重组蛋白分离纯化的方法策略及案例介绍

重组蛋白质的分离纯化研究10生物技术世界 BIOTECHWORLD自20世纪70年代分子生物技术诞生以来,重组蛋白分离纯化技术得到了一定发展,发展重心在优化蛋白质纯化步骤、纯度、节省成本等方面。

研究重组蛋白质分离纯化技术能在一定程度上促进重组蛋白分离纯化技术的发展,极具现实意义。

1 准备和预处理样品样品准备受重组蛋白可溶性的影响。

从包涵体力回收蛋白质首先要做的就是细胞裂解,一般使用超声/高压匀浆或是研磨,通过增加能量、流量以及时间来减少细胞碎片。

另外,预处理也是减少细胞碎片必不可少的环节,如在高压匀浆前要做好加热和酶预处理工作,促使杆菌释放热稳定酶;通过预处理酵母和假丝酵母酶提升细胞破碎效果;低压均将缩短时间、降低能耗以及减少细胞碎片;通过洗涤包涵体和整合细胞破碎达到优化下游程序目的。

2 层析技术2.1 层析方法很多蛋白质纯化方案都是基于多步骤层析方式次序排列之上的,但有些时候一些步骤是可以省略的。

蛋白质与多肽作为结构可变及功能繁多的分子,层析行为也具有复杂性,所以要慎重选择基质。

复杂蛋白质的纯化仅使用单一层析方法不能满足需求,在不具备标准条件的情况下,只有多选择多试用。

Wu等借助SP琼脂糖FF 对分泌重组内源血管产生的抑制因子实施了离子交换层析,借助琼脂糖-肝素Hi-Trap对其实施了亲和层析纯化,分离出纯度为98%的蛋白质。

Wang等借助CHO-GS 系统实现嵌合抗体的表达,再用亲和层析方式得到纯度为91%的蛋白质,然后再用反相高性能液体色谱法实施进一步纯化,得到纯度在99%以上的蛋白质。

在液相层析技术里,当前研究重点是如何改进纯化操作系统性能以强化载体介质性能。

此外,灌注层析、置换层析、扩张柱床吸附等技术都在不断发展。

就下游纯化过程而言,可以使用陶瓷羟磷灰石代替离子交换与疏水相互作用。

Stok等在芽孢杆菌里表达BI,具体纯化步骤为先进行离子交换,然后进行凝胶过滤,最后进行羟磷灰石层析。

Wada等基于杆状病毒表达系统之上通过微粒体形式对重组环前列腺素合酶进行表达,经由磷酸钙凝胶吸收,以及DEAD-琼脂糖和羟磷灰石柱层析纯化,最后获得重组环前列腺合酶。

重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略一、融合表达蛋白的纯化：融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或（His）6肽段，从而使得可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或Chelating Sepharos e凝胶进行亲和色谱分子，一步可以达到~90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（95~99%）。

二、包含体表达蛋白的纯化：在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。

一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道）。

以下以rhGM-CSF（重组人粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子）的下游纯化工艺为例：E.coli细胞，超声破碎，离心收集包含体，用7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋白，作1：70稀释使蛋白复性，加硫酸铵至一定浓度后，上样于 P henyl-Sepharose 6 FF（high sub）色谱柱，活性组分再上Q-Sepharo se FF进行离子交换，最后上Superdex 75 prep grade凝胶进行凝胶过滤色谱，最终获得了纯度较高的rhGM-CSF，同时，DNA及内毒素去除率均很高。

如下表所示：步骤体积（ml）蛋白（mg）内毒素（EU/ml）DNA（pg/ml）起始（复性样品）4344 490 421 180HIC疏水柱 880 220 243 0.46AIEX阴离子交换 620 88 251 0.14GF凝胶过滤 1045 62 9 0.08三、周质表达的蛋白的纯化：可用渗透压休克方法，使周质释放，然后利用扩张床技术将含有菌体的悬液直接上柱（STREAmlINE系列凝胶），菌体穿过而表达的蛋白上柱。

