基因工程(生物化学)

5´ 3´
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3´
5´
5´
3´
DNA
连接酶 3´
5´
5´
拼 接
片 段
3´
重
重
组
组
5´ 3´
5´3´
体
体
3´ 5´
3´ 内切酶
5´
(ruvC)
3´ 5´
5´ 3´
3´
5´
5´
3´
DNA
5´
连接酶
3´ 5´
3´
3´
53´´
5´
E.coli同源重组分子机制：
需数十种酶参与，其中最关键的是：RecA蛋白、 RecBCD复合物及RuvC蛋白。 RecA蛋白是由rec基因编码的，可结合单链DNA， 形成RecA—ssDNA复合物。 RecA蛋白具有多个DNA 结合位点，因此线性RecA—ssDNA复合物可以通过插 入同源的DNA双螺旋的大沟，形成三链DNA中间物， 并通过旋转逐渐取代双螺旋DNA中的一条链，与互补 链配对，将同源链置换出来，产生新的双链DNA分子， 从而完成DNA重组。
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细 胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转 化作用 (transformation)。
例如：当细菌破裂溶解（溶菌）时，其裂解 的DNA片断可被另一细菌作为外源DNA摄取，并 重组整合进自己的基因组，随细菌基因一起复制、 转录、翻译，使受体菌获得新的遗传表型。
目录
2.倒位重组及后果： 以hix为特异重组位点，在倒位酶作用下，两个hix 之间的H片段进行特异位点重组(倒位)。其结果是 H2和rH1基因不表达，因为没有了启动子。但远方 的H1基因因没有阻遏蛋白的抑制而得以表达。所以， 倒位重组的后果是表达H1鞭毛蛋白而不表达H2鞭毛 蛋白。因此，沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛 蛋白质H1和H2的交迭表达。在某一时期，菌体表达 其中的一种，但从不表达两种。

➢ 与前述操纵子的基本组成一样，乳糖操纵子也是由结构基因和调控区组成的 ➢ 乳糖操纵子包括Z、Y和A三个结构基因 ➢ Z结构基因编码β-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖 ➢ Y结构基因编码半乳糖透过酶，促使半乳糖透过酶进入细菌内 ➢ A结构基因编码乙酰转移酶，催化半乳糖形成乙酰半乳糖 ➢ 调控区包括调节基因（I）、启动子（P）、操纵基因（O）及启动子上游的一个CAP结合位点，
第一节 基因表达的调控
二、基因表达调控的概念和意义
（一）基因表达调控的概念
➢ 基因表达调控是指细胞或生物体在接收内外环境信号刺激 或适应环境变化的过程中，在基因表达水平上所做出的应 答，即基因组内的基因如何被表达、表达多少等
➢ 基因表达调控大致可以在5个层次上进行，即转录前、转 录、转录后、翻译和翻译后
➢ 基因表达是指在一定的调节机制的控制下，基因组DNA经 转录、翻译等一系列过程，合成具有特异生物学功能的蛋 白质的过程
➢ 并非所有基因表达过程都产生蛋白质，rRNA、tRNA编码 基因转录生成功能型RNA的过程也属于基因表达
第一节 基因表达的调控
一、基因表达的概念、特点及方式
（二）基因表达的特点--时间特异性
5′-侧上游，主要控制整个结构基因群的转录
第一节 基因表达的调控
三、原核生物基因表达的调控
（一）操纵子的基本组成
➢ 3．操纵基因 ➢ 操纵基因是指能被阻遏蛋白特异性识别并结合
的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子 序列重叠 ➢ 当阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻遏蛋白会阻 碍RNA聚合酶与启动子结合或使RNA聚合酶 不能沿DNA链向前移动，从而阻遏转录的进行
（一）操纵子的基本组成
➢ 1．结构基因 ➢ 操纵子中被调控的编码蛋白质的基因称为结构基因 ➢ 一个操纵子中含有2个以上的结构基因，多的可达20个以上 ➢ 各结构基因头尾衔接、串联排列，组成结构基因群

实验二 基因组总ＤＮＡ提取
一、实验目的
掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。
生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。
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五、思考题
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如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？
01
实验目的
02
掌握重组质粒的转化方法
03
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实验六 重组质粒的转化
转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。
化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。
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ＤＮＡ重组、转化 ＭＨＣ与pMD18-T连接 DH5a感受态细胞制备
转化、平板涂布、培养
筛选与鉴定 抗生素抗性筛选 挑单菌落培养 提取质粒 质粒酶切、电泳检测
2.微量移液器的使用
将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头

生物化学与基因工程的联系生物化学是研究生物分子结构和功能的一门学科，而基因工程则是利用人工手段对基因进行改造，从而改变生物的基因组和表型。

它们看似是两个截然不同的学科领域，但实际上，它们之间存在着密不可分的联系。

生物化学是基因工程的理论基础。

生物体内的基因是由DNA 分子构成的，而基因工程的核心技术就是将外源DNA片段引入到宿主细胞的基因组中，因此对DNA的结构和功能的深入了解，有利于我们更好地进行基因工程研究和实践操作。

举个例子，基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑就是近年来快速发展起来的基因工程技术之一，它利用特定的酶切剪切DNA链，再引入相应的外源DNA，从而实现对目标基因进行编辑和修饰。

但是要实现这样的编辑，就需要对CRISPR-Cas9技术的原理和分子机制有深入的认识，这就需要生物化学的支撑。

另外，在基因工程中常用的载体也是由生物化学方法提供的，如质粒、病毒等。

质粒是一种很常见的载体，其中包含了可以表达目标基因的DNA区域和维持其稳定性的基因元件。

生物化学的技术可以使我们更好地设计和构建这样的载体，使其具有更好的表达效率和特定的表达时序，从而更好地实现基因工程的目标。

生物化学还可以为基因工程的研究提供重要的工具和试剂。

如PCR技术，可以在短时间内扩增某一特定序列的DNA，从而方便我们获得所需的DNA片段；蛋白质表达和纯化技术，可以大量生产纯净的重组蛋白，为研究和应用提供了充足的物质基础。

基因工程的应用主要涉及到医药、农业、生物技术等多个领域。

举个例子，利用基因编辑技术可以治疗一些遗传疾病，如囊性纤维化等；利用转基因技术可以改良农作物的生长性状和抗病能力。

生物化学正是为这些应用提供了理论和技术支撑。

总之，生物化学和基因工程之间紧密联系，互相促进和支撑。

我们要深入研究基因的分子机制和生物大分子的结构与功能，来推动生物技术和基因工程的快速发展。