下载文档原格式
电泳技术在医学中的应用电泳技术在医学中的应用电泳技术在医学中的应用自从1946年瑞典物理化学家Tiselius教授研制的第一台商品化移界电泳系统问世以来,在近半个多世纪的时间里,电泳技术发展极其迅速。
基于电泳原理的各种仪器设备不断问世,特别是20世纪80年代后, 许多自动化电泳仪器相继为临床实验室所采用,电泳技术已成为基础医学和临床医学研究的重要工具之一。
目前,该技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、有机物、无机离子等的分离和鉴定,甚至病毒与细胞的研究。
特别是电泳所用支持介质由流动相改为固相支持物后,各种各样的电泳分析装置不断推出以适应不同教学、临床和科研工作的需要。
当今,电泳技术与质谱技术联用在后基因组学研究中,正发挥者着巨大的作用,为临床检验的发展带来新的生机与活力。
一、电泳分析仪电泳分析仪可分为两大类:临床实验室常规类,如全自动荧光/可见光双系统电泳仪、全自动醋纤膜电泳仪、全自动琼脂糖电泳仪和全自动琼脂糖电泳仪;科研为主兼做临床样本类,如双向电泳及双向电泳2液相色谱2质谱联用、高效毛细管电泳及高效毛细管电泳2质谱联用、高效毛细管芯片电泳、DNA测序系统。
1. 全自动荧光/可见光双系统电泳仪:具有荧光/可见光双系统,在使用荧光试剂项目如肌酸激酶(CK) 、乳酸脱氢酶(LD)同工酶时为全自动。
只需将样品、试剂、琼脂糖凝胶电泳胶片放好后,操作人员可离机完成试验并得到结果,此为全自动电泳仪。
但是使用可见光项目如蛋白电泳,中途人员需返回,将电泳胶片由电泳槽放入染色系统中才可完成试验。
而最大优点是荧光系统全自动且灵敏度高,准确度高并且采用高压、低温系统,只需要20 min即可完成电泳分析,速度非常快。
2. 全自动醋纤膜电泳仪:为可见光单系统,使用醋纤膜电泳片。
自动化程度高,只需将样品、试剂、电泳片放好,人员可离机完成试验得到结果。
但是因为使用醋纤膜致使灵敏度低,无法分析尿蛋白/脑脊液蛋白,对同工酶分析效果也不理想,多半实验室只用于血清蛋白电泳分析。
乳酸脱氢酶之吉白夕凡创作乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶。
乳酸脱氢酶存在于机体所有组织细胞的胞质内，其中以肾脏含量较高。
乳酸脱氢酶是能催化丙酮酸生成乳酸的酶，几乎存在于所有组织中。
同工酶有六种种形式，即LDH-1(H4)、LDH-2(H3M)、LDH-3(H2M2)、LDH-4(HM3)、LDH-5(M4)及LDH-C4，可用电泳方法将其分离。
LDH同功酶的分布有明显的组织特异性，所以可以根据其组织特异性来协用诊断疾病。
正凡人血清中LDH2，〉LDH1。
如有心肌酶释放入血则LDH1〉LDH2，利用此指标可以观察诊断心肌疾病。
基本信息英文名称: LDH(lactate dehydrogenase)序列信息:1 gsgcnldsar frylmg长度:16 aa{物种来源:Homo sapiens (human)}正常范围:血清135.0~215.0U/L;脑脊液含量为血清的1/10。
乳酸脱氢酶A简介乳酸脱氢酶(LDH)分子量为130~140KDa，由两种亚单位组成:H(暗示heart)和M(暗示muscle)。
它们按分歧的形式排列组合形成含4个亚基的5种同工酶，即:LDH1(H4)、LDH2(H3M1)、LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)、LDH5(M4)。
LDH催化丙酮酸与乳酸之间还原与氧化反应，在碱性条件下促进lactic acid向pyruvic acid方向的反应，而在中性条件下促进pyruvic acid向lactic acid的转化(为逆反应)。
LDH是介入糖无氧酵解和糖异生的重要酶。
由于LDH几乎存在于所有体细胞中，而且在人体组织中的活性普遍很高，所以血清中LDH的增高对任何单一组织或器官都是非特异的。
在AMI时升高迟、达峰晚，故对早期诊断价值不大。
由于半寿期长(10~163小时)，多用于回顾性诊断，如对入院较晚的AMI病人、亚急性MI的诊断和病情监测。
LDH在组织中的分布特点是心、肾以LDH1为主，LDH2次之;肺以LDH3.LDH4为主;骨骼肌以LDH5为主;肝以LDH5为主，LDH4次之。