重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。

这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。

下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。

一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。

常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。

不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。

例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。

2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。

常用的表达载体有质粒、病毒载体等。

质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。

3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。

转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。

转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。

4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。

常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。

二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。

细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。

分离方法包括离心、电泳、柱层析等。

2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。

常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。

3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。

例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。

这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。

三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。

例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。

重组蛋白和多肽的分离纯化1.概述表 1 重组蛋白不一致表达策略的优点与缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破碎表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离保护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠与溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解与折叠通常具有正确的结构与功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各类性质的蛋白、核酸、多糖等。

在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。

因此蛋白质的分离纯化能够看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。

当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，关于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性与稳固性的要求，关于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度与得率之间进行一个平衡，所下列游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。

蛋白质的功能依靠于蛋白质的结构，关于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中务必根据目标蛋白的特点，使用合适的操作条件与方法，保证目标蛋白的活性尽量不缺失。

除了在分离纯化的初期，要使用快速的方法除去影响目标蛋白稳固性的杂质，还要严格操纵涉及蛋白质变性的各类因素，来避免蛋白质失去活性。

蛋白质的构象稳固性能够通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）与去折叠（u）间自由能的变化（ΔG f→u）来衡量，ΔG f→u越大蛋白质就越稳固。

重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。

本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。

关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。

据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。

由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。

纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。

但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。

与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。

目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。

重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。

因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。

90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。

本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。

1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。

mar) 质粒,用无血清和无双抗的DME M 稀释至100μl ;另一支离心管加入10μl Lipofectamine R eag ent (脂质体) ,用无血清和无双抗的DME M 稀释至100μl 。

(2) 将上述DNA 稀释液和lipofectamine 稀释液混合, 室温下放臵40min ,使DNA 和脂质体作用,形成DNA - 脂质体复合物。

(3) 在上述DNA - 脂质体复合物转染液中加入800μl 无血清和无双抗的DMEM ,轻轻混合,将其覆盖在用无血清和无双抗的DME M 洗过的S H - SY5 Y细胞上,将6 孔板臵于37 ℃、5 %C O2 条件下培养4 - 6h 。

(4) 移去原来的转染液, 换新的生长培养基继续培养, 分别于转染后48h 、72h 和96h 在荧光显微镜下检查绿色荧光蛋白的表达情况并拍照。

转染方式如图1 。

2 结果转染后48h 、72h 和96h 在荧光显微镜下观察发现,转染过的细胞均有荧光出现。

在接种细胞密度为3. 0 ×105 cellsΠml 时,绿色荧光的表达比细胞密度为 3. 0 ×106 cellsΠml 时绿色荧光的表达要高,转染72h 的表达量高于转染48h 的表达,但与转染96h 的表达没有明显差别。

而且,在同样的接种密度及转染时间下转染p g fpΠmar 细胞的G FP 的表达要比转染pcmvΠg fp 的细胞表达高。

没有转染的细胞(对照组) 则不表达。

如图2 、3 、4 、5 、6 。

3 讨论自1984 年Mirkov itch 等在研究果蝇组蛋白基因结构时发现MAR 以来的10 年,人们已克隆和分析了多种生物许多基因的MAR 序列,如人的β- 干扰素基因、载脂蛋白B 基因、鸡的溶菌酶基因、卵清蛋白基因和球蛋白基因,兔的免疫球蛋白K 轻链基因、果蝇热休克基因等序列。

鸡α-珠蛋白基因5’端MAR 长1737b p ,含多种转录因子结合位点及大量的A - b ox 和T -b ox ,这些结构均利于基质与MAR 的结合。

重组蛋白的提取纯化原理重组蛋白是指通过基因工程技术将外源基因导入到宿主细胞中，使其表达出目标蛋白。

重组蛋白具有广泛的应用价值，如药物研发、生物制药、农业生产等领域。

然而，重组蛋白的提取纯化是制约其应用的关键环节之一。

本文将从不同的角度介绍重组蛋白的提取纯化原理。

一、基于物理性质的提取纯化原理1. 离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质表面电荷的分离技术。

