基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化

课程设计设计题目：年产5000吨L-苯丙氨酸发酵工厂设计摘要本设计主要是进行年产5000吨苯丙氨酸工厂的初步设计。

在对苯丙氨酸的结构及其在工业中重要应用作了分析后，拟在湘潭九华经济区投资L-苯丙氨酸生产工厂。

首先，对投资项目进行了认真的地分析及对厂址进行认真地选择。

同时，对L-苯丙氨酸的生产工艺作了优化，然后依据拟定的产量与工艺流程对生产车间进行了物料衡算、热量衡算、与主要生产设备的选型，其次，对三废处理等方面也作了一个初步的设计方案。

整个设计充分考虑了目前的经济状况和今后发展的需要，从节能的角度出发选择设备。

生产流程尽量提高机械化、自动化水平，同时力求技术上先进，质量上可靠，布局上合理、规范。

关键字：L-苯丙氨酸；发酵；工厂设计目录1. 引言 (3)2. 概述...................................................... 错误!未定义书签。

2.1产品需求初步预测............................. 错误!未定义书签。

2.2投资的必要性和经济意义 ............... 错误!未定义书签。

2.3地理环境............................................ 错误!未定义书签。

2.4生产工艺选择 ................................... 错误!未定义书签。

2.5产品方案............................................. 错误!未定义书签。

2.6工艺流程图 ....................................... 错误!未定义书签。

2.7工艺要点............................................ 错误!未定义书签。

3. 物料恒算.............................................. 错误!未定义书签。

L-苯丙氨酸工业生产中采用连续发酵。

因而发酵培养基中各物质的含量对提取过程非常有利。

在对发酵液进行处理后，苯丙氨酸的提取率上升12％。

由苯丙酮酸生产L-苯丙氨酸的生产工艺，生产成本为13万元／t左右。

用此法建设500t／a的L-苯丙氨酸装置，需投资3，500万元，主产品L-苯丙氨酸并副产丙酮酸，年销售总收入可达1．3亿元，适用于中、小化肥厂利用合成氨再生气开发生产，在原料、技术和经济上占有较大的优势。

1理化性质L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，简称L-Phe)又名L-苯基-α-氨基丙酸，为白色斜方晶系结晶粉末。

具有苦杏仁味，熔点：283℃(分解)。

自然界广泛存在于卵、乳和动物蛋白中，含量5％～6％，植物性蛋白质中约含1％。

L-苯丙氨酸可溶于水，在水中的溶解度为3％，难溶于乙醇、乙醚，在100ml水中的溶解度为51℃：4．4g。

100℃：10g。

旋光度一34．5(25℃)。

苯丙氨酸有外消旋DL-型，L型和D型。

其中最重要的是L-苯丙氨酸。

2工艺开发L-苯丙氨酸是人体的必需氨基酸，人体本身无法合成，只能由植物和微生物合成。

L-苯丙氨酸合成的起始物为五碳糖磷酸途径的中间产物赤藓糖-4-磷酸(erythrose-4-phosphate，FAP)和糖酵解过程的中间产物磷酸烯醇式丙酮酸（phophoenolpyruvate，PEP)二者缩合形成一个七碳酮糖开链磷酸化合物称为3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-Deoxy-O-arobinoheptu-losonate-7-phosphate，DAHP)，然后DAHP转化为莽草酸(SHIK)，然后再转化为分支酸(CHA)，由分支酸合成苯丙酮酸(PPY)，最后苯丙酮酸经转氨作用生成L-苯丙氨酸。

L-苯丙氨酸的制备方法有发酵法、酶法与化学合成法。

用化学合成法经拆分可制得L-苯丙氨酸。

国内生产厂家主要采用发酵法。

2．1一步法化学合成法路线长，副产物多，且产物为光学消旋体，需进行光学拆分，成本高。

L-苯丙氨酸的发酵生产线建设的工艺初步设计作者：黄启鹏菌种描述：L-苯丙氨酸产生菌为为大肠杆菌的基因工程菌，为酪氨酸缺陷型和维生素B部分缺陷型菌株，所带质粒为经改良得重组质粒，该质粒上含有L-苯丙氨酸合成过程中的关键酶结构基因，以及卡那霉素抗性基因。

由于本菌株是酪氨酸缺陷性，在培养基中必须添加酪氨酸才能保证菌体生长，因此酪氨酸是菌体生长得限制因素之一，可以通过限制酪氨酸的量来控制菌体的生长量。

同时由于菌株含有卡那霉素抗性基因的重组质粒，因而培养基中必须加有卡那霉素，以保证菌体细胞内的重组质粒不会丢失，否则菌体性能将会发生退化，及不含重组质粒的菌体不能生长，只含有该重组质粒的菌体才能生长。

生产菌种培养工程：采用5000ml三角瓶进行摇瓶种子培养，摇瓶机型号ZHWY-3222（供参考，需调研），摇瓶装量1000ml/三角瓶，共计40瓶，其中5瓶用于检验用途，培养温度37°C，摇瓶转速240rpm，培养周期10~12hr。

