微生物思考题

二．微生物的纯培养和显微技术

无菌技术

• 用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；

• 在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境；

稀释倒平板法：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！

涂布平板法：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！

选择培养分离：1、抑制大多数其它微生物的生长；

2、使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。

3、使待分离的微生物生长“突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。

第二章思考题

1、为什么说Koch等建立的微生物纯培养技术是微生物学建立与发展的基石？一般可用哪些方法获得微生物的纯培养？

不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板(culture plate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Koch建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。

常用固体培养基分离纯培养：

1、 稀释倒平板法(pour plate method)

2、 涂布平板法(spread platemethod)

3、 平板划线分离法(streak plate method)

4、 稀释摇管法(dilutlon shake culture method)

此外还有液体培养基分离纯培养。通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的概率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数(一般应超过95%)表现为不生长。

单细胞（孢子）分离：采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比。

2、微生物的最显著特征就是个体微小，通常只能通过显微镜进行观察。试列举在显微观察中（光镜和电镜）通过改变样品的反差以改善观察效果的技术及方法。

暗视野法：暗视野显微镜利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜，因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。主要用于观察生活细菌的运动性。

相差显微镜：由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过未经染色的标本时，直射光和衍射光的光程会有差别，随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改

变，产生相位差。相差显微镜配备有特殊的光学装置——环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。使人们能在不染色的情况下比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。

荧光显微技术：在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体。

3、试利用表格形式对各类显微镜在原理、样品制备和观察方面的异、同进行概括、比较。

原理 样品制备 观察

普通光学显微镜 利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像 制片

暗视野显微镜 利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜而是由样品反射或折射后再进入物镜

相差显微镜 利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。

荧光显微镜 在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体

透射电子显微镜 电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，可以聚集成像

扫描电子显微镜 电子枪发出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行扫描，电子束扫到的地方就可激发样品表面发出二次电子，二次电子由探测器收集，并在那里被闪烁器变成光信号，再经光电倍增管和放大器又变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。样品上产生二次电子多的地方，在荧光屏上相应的部位就越亮，我们就能得到一副放大的样品立体图像。

扫描隧道显微镜 利用了量子力学中的隧道效应

4、 试找到一篇使用微生物照片的文献，分析该文为什么要使用微生物照片，采用的是何种显微观察技术？依你之见，该文作者的这张照片还可以用哪些技术获得？

三．微生物类群与形态结构

古生菌在进化谱系上与真细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与真细菌较为接近，同属于原核生物。

球菌细胞个体呈球形或椭圆形，不同种的球菌在细胞分裂时会形成不同的空间排列方式，常被作为分类依据。

杆状细菌的排列方式常因生长阶段和培养条件而发生变化，一般不作为分类依据。

弧菌：菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。

螺旋菌：菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异。鞭毛二端生。细胞壁坚韧，菌体较硬。

螺旋体菌：菌体柔软，用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。

柄杆菌：细胞上有柄（stalk）、菌丝（hyphae）、附器（appendages）等细胞质伸出物，细胞呈杆状或梭状，并有特征性的细柄。一般生活在淡水中固形物的表面，其异常形态使得菌体的表面积与体积之比增加，能有效地吸收有限的营养物；

德国科学家H. N. Schulz等1999年在纳米比亚海岸的海底沉积物中发现的一种硫磺细菌（sulfur bacterium），其大小可达0.75 mm，Thiomargarita namibiensis，---------“纳米比亚硫磺珍珠”。其体积比E . fishelsoni还大100倍。该菌细胞内约98％的空间都被一个胞液内富含硝酸盐的液泡所占据，而厚度在0.5-2.0 mm、充满硫粒的细胞质层则环绕在液泡的周围。该细胞质层非常薄，其厚度类同于大多数细菌，足以保证适当的扩散速率。液泡中的硝酸盐则被用作硫氧化的电子受体，以产生能量。

一种真核微生物Nanochlorumeukaryotum，直径仅有1 ～ 2 mm，但它却是真正的真核生物，拥有一个核，一个叶绿体和一个线粒体。

证实（研究）细胞壁存在的方法：

（1）细菌超薄切片的电镜直接观察；

（2）适当的质、壁染色，可以在光学显微镜下看到细胞壁；

（3）机械法破裂细胞后，分离得到纯的细胞壁；

（4）制备原生质体，观察细胞形态的变化；

脂多糖的主要功能：

1）LPS结构的多变，决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性；

根据LPS抗原性的测定，沙门氏菌属(Salmonella)的抗原型多达2107种。这种O-特异侧链种类的变化，一方面可使细菌躲避宿主免疫系统攻击，保持感染成功。另一方面，也使我们可以用灵敏的血清学方法对病原菌进行鉴定，在传染病的诊断中有其重要意义。

