研究生分子生物学工作基础新基因研究路线PPT课件

质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建

第二节 启动子与转录的起始
3．真核生物启动子对转录的影响 TATA区和其他两个UPE区的作用有所不同（图4-5）。 前者的主要作用是使转录精确地起始，如果除去TATA区或 进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区 突变后明显，但发现所获得的RNA产物起始点不固定。研 究SV40晚期基因启动子发现上游激活区的存在与否，对该 启动子的生物活性有着根本性的影响。若将该基因5′上 游–21－–47核苷酸序列切除，基因完全不表达（图4-6）。
分子生物学基础
遗传信息的转录—从 第四章 遗传信息的转录 从DNA到RNA 到
第一节 RNA转录的概述
一、RNA转录的特点 RNA转录的特点 在DNA指导下RNA的合成称为转录。RNA链的转 录起始于DNA模板的一个特定起点，并在特定的终 点终止，此转录区域称为转录单位。一个转录单 位可以是一个基因或多个基因。基因的转录是一 种有选择性的过程，随着细胞的不同生长发育阶 段和细胞内外条件的改变将转录不同的基因。转 录起始主要由DNA分子上的启动子（promoter）控 制，而控制终止的部位称为终止子（teminator）。 典型的转录单位结构如图4-1。
第四节
转录后加工
图4-12 真核生物mRNA5′–端帽结构
第四节
2．3′–端加尾
转录后加工
真核生物成熟的mRNA 3′–端通常都有100~200个腺苷 酸残基，构成多聚腺苷酸（polyA）的尾巴。通过研究发 现，DNA序列中没有多聚T的序列，由此说明了3′尾巴 polyA是在转录后加上的。研究发现，它还是多聚腺苷酸 化的信号，该序列AAUAAA，因为切除该保守序列，3′–端 则不能进行切除，也不能形成polyA尾巴。3′–端polyA尾 的形成见图4-13。

顺式作用元件〔cis-acting element〕 反式作用因子〔trans-acting
element〕 真核生物启动子 增强子 转录因子〔trans-criptional factor,
TF) 转录过程
近启动子：〔核心启动子〕，－40～ ＋5，决定转录起始的准确位置。远启
动子：〔上游控制元件〕，－165～ －40，影响转录的频率。
膜受体介导的信息传递
cAMP -Ａ激酶 途径
磷脂酰肌醇途径
酪氨酸蛋白激酶 途径
胞内受体介导的信息传递
rRNA
RNA的加工成熟
tRNA mRNA
转录起始的选择 选择性加工 mRNA的稳定性
mRNA的构造 翻译的起始调节 可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始
调控 选择性翻译 小分子RNA的调控〔反义RNA、干
制 复制的过程
复制的保真性
复制的调控
定义
半保存复制 特点
类型〔线型、环状〕
参与DNA复制的物质
底物 模板 引物 DNA聚合酶 解链酶 引物酶 单链结合蛋白 拓扑异构酶 连接酶
复制起始 复制的过程 延伸
终止
复制起始点 复制方向 引发体的形成
DNApolⅠ和 Ⅲ的3′－5′活性 RNA引物起始复制，引物最终除去，
扰RNA、微小RNA、时序RNA〕 翻译的自我调节 翻译后程度的调控
谢谢
染色质构造对基因表达的影响 DNA的甲基化与去甲基化 染色体(质)丧失 基因扩增 基因重排
顺式作用元件 反式作用因子〔类型、构造〕 转录起始的调节〔转录起始复合物、
反式作用因子的活性、作用方式〕 RNA聚合酶 真核基因转录调控的主要形式 应答元件的作用机制 真核基因转录后程度上的调控

2024/1/30
切除修复
对于较复杂的DNA损伤 ，如嘧啶二聚体或DNA 链断裂，通过切除损伤 部位并合成新的DNA片 段进行修复。
重组修复
在DNA双链断裂等严重 损伤情况下，通过DNA 重组机制进行修复，涉 及同源序列的搜索和交 换。
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DNA重组的方式与意义
同源重组
发生在同源序列之间的重组，通过交 换DNA片段实现遗传信息的重新组合
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02
基因与基因组
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基因的概念与结构
01 基因的定义
基因是遗传信息的基本单位，控制生物性状的遗 传。
02 基因的结构
基因由编码区和非编码区组成，编码区包括外显 子和内含子。
03 基因的遗传效应
基因通过控制蛋白质的合成来控制生物的性状。
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基因组的组成与特点
01 基因组的定义
基因表达的调控方式
基因表达受到多种因素的调控，包括 转录因子、表观遗传学修饰、 microRNA等。
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03
DNA复制、修复与重组
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DNA复制的过程与特点
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DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶段，涉及多种酶和蛋白 质的参与，确保DNA的准确复制。
2 3
DNA复制的特点
结合分子生物学指标，对 药物疗效进行评估，为新 药研发和临床应用提供依 据。
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分子生物学技术在个体化医疗中的应用
基因检测
通过基因检测分析个体基 因组信息，为个体化医疗 提供基础数据。
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个体化用药指导
根据基因检测结果和药物 代谢特点，为患者提供个 体化用药建议，提高药物 治疗效果。