菌种放瓶标准：镜检菌体呈短杆状，610nm处测定OD＞1.0，pH7.5以上。

将生长良好的摇瓶种子液无菌并瓶（标准型超净工作台型号：SW-CJ-1CU），并瓶体积2×3500ml（不锈钢锥瓶Φ200×250，上口根据1000ml三角瓶的瓶口并应有相应胶塞适配，竹节与胶管配置按图）。

采用具有洁净措施的送种框送至发酵车间。

种子送抵车间种子暂存间的冰箱，不得超过20min。

种子培养工程：确认配料罐（15m3 SUS304罐，适配电机30Kw、搅拌转速150rpm、搅拌型式四斜叶开放涡轮搅拌器一层）、输料管道（DN50 SUS304）清洗干净，并确认相应种子罐设备处于清洁待接料状态。

检查物料品名、规格、数量，在清洁的配料罐内加水至搅拌叶处，开启搅拌，将培养基（一）、培养基（二）分别投入到不同的配料槽中溶解。

搅拌均匀后，核对种子罐（30m3 SUS304罐、适配电机45Kw、搅拌转速140rpm、搅拌型式新型发酵搅拌器三层）罐号，将输料软管插入待进罐人孔，开启进料端阀门。

基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化时间：2005-5-17 10:56:24 作者：不详来源：中国发酵工业网点击数：本站另注：L-苯丙氨酸已在国内江苏部分厂家有发酵工业规模化生产，但仍然推荐此文供大家研究参考，了解工艺配方和分析方法。

L-苯丙氨酸(L-phe)是人和动物体内不能合成的8种氨基酸之一,人们称其为必须氨基酸。

L-phe在生物体内是转化成L-酪氨酸的原料,因而L-phe成为一些氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分。

而且,L-phe是合成药物麦角胺、抗生物质和维生素B6的重要原料。

同时,L-phe也是合成一些抗癌药物的中间体[1]。

在食品工业中,L-phe最主要的用途是合成二肽甜味剂,俗称蛋白糖。

基于L-phe广泛的应用前景,近年来L-phe成为氨基酸行业单品中产量增长最快的一种。

目前,L-phe的生产方法有酶法、发酵法等,直接发酵法具有可利用廉价原料直接生产L-phe的优点,发酵法生产L-phe,国外报道产酸率为2.8%,L-phe在我国还未实现规模生产[2]。

本实验对构建的重组L-phe基因工程菌E.coLiHB101. 进行发酵实验,研究了其发酵工艺条件及营养物质的流加对产物L-phe积累的影响。

1实验材料与方法1.1发酵用菌株基因重组工程菌E.coLiHB101. 。

1.2培养基1.2.1种子培养基蛋白胨1%;氯化钠1%;酵母粉0.5%;葡萄糖2%;调pH=7.5;抗菌素Km(硫酸卡那霉素)。

1.2.2发酵培养基Na2HPO4·12H2O20g/L;Na-citrate6g/L;Na-gLutamat e0.4g/L;酪氨酸0.6g/L;葡萄糖20g/L;Km40mg/L。

1.2.3补料培养基CaCL2·2H2O0.6g/L;酪氨酸500mg/L;葡萄糖500g/L;MgSO4·7H2O1g/L;VB1500mg/L;氨水28%。

1.3培养方法1.3.1摇瓶培养250mL锥形瓶内装LB培养基25mL,接种菌种斜面后,于旋转摇床上,在37℃培养12h。

L-苯丙氨酸的提炼生产线建设的工艺初步设计作者：黄启鹏发酵液的预处理：接罐前准备：确认接收罐[兼酸化罐，200m3 SUS不锈钢罐，带加热盘管（保温65±5℃），搅拌系统（转速70±1rpm），在线pH计（465-50-SC-P-S7/150/9848）]已经清洗干净，关闭接收罐罐底阀门和液位计连通阀。