自制超薄型琼脂糖凝胶板电泳分离检测血清LDH同工酶及成年人参考范围的建立申春艳;陆桂琴;于嘉屏【摘要】目的自制超薄型琼脂糖凝胶板,建立电泳分离检测血清乳酸脱氢酶(LDH)同工酶的方法并建立成人血清的参考区间.方法用自制琼脂糖凝胶板分离检测LDH 同工酶,对方法学性能包括精密度、正确度、线性范围、参考区间进行确认和建立.结果 5种LDH同工酶图谱分离清晰,批内CV值均小于8.77％,批间CV值均小于13.12％,胶板间CV值均小于7.89％.IDH1在13.48～287.65U/L,IDH2在18.19～575.67U/L,LDH3在19.42～504.62U/L,LDH4在8.00～342.27U/L和LDH5在13.88～199.79U/L的范围内呈线性,斜率趋近于1.与Sebia配套电泳试剂盒的结果比较,5种同工酶在两方法间的差异无统计学意义(t=0.028 1～0.567 4,均P＞0.05),相关系数r=0.949 4～0.985 5.建立的成人参考区间为LDH1:15.7％～34.3％,LDH2:26.8％～38.9％,LDH3:18.8％～28.1％,LDH4:5.7％～13.7％和LDH5:2.7％～15.3％.结论自制超薄型琼脂糖凝胶板电泳分离检测血清LDH同工酶的方法性能良好,可用于临床检测.【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2019(034)004【总页数】4页(P83-86)【关键词】琼脂糖凝胶电泳;乳酸脱氢酶同工酶;分离检测【作者】申春艳;陆桂琴;于嘉屏【作者单位】上海迪安医学检验所中心实验室,上海 200433;上海迪安医学检验所中心实验室,上海 200433;上海迪安医学检验所中心实验室,上海 200433【正文语种】中文【中图分类】R446.112血清中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是以同工酶形式存在的，包括LDH1～5的5种同工酶[1]。
琼脂糖电泳法测定精浆乳酸脱氨酶同工酶
石玉玲;杨艺
【期刊名称】《华南国防医学杂志》
【年(卷),期】2000()1
【摘要】乳酸脱氢酶(LDH)由四个多肽单链亚单位构成，由于LDH分子中M、H、X亚基的一级结构氨基酸组成不同，其理化带外，还存在特异的LDH。
区带，LDHx区带主要存在于睾丸精母细胞及精子、精浆中。
LDH。
是精于糖代谢所必须的酶，由于LDHx对于睾丸组织和精子细胞具有组织特异性，因此测定lDHx对于探讨不育症的发病机制及临床诊断有一定意义。
本文测定31例20—22岁健康男性及2例结婚5年以上不育患者精浆中的LDH同工酶，方法与结果报告如下：【总页数】2页(P55-56)
【关键词】精浆;区带;LDH;同工酶
【作者】石玉玲;杨艺
【作者单位】驻香港部队医院检验科
【正文语种】中文
【中图分类】R
【相关文献】
1.琼脂糖电泳法测定精浆乳酸脱氢酶同工酶 [J], 石玉玲;杨艺
2.血清腺苷脱氨酶同工酶琼脂糖凝胶电泳测定法 [J], 周玉贵
3.乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳的改良 [J], 张军力;梦亚萍
4.分离乳酸脱氢酶同工酶的琼脂糖凝胶电泳法改进 [J], 杜希华;原永洁
5.琼脂糖凝胶电泳法测定王杂鸽血清乳酸脱氢酶同工酶的研究 [J], 沈秋姑;田向荣;王兴金;龙学燃
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
第1篇一、实验目的1. 理解同工酶的概念及其在生物体中的生物学意义；2. 掌握同工酶电泳技术的基本原理和方法；3. 通过同工酶电泳实验，观察和分析同工酶在样品中的分布情况。
二、实验原理同工酶是指具有相同催化功能，但氨基酸序列和分子结构不同的酶。
同工酶电泳技术是一种分离和鉴定同工酶的方法，其原理是利用同工酶在电场中的迁移速率差异，将其分离。
三、实验材料1. 实验样品：植物叶片、动物组织等；2. 电泳试剂：琼脂糖、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等；3. 电泳仪器：电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统等；4. 其他：移液器、吸管、剪刀、镊子等。
