采用噬菌体展示技术筛选黄曲霉毒素B_1模拟抗原表位
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基金项目:“十五”国家重大科技专项课题(N o.2001BA804A20)作者简介:邓省亮,男,硕士研究生1通讯作者:许杨,女,教授,博士生导师2江西科技师范学院 O ’DONNE LL 根据生物系统进化证据,建立了水稻枯萎病赤霉群生物地理起源假说,将36个生物种中的24个种的地理起源编为非洲、澳大利亚、亚洲及美国4个组[8]。
另12个种为不确定组。
在对该群的分子系统学研究时指出,关于亚洲分枝,由于采样原因,只获得主要来源于日本的8个系统发生明确的种,且不包括串珠镰刀菌F .verticillioides 。
相反,根据菌株来源,将F .verticillioides 归为南非组。
参考文献1 NIRE NBERG H I ,O ’DONNE LL K.New Fusariium species andcombination within the G ibberellafujikuroi species com plex[J ].M ycologia ,1998,90:4342458.2 LES LIE J F ,M ARAS AS W F ,SHEPHARD G S ,et al.Duckling toxicityand the production of fum onisin and m oniliform in by is olates in the a and Fmating populations of G ibberella fujikuroi (Fusarium m oniliforme )[J ].Appl Eviron M icrobial ,1996,62:118221187.3 W AA LWI J K C ,BAAYE N R P ,DE K ONING J R ,et al.Discordancegroupings of Fusarium spp from section E legans ,liseola and Dlam inia based on ribos omal ITS1and ITS2sequence [J ].M ycologia ,1996,88:3162328.4 O ’DONNE L K,CIGE LNIK E.T w o divergent introgenom ic rDNA ITS2types within a m onophyletic linage of the fungus Fusarium are nonortholog ous[J ].M olec Phy Ev ol ,1997,7:1032116.5 王晓英,刘秀梅.串珠镰刀菌伏马菌素产毒株聚合酶链式反应检测方法的研究[J ].卫生研究,2003,32(3):2282231.6 王晓英,刘秀梅.串珠镰刀菌分离菌株PCR 筛选鉴定方法的研究[J ].中国食品卫生杂志,2005,17(2):1452150.7 VOIG T K,SCH LEIER S ,BRUCK NER B.G enetic variability inG ibberella fujikuroi and s ome related species of the genus Fusarium based on random am plification of polym orphic DNA (RAPD )Curr [J ].G enet ,1995,27:5282535.8 O ’DONNE LL K,E LIZ ABETH C ,HE LG ARD I N.M olecular systematcsand phylogeography of the G ibberella fujikuroi species com plex [J ].M ycologia ,1998,90(3):4652493.收稿日期:2006202225文章编号:100028020(2007)0120059204・论著・采用噬菌体展示技术筛选黄曲霉毒素B 1模拟抗原表位邓省亮 许杨1 刘仁荣2南昌大学中德联合研究院食品科学教育部重点实验室,南昌 330047摘要:目的 从随机肽库中筛选黄曲霉毒素B 1模拟抗原表位,以建立无需黄曲霉毒素B 1偶联抗原的免疫学检测方法。
方法 利用噬菌体展示技术,以抗黄曲霉毒素B 1单克隆抗体为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和淘选,E LIS A 鉴定阳性克隆,通过DNA 测序对每个阳性克隆进行定性分析。
结果 通过4轮结合Π扩增循环,获得了能与抗黄曲霉毒素B 1单克隆抗体结合的肽,采用间接竞争E LIS A ,筛选到了4株能抑制黄曲霉毒素B 1的阳性克隆子,经DNA 测序得到HXX DPXH 共有序列,其中X 为任意氨基酸。
以其中P10噬菌体阳性克隆建立竞争E LIS A 方法,线性范围为500～2000pg Πml ,检测下限为50pg Πml 。
结论 利用噬菌体展示技术筛选到了黄曲霉毒素B 1模拟抗原表位,并以其代替黄曲霉毒素B 1偶联抗原建立了免疫学检测方法。
关键词:黄曲霉毒素B 1 单克隆抗体 噬菌体展示肽库 模拟表位中图分类号:TS20113 TS20116 R155152 文献标识码:BMimic epitope of aflatoxin B 1screened by phage display techniqueDENG Shengliang ,XU Yang ,LIU R enrongS ino 2G erman Joint Reserch Institute ,the K ey Laboratory of F ood Science of M OE ,Nanchang University ,Nanchang 330047,ChinaAbstract :Objective T o screen mimic epitope from phage 2display random peptide libraries as s ources of peptides that mimic the binding of aflatoxin B 1to m onoclonal antibodies raised against the toxin and establish immunoassay for aflatoxin B 1.Methods The m onoclonal antibody against the aflatoxin B 1was used as ligand to screen the binding peptide from the Ph.D.27peptide library with phage display and the specificity of colons were identified by E LIS A.The peptide sequences of positive phage clones were determined and analyzed by DNA sequencing.R esults A fter four rounds of panning ,the binding peptides were screened from random peptide libraries.Through indirect com petitive E LIS A ,4positive clones could inhibited aflatoxin B 1and HXX DPXH was characterized by DNA sequencing ,X is random amino acid.Then com petitive E LIS A was established for clone phage 10,the linear ranges of the inhibition curves were between 100pg Πml第36卷 第1期2007年 1月卫 生 研 究JOURNA L OF HYGIE NE RESE ARCH V ol.36 N o.1Jan. 200759and2000pgΠml,the detecting limit was50pgΠml.Conclusion The mimic epitope of aflatoxin B1antigen was obtained success fully by the phage display technigue and it is effective substitutes for aflatoxin B12protein conjugate in the immunoassay.K ey w ords:aflatoxin B1,m onoclonal antibody,phage2display peptide library,mimic epitope 黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,称AF B1)是真菌的次级代谢产物,主要是由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和集峰曲霉(Aspergillus nomius)产生[1]。
它广泛存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中,是目前化学致癌物中最强的一种致癌诱变剂,毒性比氰化钾强10倍,致癌性比二甲基亚硝胺强75倍。
1993年AF B1被WH O的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物,其作用的靶器官主要为肝脏[2]。
目前,检测食品中AF B1通常使用的快速筛选方法是酶联免疫吸附法(E LIS A),以此方法进行检测需要以AF B1偶联抗原和抗体为基础,但目前存在毒素标品昂贵,进口受限等问题,制约了其应用和推广。
本研究采用噬菌体展示技术筛选AF B1模拟抗原表位,通过筛选和鉴定获得的结合肽替代传统的AF B1偶联抗原,建立其无毒免疫学分析方法。
1 材料与方法111 材料随机噬菌体7肽库(Ph1D127T M Phage Display Peptide Library K it)购自New England Biolabs公司;含有抗AF B1单克隆抗体的腹水由中国协和医科大学基础医学研究所提供;辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体购自Parmacia公司;AF B1标准品购自北京标准物质研究中心;96孔酶标板购自C oster公司。
112 方法11211 单克隆抗体的纯化 用辛酸2饱和硫酸铵法对抗AF B1单克隆抗体进行纯化,用S DS2PAGE对抗体纯度进行鉴定。
