PCR技术教程.ppt

Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
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循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
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特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
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原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。

模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性

数据处理
对实验数据进行统计分析，如计算Ct值、分析扩增效率等。
04
pcr技术的优化和注意事项
优化pcr反应条件
01
02
03
温度循环
优化pcr反应的变性、退 火、延伸等温度循环，以 提高扩增效率和特异性。
镁离子浓度
调整镁离子浓度，以获得 最佳的pcr扩增效果，镁 离子浓度过高或过低都可 能影响扩增效率。
02
pcr技术的基本原理
核酸的复制
核酸是生物体的遗传物质，负 责携带和传递遗传信息。
在细胞内，核酸通过复制传递 遗传信息，确保遗传信息的稳 定性和连续性。
核酸复制过程中，DNA双链解 开，以母链为模板，r技术基于核酸的复制原理， 通过特定的引物和耐高温的DNA 聚合酶，在体外实现核酸的快速
数字PCR技术具有高灵敏度和高特异性，但设备成本较高；实时PCR技术具有操作简便和 成本较低的优点，但在灵敏度和特异性方面可能略逊于数字PCR技术。
pcr与其他技术的结合
pcr技术与测序技术的结 合
通过将PCR技术和测序技术相结合，可以实 现高通量、高精度的核酸分子检测和分析， 有助于深入研究和理解基因组学和转录组学 等领域。
pcr技术的应用领域
遗传病诊断
通过检测特定基因的突变，对遗传病 进行早期诊断和产前诊断。
微生物检测
用于检测和鉴定细菌、病毒和其他微 生物，在食品安全、环境保护和疾病 控制等领域有广泛应用。
古生物学和考古学
用于分析古代生物遗骸的DNA，研 究物种进化和人类起源。
法医学
用于鉴定个体身份、亲子关系和生物 样本的来源，在犯罪调查和法庭科学 中具有重要应用价值。
扩增。
pcr反应体系中包含模板DNA、 引物、dNTPs和耐高温的DNA聚

耐高温，在热变性时不会被钝化
使DNA聚合酶具有催化活性
包括Tris-HCl（维持PH值），KCl（利于引物的退火），Taq聚合酶保护剂
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4
02 基本实验步骤
实验参数设置
A. 变性的温度与时间
温度取决于DNA模板及PCR产物的G+C含量，时间取决于DNA的长度（95℃）
B. 退火的温度与时间
熔解曲线 确认PCR反应的特异性。
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11
Real Time qPCR
相对定量法分析结果
内参/管家基因 GAPDH、β-actin、18S rRNA、ACTB、β2M......（至少选择两个以上）
核酸表达量计算
R =2−ΔΔCt
例：
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PCR
谢谢观看
Thanks
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（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~35轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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02 基本实验步骤
核酸模板 引物
4种dNTP
Taq DNA聚合酶
Mg2+ 反应缓冲系统
荧光探针法
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Real Time qPCR
基线（Baseline）
是指在PCR扩增反应的最初数个循环
里，荧光信号变化不大，接近一条直线，