四、实验方法1. 样品制备：将实验样品研磨，加入适量提取液（如Tris-HCl缓冲液），在冰浴中匀浆，离心取上清液；2. 电泳凝胶制备：按照电泳试剂的配方，制备琼脂糖凝胶；3. 电泳样品制备：将提取液加入适量的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，混合均匀后，加入适量的样品，制成样品胶；4. 电泳：将制备好的样品胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，进行电泳；5. 成像与分析：电泳结束后，取出凝胶，用凝胶成像系统拍照，分析同工酶的分布情况。
五、实验结果1. 通过电泳实验，观察到样品中存在多种同工酶；2. 不同样品的同工酶分布情况存在差异，说明同工酶在生物体中具有特异性；3. 同工酶的迁移速率与酶的分子量有关，分子量较小的酶迁移速率较快。
六、实验结论1. 同工酶在生物体中具有重要作用，其生物学意义包括催化、调控、信号传递等；2. 同工酶电泳技术是一种有效的分离和鉴定同工酶的方法；3. 本实验成功分离和鉴定了样品中的同工酶，为后续研究提供了基础。
七、实验讨论1. 实验过程中，样品制备和电泳操作应注意无菌操作，以避免污染；2. 电泳条件的选择对同工酶的分离效果有较大影响，应根据实验目的和样品特点进行优化；3. 同工酶的研究有助于揭示生物体的遗传、变异和进化规律。
八、实验总结本实验通过同工酶电泳技术，成功分离和鉴定了样品中的同工酶，验证了同工酶在生物体中的生物学意义。
血清LDH及同工酶检测LDH作用乳酸脱氢酶lactate dehydrogenase LD或LDH在辅酶INAD为氢受体时催化L-乳酸为丙酮酸 L-乳酸丙酮酸NAD NADHH1 方法 1 分光光度法 1利用顺向反应pH 88-98340nm处连续观察NADH的产生速度 2利用逆向反应pH 74-78340nm处连续观察NADH的消失速度分光光度法能利用顺逆双相反应线性范围较广但要求保持测定体系于最适温度下否则会影响测定的准确性 2 比色法测定LD总活性1 原理乳酸脱氢酶LD 乳酸丙酮酸丙酮酸 24-二硝基苯肼丙酮酸-二硝基苯腙碱性溶液中呈棕红色颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比 2 试剂基质缓冲液pH 88 NAD溶液113mmolL 丙酮酸标准液05mmolL 24-二硝基苯肼溶液1mmolL 氢氧化钠溶液04mmolL 单位定义以100ml血清37℃与基质作用15min生成1umol丙酮酸为一个金氏单位参考值血清LD190-437金氏单位 3 操作步骤1 LD活性测定加入物对照管测定管血清- 005 基质缓冲液05 05 混匀放37°C水浴5min NAD溶液 - 01 混匀放37°C水浴15min 24-二硝基苯肼溶液 05 05NAD溶液 01 - 混匀放37°C水浴15min 04molLNaOH 50 50 ※室温放置5min进行比色波长440nm 2 LD校正曲线制作加入物ml B 1 2 34 丙酮酸标准液 0 005 01 015 020 基质缓冲液 05 045040 035 030 蒸馏水 015 015 015 015 015 24二硝基苯肼05 05 05 05 05 混匀放37°C水浴15min 04molLNaOH50 50 50 50 50 LD活性单位 0 250 500 750 1000临床意义①心肌损害心肌梗塞充血性心衰心肌炎②肝脏疾病病毒性肝炎肝硬化原发性肝癌③其它骨骼肌的损伤恶性肿瘤白血病淋巴瘤等肺梗塞等注意事项①标本不能溶血也不能用草酸盐抗凝血②由于LD4LD5对冷不稳定不宜冰箱存放血清标本在室温下可稳定2-3天 LD同工酶的测定人体某些组织中LDH同工酶电泳图谱二测定方法柱层析法免疫化学法热稳定性和抑制法电泳法原理根据LD同工酶一级结构和等电点的差异在一定电泳条件下使LD在支持物上被分离乳酸脱氢酶LD 乳酸丙酮酸 NADH 氧化型PMS 还原型PMS NAD 还原型PMS 四氮唑盐类氧化型PMS 甲臢当有LD活性的区带存在即显紫红色颜色深浅与酶活性成正比借助于扫描仪或光密度仪可进一步求出相对含量试剂巴比妥缓冲液pH 86 巴比妥盐酸缓冲液0082molL pH 82 EDTA-Na2溶液10mmolL 缓冲琼脂糖凝胶8gL和 