2）LPS负电荷较强，与磷壁酸相似，也有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细胞表面浓度的作用，对细胞膜结构起稳定作用。

3）类脂A是革兰氏阴性细菌致病物质——内毒素的物质基础；

4）具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能；

5）许多噬菌体在细胞表面的吸附受体；

周质空间是进出细胞的物质的重要中转站和反应场所。在周质空间中，存在着多种周质蛋白（periplasmic proteins），包括水解酶类、合成酶类、结合蛋白和受体蛋白

特殊细胞壁的细菌：

某些分枝杆菌和诺卡氏菌的细胞壁主要由一类被称为霉菌酸（Mycolic acid）的枝链羟基脂质组成，后者被认为与这些细菌感染能力有关。

由磷脂分子形成的双分子膜中加入甾醇类物质可以提高膜的稳定性：

真核生物细胞膜中一般含有胆固醇等甾醇，含量为5%-25%。

原核生物与真核生物的最大区别就是其细胞膜中一般不含胆固醇，而是含有hopanoid（藿烷类化合物）。

单由磷脂分子形成的膜是不稳定的，但如果在其中加入甾醇类物质就可以提高膜的稳定性（已有实验室证据），而真核生物细胞膜中就含有胆固醇，其含量在5%-25%。而原核生物与真核生物的最大区别就是其细胞膜中一般不含胆固醇等甾醇，而是含有hopanoid类甾

醇，其作用被认为也是稳定细胞膜的结构。而这种含有hopanoid类甾醇被认为与地球上化石燃料的形成有很大关联。

化石燃料之所以形成，是由于有机物沉积到底下深处后被微生物所作用而氧化成二氧化碳，然后在高温和厌氧的条件下，形成石油和煤炭。据认为，地下沉积物中碳的总量为1016吨。现在已有越来越多的证据表明，这些沉积到地下形成化石燃料的有机物有90%以上都是来自细菌。其实验证据是90%的石油等的前体物质是kerogen（油原，或称油母岩质），而研究表明，从kerogen主要是由细菌特有的hopanoid类甾醇所组成。显然是微生物活动分解动植物的遗体后的结果。目前估计，在地下沉积物中细菌特有的hopanoid类甾醇的含量高达1011-12吨，与目前地球上存在的活的生物（living organisms）体内含有的有机碳的含量相当（也是1011-12吨）。因此，hopanoid被认为是地球上含量最丰富的有机分子。

硫粒：很多化能自养菌在进行产能代谢或生物合成时，常涉及对还原性的硫化物如H2S，硫代硫酸盐等的氧化。

在环境中还原性硫素丰富时，常在细胞内以折光性很强的硫粒的形式积累硫元素。当环境中环境中还原性硫缺乏时，可被细菌重新利用。

不同种类细菌的膜在其结构和功能方面存在很大差异。这种差异非常巨大且具有特征性，因此膜化学可被用于对细菌进行鉴定。

微生物储藏物的特点及生理功能：

• 不同微生物其储藏性内含物不同。例如厌气性梭状芽孢杆菌只含PHB，大肠杆菌只储藏糖原，但有些光合细菌二者兼有。

• 微生物合理利用营养物质的一种调节方式。当环境中缺乏能源而碳源丰富时，细胞内就储藏较多的碳源类内含物，甚至达到细胞干重的50%，如果把这样的细胞移入有氮的培养基时，这些储藏物将被作为碳源和能源而用于合成反应。

• 储藏物以多聚体的形式存在，有利于维持细胞内环境的平衡，避免不适合的pH，渗透压等的危害。例如羟基丁酸分子呈酸性，而当其聚合成聚-β-羟丁酸（ PHB）就成为中性脂肪酸了，这样便能维持细胞内中性环境，避免菌体内酸性增高。

• 储藏物在细菌细胞中大量积累，是重要的自然资源。

气泡的膜只含蛋白质而无磷脂。二种蛋白质相互交连，形成一个坚硬的结构，可耐受一定的压力。膜的外表面亲水，而内侧绝对疏水，故气泡只能透气而不能透过水和溶质。

将蓝细菌培养在一个严密地塞紧瓶塞的瓶子里，细菌会在水面漂浮。但如果用锤子敲击瓶塞，则原来漂浮的细菌就会沉到瓶底。通过对实验前后细菌的检测表明，突然增加的压力破坏了气泡，从而使微生物失去了浮力。

细菌芽孢的特点：

整个生物界中抗逆性最强的生命体，是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。