愈伤组织的诱导形成及分化

第五章 愈伤组织的诱导、形成及分化

第一节 愈伤组织的诱导、形成及特点

一、愈伤组织的诱导和形成

愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组织。经一段时间的生长和增殖以后，在其内部出现一定程度的分化，产生出一些具有分生组织结构的细胞团、色素细胞或管状分子。

植物外植体在培养基和外界环境的作用下，经过一个复杂的过程形成愈伤组织，即：

外植体＋培养基＋环境 愈伤组织

愈伤组织的形成一般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图4.1）。

愈伤组织形成诱导期分裂期分化期改变原来的分化方向和代谢方式，合成代谢加强，合成大量蛋白质和核酸物质，为细胞的分裂和增殖奠定基础外植体外层细胞开始分裂，细胞脱分化，愈伤组织结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明愈伤组织表层细胞分裂逐渐停止，转向内部的局部地区，并改变分裂面的方向，出现瘤状结构外表，愈伤组织中可以发现维管组织，但不形成维管系统

图4.1 愈伤组织的形成特点

1. 诱导期

愈伤组织诱导期又称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。

诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异，即使是同一种物种不同基因型同一外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的植物诱导期需要数天（胡萝卜）。刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h，但经贮藏5个月后，诱导期延长为2天。

2. 分裂期

外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发生分裂，细胞脱分化。愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明（见图4.2）。分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。

小麦幼胚 分裂期 分裂期

分化期 分化期 图4.2 小麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期

（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）

愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和生理状况而有很大差异。烟草、胡萝卜等的脱分化很容易，而禾谷类则较难；花器官脱分化较易，茎叶较难；幼茎组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。

进入分裂期的愈伤组织，如仍在原来的培养基上继续培养，某些愈伤组织将不可避免地发生分化，产生新的结构，但将其及时转移到新鲜的培养基上（继代培养），则愈伤组织可无限制地进行细胞分裂增殖，维持不分化的状态。

3. 分化期

愈伤组织分化期，是指停止分裂的细胞发生生理生化代谢变化，形成由不同形态和功能细胞组成的愈伤组织。分化期细胞体积不再减少，最明显的特征是生长着的愈伤组织细胞的平均大小突然不再减少，而保持相对稳定。

愈伤组织分化期开始后，愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢直至停止，细胞分裂活动突然转向愈伤组织内部深处的局部地区，并改变分裂面方向，出现瘤状结构外表和内部分化（见图4.2）。此时，愈伤组织中出现瘤状结构的拟分生组织成为暂不再进一步分化的生长中心。分化的愈伤组织中有维管组织出现，但不形成维管系统，呈分散的节状和短束状结构。

二、愈伤组织的保持

1. 愈伤组织的颜色

外植体细胞经过诱导启动、分裂和分化等一系列变化后，形成无任何结构的愈伤组织。新鲜的愈伤组织颜色为奶黄色，也有白色且有光泽者，少数呈淡绿色。老化的愈伤组织则转变为黄色乃至褐色。

2. 愈伤组织的保持时间

愈伤组织在原来的培养基上保持一段时间后，由于培养基水分或营养物质的减少，以及愈伤组织本身分泌的代谢产物的不断积累，达到产生毒害的水平后，愈伤组织不再生长，如继续培养，愈伤组织开始老化，直至死亡。一般情况下，愈伤组织在原来的培养基上保持2～3周后，必须转移到新鲜的培养基上进行继代培养（Subculture）。继代培养的方法是将原来的愈伤组织分割成小块转移到新鲜的培养基上，用于继代培养的愈伤组织块必须达到一定的大小，一般直径为5 mm，重量约为100 mg，否则在新鲜的培养基上难以迅速恢复分裂和生长，或者生长十分缓慢。

应当注意的是，继代培养时愈伤组织不能硬性分割，因愈伤组织生长时有一个生长核心，一旦破坏，愈伤组织就难以恢复分裂和生长。因此，在分割愈伤组织时要根据具体情况，顺其自然进行分割，同时，还要选择新鲜健康的愈伤组织进行继代培养。

3. 愈伤组织的生长周期

愈伤组织自原来的培养基上转移到新鲜的培养基上3～7天即可恢复生长，随后2～3周内生长达到高峰，愈伤组织细胞分裂处于最活跃时期。到这一时期结束时，愈伤组织生长开始缓慢下来，此时愈伤组织体积达到最大。因此，通常在愈伤组织生长达到高峰前进行继代培养，这时愈伤组织中的细胞处于旺盛分裂状态，继代后有利于愈伤组织的恢复生长。否则，愈伤组织在停止生长较长一段时间后再转移到新鲜的培养基上，较难恢复细胞分裂。研究表明，24C和弱光有利于愈伤组织的保存。据报道，大豆细胞系的愈伤组织在这种条件下可以保存15年。

4. 拟分生组织

一般认为愈伤组织是无任何组织结构的细胞团，但组织解剖学的研究表明，完全由均一薄壁细胞构成的愈伤组织极少存在。愈伤组织在分裂期会出现导管细胞、筛管细胞、分泌细胞、毛状体细胞及木栓细胞等，同时还会出现由小而密集分裂细胞构成的细胞团，这些细胞团称为拟分生组织，并在以后的分化中成为形成芽原基及根原基的中心，此时的愈伤组织常呈颗粒状。