确定排污阀处于关闭状态，往液位计中加满水。

接收料液：打开进料阀，通知发酵车间放罐，开始接收料液。

接料到搅拌叶上端0.5m处即开启搅拌。

料液接收结束后关闭搅拌，打开液位计连通阀门，通知发酵人员前来确定体积，体积确定后在放罐交接单上签字。

放罐体积应在175±2m3。

取样：体积确定后再开启搅拌。

搅拌10分钟后打开罐顶盖，用取样勺在液面10cm 以下取出400ml料液均分于2个干净碘量瓶中，封口，通知QC人员取样检测。

放罐单位应≥40g/L。

接收洗罐水：发酵车间洗罐后，将2.0/0.5m3洗罐水也输送至酸化罐。

均匀酸化：检查浓硫酸罐（2.5m3碳钢罐浓硫酸来至酸碱库的25m3浓硫酸罐硫酸泵型号65FIU30-32）的酸量应在1m3以上。

缓慢打开浓硫酸阀门，观察在线pH计。

当料液pH调整至4.5±0.1时继续搅拌10min。

用取样勺取出200ml酸化液于碘量瓶中，封口并通知QC人员取样检测。

关闭机械搅拌，记录加入浓硫酸的体积。

加酸体积235±65L。

通过酸化罐列管加热（or：直接通蒸汽），保持酸化液温度65±5℃。

陶瓷膜（南京九思高科 200m2/台）过滤开机前准备：开启空气压缩机（ZW155A 复盛牌），空气干燥机，合上控制柜电源总闸。

打开生产罐（透析滤液罐 200m3 SUS304）罐底阀门。

打开预过滤器（根据膜厂家要求匹配）上排空阀门，排尽管道内空气。

确认手动阀HCV02A、HCV02B关闭，HCV01A、HCV01B开启2/3，HCV03A、HCV03B开启一半。

β-苯丙氨酸变位酶基因工程菌的构建及其产酶条件优化β-苯丙氨酸变位酶属于MIO-依赖氨基变位酶(MIO-dependent aminomutase),可催化α-苯丙氨酸转化为β-苯丙氨酸,是目前最有效的抗癌药物—紫杉醇的重要前体物质。

随着癌症在全球范围内发病率的逐年提升,β-苯丙氨酸需求量也日益增加。

目前,在生产中大量获取β-苯丙氨酸的方法主要是化学拆分法和Mannich反应法等,这些方法步骤复杂,产物难以纯化,生产成本昂贵还会产生有毒有害的副产物。

与这些方法相比,酶催化法有着高效、快捷、安全的巨大优势。

β-苯丙氨酸变位酶作为可以高效催化生成β-苯丙氨酸的生物催化剂受到了越来越多的关注。

本研究根据β-苯丙氨酸变位酶PAM基因序列设计合成上下游引物,利用PCR技术扩增了目的基因,并将其和表达载体pET-28a连接,构成了表达质粒pET-28a-pam。

将表达质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21中,筛选阳性菌株,并通过酶切检测在菌株内是否成功转入目的基因条带,得到一株基因重组菌。

通过对IPTG诱导剂的单因素试验确定了最佳诱导剂含量以及最佳诱导时间,并对重组菌进行诱导表达。

以SDS-PAGE手段检测了重组菌的诱导表达并对重组酶进行了纯化。

对重组酶的基本酶学性质pH、温度以及热稳定性进行了研究,确定了重组酶的最佳催化pH为9.0,最佳催化温度为50℃,并对重组酶的热稳定性进行了验证,发现其热稳定性较好。

利用单因素试验和响应面法对重组菌的产酶条件进行了优化,确定了最优发酵条件为种龄:12.8 h,初始pH:6.7,发酵时间:25.2 h。

在最优发酵条件下,重组菌产PAM最大酶活可达11.15 U/mL,较优化前提高了 128.9%。

在3 L发酵罐中对重组菌进行扩大培养。

利用单因素试验确定了最佳溶氧为30%。

分别比较了未添加任何补料的发酵方式,培养20 h时流加30 mL补料培养基的发酵方式以及培养30 h时流加40 mL补料培养基的发酵方式。

发酵法生产L-苯丙氨酸的研究进展摘要：L-苯丙氨酸(L-phenylalanine, L-Phe) 是一种广泛应用于食品、饲料添加剂以及医药等领域中的必需氨基酸，主要的工业生产方法为原料廉价易得，环境污染小的微生物发酵法。

综述了国内外发酵法生产L-苯丙氨酸的关键技术和策略以及最新研究进展情况。

关键词：L-苯丙氨酸；发酵法；基因工程技术；工艺优化1. L-苯丙氨酸的性质和用途苯丙氨酸(Phenylalanine)又称α-氨基化肉桂酸，分子式C9H11O2N，分子量165.19，属于带苯环的芳香族氨基酸。

最早由Schulze在1897年从羽扇豆幼苗中发现和分离，接着Fischer 于20世纪初由动物性蛋白质中成功分离得到[1]。

其光学异构体一共有三种，分别为L-型，D-型及外消旋D,L-型，其中的L-型具有生物活性，呈白色或无色的结晶粉末状，有苦味，常温下溶解度较低，为29.6g/L，并难溶于甲醇和乙醇等有机溶剂[2]。

L-苯丙氨酸在自然界广泛存在，但其含量都不高，在卵、乳和动物蛋白中，含量5~6%，在植物性蛋白质中含量占1%，石油蛋白中占到8%，单细胞蛋白中占3~5%[3]。

L-Phe还主要存在于纤维蛋白、蛋白及血红蛋白中，影响甲状腺激素和毛发、皮肤的黑色素，还参与消除一些内脏的功能的损耗。

它是人体必需但自身无法合成的八种必需氨基酸之一，L-Phe的人体代谢障碍是一些先天性代谢疾病的病因，因此在医药行业中，L-Phe是一些氨基酸输液和营养剂中的必需成分。

除了直接用于合成医药外，还是医药类培养介质的配制中间体及载体，如抗肿瘤药物的药物载体。

在食品行业中，L-Phe可用于配制调味剂，强化营养作用。

自从20世纪80年代以来，由于食品双肽甜味剂阿斯巴甜（Aspartame，简称APM）的开发应用，L-Phe作为其合成原料之一，经济价值有了进一步的提高[4]。

2．L-Phe的生产方法随着市场需求的不断增长，L-Phe的生产受到越来越多的关注。