓶，记号笔，大烧杯，电转电泳系统（槽、电转芯、电泳芯）透明夹子，绿夹子，胶条，移液器，玻璃板，蒸馏水，PVDF 膜。

三、实验步骤1. 蛋白样品制备2. 电泳（配制SDS—PAGE凝胶；上样，第一道是marker，第二道至第六道上蛋白质样品（GAPDH 36kDa），上样量分别为2、4、6、8、10微升；SDS—PAGE电泳电压90v溴酚蓝到达分离胶界面改120V，至溴酚蓝到达凝胶前缘）3. 转膜（选用PVDF膜，预先在甲醇中浸泡2min，然后转入转移缓冲液中浸泡。

电泳结束后，小心轻取卸胶，去掉上层浓缩胶，在分离胶左上切角标记。

将胶，海绵，滤纸，膜，筛孔版按黑色塞孔板、海绵垫、后滤纸、凝胶、PVDF膜、厚滤纸、海绵、白色筛孔板的顺序依次摆放好。

免疫印迹技术实验报告一、引言免疫印迹技术（Western Blotting）是一种用于检测特定蛋白质的定性和定量分析方法。

它基于免疫学原理，通过将待测蛋白质进行电泳分离，并利用抗体与目标蛋白质特异性结合的原理，最终实现对目标蛋白质的检测和定量分析。

本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白质在不同样本中的表达水平，并观察其变化情况，以深入了解该蛋白质的功能和作用机制。

二、实验步骤1. 样本制备首先，我们需要准备样本。

样本可以是细胞或组织。

在实验中，我们选择了A 细胞和B细胞作为样本，分别进行后续实验。

2. 蛋白质提取将A细胞和B细胞分别加入适量的细胞裂解缓冲液，通过离心等操作将细胞裂解并获取蛋白质提取物。

3. SDS-PAGE电泳分离将蛋白质提取物加入SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。

电泳时间和电压根据实验需要来确定。

4. 转膜将电泳分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚丙烯酰胺膜上。

转膜可以通过湿法或半湿法等方法实现。

5. 阻断将转膜后的聚丙烯酰胺膜放入阻断液中，在室温下进行阻断。

阻断的目的是防止非特异性结合。

6. 一抗处理将目标蛋白质的一抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在一抗液中，进行一抗处理。

一抗的选择根据目标蛋白质的特异性来确定。

7. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从一抗液中取出，进行洗涤。

洗涤的目的是去除非特异性结合的抗体。

8. 二抗处理将与目标蛋白质一抗结合的二抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在二抗液中，进行二抗处理。

9. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从二抗液中取出，再次进行洗涤，确保清洗干净。

10. 显色将合适的显色剂加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在显色剂中，进行显色反应。

显色剂的选择根据实验需要和目标蛋白质的特性来确定。

11. 照相观察显色结果，并使用相机拍摄转膜的聚丙烯酰胺膜，记录实验结果。

三、结果与讨论根据实验步骤，我们成功地使用免疫印迹技术检测了A细胞和B细胞中目标蛋白质的表达情况。

免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹（Western blot）是一种常用的生物学实验技术，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平，以及研究其功能和相互作用。

本实验旨在通过免疫印迹技术，探究细胞中特定蛋白质的表达情况，为进一步的研究提供基础数据。

实验材料与方法：材料：1. 细胞或组织样本2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳样品缓冲液4. 聚丙烯酰胺凝胶5. 转印膜6. 蛋白质标记物7. 抗体8. 酶联免疫检测试剂盒方法：1. 提取细胞或组织中的蛋白质，制备细胞裂解液。