5gL 底物显色液和固定漂洗液 3操作①凝胶板制备②加样③电泳④显色⑤固定和漂洗 4计算A总吸光度总和 A1 A2 A3 A4 A5 A1A5 相应为LD同工酶LD1LD5的吸光度 LD同工酶的百分比为 LD1 A 1 A总× 100 LD2 A 2 A总× 100 LD3A 3 A总× 100 LD4 A 4 A总× 100 LD5 A5 A总× 100 临床意义①心脏疾病心肌梗塞 LD1 ＞ LD2 充血性心衰心肌炎 LD1 ＞ LD2 ②肝脏疾病病毒性肝炎 LD5 ＞LD4 肝硬化原发性肝癌 LD5↑↑LD5＞LD4 ③恶性肿瘤白血病结肠癌等 LD3↑LD3＞LD1 ④肌肉疾病肌肉损伤肌萎缩 LD5↑注意事项①不宜用溶血标本②严格控制温度LD4和LD5特别是LD5对热敏感如底物显色液温度超过50℃LD5易失活③底物显色液需避光保存因PMS对光敏感否则显色后的凝胶板背景颜色深而影响结果④LD同工酶对冷的敏感性不同尤其是LD5对冷不稳定因此血清标本应该放室温保存分布骨骼肌心肌脑组织平滑肌胃肠道子宫在肝及红细胞中测不到CK的活性ADP 磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶丙酮酸 ATP 丙酮酸-24-二硝基苯腙实验操作加入物B S U 血清- - 01 标准- 01 - 1mmolL200UL H2O 01 - - 酶试剂 05 05 05 37℃ 15min DNP O5 05 05 37℃ 15min NaOH 4 4 4 室温 5min 440nm比色临床意义 1引起血清CK活性升高的疾病 1心脏疾病急性心肌梗塞病毒性心肌炎心外膜炎 2肌性疾病进行性肌营养不良多发性肌炎皮肌炎肌萎缩 3中枢神经系统疾病脑血管意外脑膜炎颅脑外伤 4肺疾病肺栓塞等 2引起血清CK活性降低的疾病较少甲状腺功能亢进全身性红斑狼疮严重感染败血症等 7注意事项1本实验的许多试剂都易失效故最好在每次实验前临时配制 2肌酸呈色不稳定振荡充分与否直接影响呈色的深浅及过程用旋涡混合器充分振荡15s37℃水浴5min后颜色可达最高点并持续30min以上 1 电泳法测定CK-MB• 琼脂糖介质醋酸纤维素薄膜酶定位 CK-BB —白蛋白区 CK-MB —α2 ～β区CK-MM —γ区 CK-Mt —γ后参考值 CK-BB 0CK-MB 0 ～ 3CK-MM 97 ～ 100CK-Mt 0CK-MB 阳性决定水平为5试剂 150mmolL Tis-巴比妥缓冲液pH 80 230mmolL Tis-巴比妥缓冲液pH 8635gL 琼脂糖 4400mmolL Bis-Tis缓冲液pH 70 5辅酶溶液 6底物显色液 7混合底物显色液操作 1制备凝胶玻片 2加样 3电泳 4显色 5固定和漂洗 6观察结果参考值 1CK-BB 0 2CK-MB 0 3 3CK-MM 97 100 4CK-Mt 0 引起CK-BB升高的疾病急性颅脑外伤脑血管疾病急性细菌性脑膜炎引起CK-BM升高的疾病急性心肌梗塞心肌炎进行性肌营养不良注意事项1电泳需较高的pH值酶反应需较低pH 2CK不稳定对光热及高pH敏感最好将及时分出的血清充CO2后塞紧管口置冰室或-30℃保存至少可稳定半个月及时测定效果更好 3血清CK活性随温度升高而升高直至45℃更高温度时CK活性迅速下降56℃很快失活琼脂糖电泳法测CK同工酶时决不能像作LD同工酶用温度较高的琼脂糖底物显色液否则CK活性丧失而非脱氢酶NDH反应显著心肌梗死诊断的实验室指标的特性－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－实验室分子量生理半衰期升高时间峰值时间恢复正常时间指标 KD h h h d －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－CK 86 17 312 1224 34 CK-MB活性86 13 312 122423 CK-MB质量 86 13 26 12243 早期急性心肌梗死的诊断灵敏度－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－胸痛后时间 h 指标原理CK分子是由M和B两种亚单位组成的二聚体在细胞质内存在三种CK同工酶CK-BB 脑型CK-MM 肌型CK-BM 混合型CK-Mt线粒体内。