三、愈伤组织的继代时间与遗传稳定性和植株再生

愈伤组织经长期继代培养会出现遗传上的不稳定性和变异性，使染色体发生倍性和结构上的改变及分子水平上的变化。由其诱导产生的再生植株，也会相应产生遗传上与用于培养的原始亲本不同的遗传变异和遗传组成的不一致性。利用这种特性可进行作物品质改良及次生代谢产物的生产。

有些研究认为，愈伤组织经长期继代培养后会失去再生能力。到目前为止，多数研究表明，经长期继代培养的愈伤组织仍有再生能力。

愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成分和培养时间的不同而异。同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变异。组织培养中涉及到的遗传变异，主要是细胞核组成的改变，且变异不可逆。这种遗传上的改变包括染色体畸变、细胞核破碎以及由于细胞内复制引起的多倍性和分子水平上的改变等。培养基成分中外源激素的成分与变异的产生密切相关。此外，培养时间对变异的产生影响也很大，如烟草和胡萝卜的愈伤组织经几个月继代培养，细胞多倍性水平提高。但也有例外，经长期继代培养后，愈伤组织细胞的倍性仍保持不变，处于稳定状态，如桉属愈伤组织经3年和10年的继代培养未发现多倍体和非整倍体细胞。

四、胚性与非胚性愈伤组织的特点

不同物种、基因型或外植体在不同培养条件下可以形成不同类型的愈伤组织，有的仅能诱导形成非胚性愈伤组织，而有的在适宜条件下则被诱导形成胚性愈伤组织，二者具有明显的不同特点。例如，春小麦胚性和非胚性愈伤组织在颜色、表面光滑度、质地、胚性细胞的多少、细胞形态、细胞质和细胞核及核仁上，都表现出很大的差异（见表4.1）。胚性愈伤组织是体细胞胚胎发生的前提和基础。

表4.1 春小麦胚性与非胚性愈伤组织的特点

项 目 胚性愈伤组织 非胚性愈伤组织

颜 色 淡 黄 白 色

表 面 光 滑 粗 糙

质 地 坚硬但易碎 松散，水渍状

胚性细胞的多少 大 量 极少或无

细胞形态 小，圆球形 管状或不规则形状

细胞质 浓厚，染色深 稀薄，染色浅

细胞核及核仁 核明显、大，核仁大 核小，核仁小，或无核

（东北农业大学小麦研究室，明凤，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）

第二节 愈伤组织的形态建成

一、愈伤组织形态建成的方式

愈伤组织细胞分裂常以无规则方式发生，尽管此时发生细胞分化，但并无器官发生。只有在适宜的培养条件下，愈伤组织才能进一步分化，进行器官发生，产生苗或芽的分生组织，进而再生植株。

愈伤组织的形态建成主要有以下几种方式（见图4.3）： 愈伤组织形态建成方式体细胞胚胎途径再生植株通过产生单极性不定芽或不定根，在不定芽下方长出不定根或在不定根上产生不定芽，并在二者之间分化出维管束组织而形成完整植株愈伤组织仅分化出不定根或不定芽，形成无根苗或无苗根在愈伤组织的邻近部位分化出不定根和不定芽，二者通过维管束组织结合形成完整植株非体细胞胚胎途径再生植株

图4.3 愈伤组织形态建成的主要方式

① 通过产生单极性的不定芽，在不定芽的下方长出不定根，同时在二者之间形成维管束组织，进而形成完整植株。多数植物属这种类型。

② 通过产生单极性的不定根，在不定根的上方产生不定芽，并在二者之间分化出维管束组织，形成完整植株。这种类型在双子叶植物中较常见，而单子叶植物中则少有。

③ 愈伤组织仅分化出不定根或不定芽，形成无根苗或无

苗根。

④ 在愈伤组织邻近部位分化出不定根和不定芽，然后两者再结合起来，形成完整植株，根和芽的维管束必须相连，否则植株不能成活（见图4.4）。丛生苗属此种形成方式，根和芽的连接方式同正常胚胎形成。

⑤ 通过体细胞胚胎途径再生植株，这也是一种较为常见的

类型。

1—芽开始分化；2，4—分化出不定芽；3，7，8—丛生苗； 5—再生小植株；6，9—再生植株

图4.4 小麦愈伤组织形态建成与植株再生

（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）

二、具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织

外植体细胞经离体诱导所形成的愈伤组织并不全都具有形态建成的能力。具有形态建成能力的愈伤组织有一定的形态结构特点。但具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织之间的差异是相对的，有时通过调控培养条件，尤其是生长调节物质和继代方式，可以调控形态建成，将无形态建成能力的愈伤组织调控成具有形态建成能力的愈伤组织。如调控不当，也可以使具有较强形态建成能力的愈伤组织变为具形态建成能力较弱的愈伤

组织。 三、愈伤组织诱导、增殖及其形态建成的调控

愈伤组织诱导、增殖及形态建成是一个连续的过程（见图4.5），主要受植物种类、基因型、外植体、培养基和培养环境等因素的调控（见图4.6）。

图4.5 小麦幼胚愈伤组织诱导与植株再生示意图

（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，1990）

起始材料培养基培养环境Callus诱导、增殖和形态建成物种基因型外植体种类、生理年龄培养基类型硝酸钾含量较高的培养基，如B5、N6含盐量中等培养基，如H和Nitsch，大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但维生素种类比MS多低盐浓度培养基，如WS和HE有利利于根的离体诱导植物生长激素含盐量较大的培养基，如MS及其改良培养基（较高浓度硝酸盐、铵盐、钾盐，较全的微量元素），以及LS和BL培养基

图4.6 影响愈伤组织诱导、增殖和形态建成的因素 不定芽

不定根