2. 将蛋白质样品与电泳样品缓冲液混合，进行电泳分离。

3. 将分离后的蛋白质转移到转印膜上。

4. 在转印膜上进行阻断，以防止非特异性结合。

5. 添加特异性抗体，与目标蛋白质结合。

6. 使用酶联免疫检测试剂盒，检测抗体与蛋白质结合的信号。

7. 分析实验结果，得出结论。

实验结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功检测到目标蛋白质在细胞或组织中的表达情况。

实验结果显示，在细胞裂解液中，目标蛋白质呈现出明显的条带，证明其在细胞中存在且可被提取。

进一步分析实验结果，我们可以得出以下结论：1. 目标蛋白质在不同组织中的表达水平存在差异。

通过比较不同组织样本中目标蛋白质的表达情况，我们发现其表达水平在不同组织中存在差异。

这可能与细胞功能的差异以及组织特异性基因的调控有关。

2. 目标蛋白质在细胞发育过程中的变化。

通过对细胞或组织样本在不同发育阶段进行免疫印迹实验，我们可以观察到目标蛋白质在细胞发育过程中的表达变化。

这些变化可能与细胞分化、增殖以及功能转变等过程密切相关。

3. 目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。

通过免疫印迹实验，我们可以进一步研究目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。

通过添加不同抗体，我们可以检测到目标蛋白质与其他蛋白质的结合情况，揭示其在细胞信号传导和调控网络中的功能。

总结：免疫印迹实验是一种非常有用的生物学实验技术，可以用于检测特定蛋白质的表达水平以及研究其功能和相互作用。

Western Blot 实验技术手册Western Blot 是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达情况。

目前 Western Blot 已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一 .一、 Western Blot 基本操作流程图细胞 / 组织蛋白提取↓ 蛋白定量、蛋白变性上样、电泳↓一转膜↓封闭↓孵育一抗↓洗膜孵育二抗↓洗膜底物孵育↓曝光或显色二. Western Blot 操作步骤1.蛋白提取、处理蛋白提取的质量直接决定着WB 结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。

使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品.对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS 漂洗 2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，然后吸净 PBS，加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4℃离心 12,000 rpm ，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力），轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80 °C，每约 5 mg 加入约 300 μl预冷的裂解液lysis buffer ，冰浴匀浆后置于4℃摇动 2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml,理想的蛋白浓度应为 1-5 mg/ml). ，4℃离心 12,000 rpm ， 20 min ，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法，Bradford 法、和 Lorry 法或 BCA 法，一般推荐用 BCA 法 .BCA 测定方法如下:A ．酶标板操作1.标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂孔号 1 2 3 4 5 6 7 8蛋白标准溶液（μL）0 1 2 4 8 12 16 20去离子水（μL）20 19 18 16 12 8 4 0对应蛋白含量（μg）0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.02、根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（ 50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀；3、各孔加入 200 μ L BCA工作液；4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。

蛋白质二维电泳对外技术服务说明一、样品要求：1、样品新鲜。

说明：组织样本及细胞采样后应立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂，运输过程中血液、血清样品4℃保存，其它样品-20℃保存，不超过48小时（若外地邮寄，除血液、血清及细胞外请用干冰）。

2、样品蛋白的总量不少于1mg。

说明：组织样本每份约250-500mg；细胞样品每份5*107细胞数以上；血液、血清等样品大于5mL，且不能溶血；蛋白提取物要求蛋白浓度大于5mg/mL，总量不少于1mg，且均匀无沉淀，样品中无盐成分；植物或真菌样品量湿重不少于2g；富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于3g。

3、其它要求及说明：（1）蛋白溶液中不得含有SDS等离子型去污剂，缓冲液成分为说明：为保证实验效果，请尽量告知缓冲液成分。

（2）样品中应不含核酸、脂类、多糖等影响电泳分离效果的成分。

如样品较特殊（富含核酸，盐分，脂类，色素，多糖等影响双向电泳而需去除的杂质或需浓缩样品），请预先说明：（3）样品PI值说明：如目的蛋白等电点偏碱，不能保证分离效果，因而通常情况下不收PI值大于8.0的碱性蛋白。

（4）此说明中样品量适用于考染，如需银染，请另行咨询。

（5）样品如有特殊要求，请说明：二、收样确认：1、公司收到客户样品后，将会对样品外观及包装进行初步检验，若是邮寄过程中出现的问题我公司将不承担责任，确认样品无问题后，我公司会按客户要求正确保存样品；2、公司在样品提取过程中将对样品的状态（如气味、颜色等）进行检验，，若是由于邮寄等原因造成样品变质，我公司将不承担责任；3、客户提供样品若为组织或细胞，我公司将根据样品的特点，选择适当的蛋白提取方法提取纯化蛋白，并按Bradford法测定样品蛋白的总浓度，如浓度不合格，公司将与客户协商后确定下一步方案；4、客户提供样品若为蛋白样品，客户应将其溶解在裂解液中,-20℃保存，并保证蛋白浓度大于5mg/mL，蛋白总量不小于1mg，收到样品后我公司将按Bradford法再检测浓度，若不合格，将退回样品；5、进行正式实验前，我公司将和客户协商上样量等问题；6、若样品不符合上述样品收取规定，我公司将和客户协商决定重新送样或退样。

western印迹实验报告
Western印迹实验报告
Western印迹是一种用于检测蛋白质的实验方法，通过这种方法可以确定蛋白
质在混合物中的存在和浓度。

在这篇报告中，我们将介绍一项关于Western印
迹实验的研究。

首先，我们收集了一些细胞样本，并提取了其中的蛋白质。

接着，我们使用聚
丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将这些蛋白质分离开来。

然后，我们将这些蛋白质转移到一块聚丙烯酰胺膜上，并用特定的抗体将目标蛋白质标记出来。

在Western印迹实验中，我们使用了一种叫做免疫印迹的技术，通过这种技术
可以检测特定的蛋白质。

我们将膜与特定的抗体结合，然后使用一种叫做辣根
过氧化物酶的酶来标记这些抗体。

最后，我们使用化学发光或荧光等方法来检
测这些标记物，从而确定目标蛋白质的存在和浓度。

通过这项实验，我们成功地检测到了我们感兴趣的蛋白质，并确定了它们在样
本中的浓度。

这项研究为我们提供了关于细胞样本中蛋白质的重要信息，有助
于我们更好地理解细胞的功能和生物学过程。

总之，Western印迹实验是一种非常有用的方法，可以帮助科研人员确定蛋白
质的存在和浓度。

通过这项实验，我们可以更深入地了解细胞样本中的蛋白质，为生物学研究提供重要的数据支持。

Western印迹实验的结果对于理解细胞的
功能和疾病机制具有重要意义。

最全的western blot技术⼿手册蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。

WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。

本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。

A 蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备B 电泳1 PAGE胶的制备2 蛋白分子量Marker3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳C 转膜与显色（Western Blot）1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测：丽春红4 膜的封闭5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色D 常见问题分析与解决方案附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制WB概述: 检测原理:A 蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择）3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

A-1 细胞或组织裂解A-1-1 细胞裂解裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒全细胞NP-40 or RIPA（附录1）全蛋白抽提试剂盒细胞质（可溶蛋白）Tris-HCl（附录1）胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质（细胞骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附录1）蛋白分级抽提试剂盒细胞质（磷酸化蛋白）磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA（附录1）膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA（附录1）核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA（附录1）线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2 flask).3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力）6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2 组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,3A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制：备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下：所有步聚均需在通风橱中进行：1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液.2. 用盐酸HCl 调至pH 9.03. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发.4. 冷却至室温5. 再调pH 至 9.06. 再煮沸至无色7. 重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH 9.08. 用水定容至原体积9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用.A-3 蛋白定量Bradford 法 Lowry 法或BCA 法（均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。

细胞培养实验和Western Blot实验报告姓名：张人龙学号：YX16100508115 专业：中医骨伤科学实验一：细胞培养1.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。

2.实验原理从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。

细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。

近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。

细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。

直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。

所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。

3.实验用品3.1 材料和标本乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)3.2 器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

2.3 试剂含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。

4.实验方法4.1 原代细胞培养4.1.1 原理细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

实验报告Western Blotting依然是目前分离和检测蛋白最常用到的一种技术方法，但是要将这种技术变成你的有利手段，并不容易。

因此优化实验操作手册至关重要，但是，正如Bio-Rad成像系统市场经理Ryan Short所说的，“大多数研究人员并不是Western blot技术专家——他们要解答的是更大的问题”，Ryan继续说道，“问题是大多数人都不知道何处需要优化。

坦率地说，Western blot检测过程耗时太长。

如果每个印迹实验都有花费你两天时间，那么还有多少时间确实能用于优化Western blot呢？”当然，类似抗体质量，封闭液和转印效率等因素也扮演了关键角色，让我们来仔细看看，现今还有哪些优化的技巧和工具。

加入合适数量的蛋白虽然步骤优化至关重要，但是传统的Western Blot整个过程本身过长确实也带来了困难。

Short相信一个成功的Western Blot实验操作指导中，最重要的因素之一就是确定每份凝胶中加入的蛋白量。

“这是非常重要的，因为大多数进行WB实验的研究人员都有一个兴趣蛋白，需要与内参（看家蛋白）比对”，Short说，“如果您的兴趣蛋白是一个低表达的蛋白，而你的内参蛋白是一种高表达的蛋白，那么在检测的动态范围内就必须有两种蛋白，以确保结果的可靠性。

因此可能需要加大低表达蛋白的数量，大概有50-60ug蛋白，但在这个量上内参蛋白信号可能会远远超出了线性检测范围了。

了解这些动力学对于Western blot获得好结果十分重要。

”有效的封闭：脱脂牛奶以外使用正确的封闭液将获得完全不同的一个结果。

虽然牛奶是经常被使用到的封闭液，但现如今这种封闭液也许不如高质量商业化的封闭液。

“封闭液应该结合到膜上不与相应抗体结合的区域”，Thermo Scientific公司Priya Rangaraj表示，“如果做不到这一点，你会看到斑点和增加的背景”。

目前Western市面上一些封闭液包括Thermo Scientific的StartingBlock Blocking Buffer，LI-COR Bioscience公司的Odyssey Blocking Buffer，以及来自Bio-Rad的PBS（含有1%酪蛋白封闭液）。

WB工作总结
经过一段时间的努力工作，我想对我的工作进行一次总结。

在这段时间里，我
深刻地体会到了工作的重要性和价值，也收获了许多宝贵的经验和教训。

首先，我要感谢我的团队成员们，他们在工作中给予了我很大的帮助和支持。

在工作中，我们相互合作，共同努力，为实现公司的目标而不懈奋斗。

我们之间的团队精神和合作意识让我们在工作中取得了不俗的成绩。

其次，我要反思自己在工作中的不足之处。

在这段时间里，我发现自己在沟通
能力和解决问题的能力上还有很大的提升空间。

我会在今后的工作中更加努力地克服这些问题，提高自己的综合素质。

另外，我还要对公司的领导和同事们表示感谢。

他们在工作中给予了我很多指
导和支持，让我能够更好地适应工作环境，提高工作效率。

在今后的工作中，我会更加努力地学习和提高自己，为公司的发展贡献自己的力量。

总的来说，这段时间的工作让我受益匪浅，也让我更加深刻地认识到了工作的
重要性。

我会在今后的工作中更加努力地提高自己的能力，为公司的发展贡献自己的力量。

希望在未来的工作中能够取得更好的成绩，为公司的发展做出更大的贡献。

wb实验合同个人对个人
Western Blotting 个人实验合同
甲乙双方经协商，就下列服务达成本合同，以期共同遵守执行
乙方责任
1被原样品由乙方提供；应保证所提供的蛋白(抗原)样品没有变性、变质，保证样品中有相应分子量蛋白的成分，每个样品(做一个抗体的表达)最少提供被检蛋白的量应>0.3-0.5mg提供的蛋白浓度应>8-10mg/ml。

需SDS变性后低温保存提供到我公司。

2.乙方对被检测蛋白进行蛋白定量分析，最好提供蛋白定量数据报告或提供蛋白来源及制备文字报告(何种动物种属_：组织来源：提取方法：蛋白定量：蛋白浓度：mg/ml缓冲体系：等)
甲方责任
1.甲方提供Western Blot的试验服务：每张膜可做1-8个样品：自带抗体(我公司不保证结果)，检测方法：ECL化学发光检测法：预计完成时间：两周工作日左右。

2.验所用试剂：除一抗体外，其他所有辅助试剂免费由甲方提供，乙方无须另行购买：最后提供检测结果：甲方提供转膜后抗体表达该蛋白的电泳检测结果为：a.X光片ECL曝光原始胶片或自动凝胶电泳成像系统图像扫描图片。