其原理是利用离子交换树脂的静电吸附作用，将带有相反电荷的蛋白质分离出来。

离子交换层析适用于分离电荷差异较大的蛋白质，但对于电荷差异较小的蛋白质分离效果较差。

2. 凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种基于蛋白质分子大小的分离技术。

其原理是利用不同孔径大小的凝胶过滤树脂，将分子大小不同的蛋白质分离出来。

凝胶过滤层析适用于分离分子大小差异较大的蛋白质，但对于分子大小相近的蛋白质分离效果较差。

3. 亲和层析亲和层析是一种基于蛋白质与配体之间的特异性结合作用的分离技术。

其原理是利用亲和树脂上的配体与目标蛋白之间的特异性结合作用，将目标蛋白分离出来。

亲和层析适用于分离具有特异性结合能力的蛋白质，但对于没有特异性结合能力的蛋白质分离效果较差。

二、基于化学性质的提取纯化原理1. 氢氧化铝沉淀法氢氧化铝沉淀法是一种基于蛋白质表面亲水性的分离技术。

其原理是利用氢氧化铝与蛋白质表面的羧基和氨基之间的静电吸附作用，将蛋白质分离出来。

氢氧化铝沉淀法适用于分离亲水性较强的蛋白质，但对于亲水性较弱的蛋白质分离效果较差。

2. 盐析法盐析法是一种基于蛋白质表面电荷和溶液离子强度的分离技术。

其原理是利用盐对蛋白质表面电荷的影响，使蛋白质在高盐浓度下发生沉淀，从而分离出来。

盐析法适用于分离电荷差异较大的蛋白质，但对于电荷差异较小的蛋白质分离效果较差。

三、基于生物学性质的提取纯化原理1. 亲和纯化法亲和纯化法是一种基于蛋白质与其特异性结合分子之间的亲和性分离技术。

其原理是利用特异性结合分子与目标蛋白之间的亲和性结合作用，将目标蛋白分离出来。

基因工程重组蛋白的表达与分离纯化实验目的：1.了解基因工程重组表达载体的构建和筛选方法；2.掌握重组蛋白诱导表达的机理；3.掌握蛋白的分离纯化方法，并学会使用SDS-蛋白质凝胶电泳；实验原理：将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。

先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。

然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。

表达蛋白可经SDS-PAGE检测。

实验器材：1.仪器：高速冷冻离心机、恒温培养箱、高压灭菌锅、SDS-凝胶电泳仪、水浴锅、抽滤装置、AKTA液相色谱仪等；2.材料：LB培养基、溶菌酶、缓冲液A和B、氨苄青霉素、IPTG诱导剂、10%SDS等；实验内容：1.灭菌：①配置LB培养基20 ml*2 +100 ml*6(配方：酵母粉 0.5%，NaCl 1%，胰蛋白胨1%)；②黄、蓝枪头各一盒；2.菌体活化及扩培：①每瓶20 ml LB培养基中加入20 ul Amp后，再加入30~40 ul DH5α菌液，置于37℃恒温箱内，培养12~16 h；②活化后，在六瓶100 ml LB培养基中分别加入100 ul Amp后，再从20 ml活化后的菌液中取2 ml，置于37℃恒温箱内扩大培养，至少培养2.5 h以后加入IPTG 200ul，37℃，培养14~16h；3.细胞破碎及蛋白分离：①将菌液用大离心管收集，配平后，4000r/min，离心15 min，收集菌体；②用20 ml BufferA重悬菌体，4000r/min，再离心15 min，收集菌体；③用4 ml BufferA重悬菌体，加入溶菌酶40 ul混匀，静置15min；④再加入4 ml BufferB，混匀，75℃水浴保温1 h；⑤用高速冷冻离心机在4℃的条件下，8000r/min，离心20 min，收集上清液；⑥将上清液分装入几个浓缩管中，4℃，3000r/min浓缩一段时间至终体积为5-10ml，做好标记，备用；⑦实验过程中，配置五种AKTA液相色谱仪所需液体，并抽滤2遍；4.AKTA液相色谱分析及SDS凝胶电泳：①首先学习AKTA仪器的相关使用方法和注意事项，对仪器进行排气，平衡缓冲液冲洗等操作(该部分由老师操作演示)；②取5 ml浓缩后的液体过滤后上样，观察屏幕上紫外吸收曲线的变化，适时用离心管收集每个峰的样品，做好标号，备用。

以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化策略点击：112 添加时间： 2007-7-27 9:29:25 分离纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白的步骤为：细胞破碎→包含体洗涤→包含体变性→蛋白复性→层析纯化。

一、包含体的洗涤：纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白，包含体的洗涤至关重要，实验室最常用的破碎细胞的方法是超声破碎，超声处理时，DNA被切断无需再加DNA酶I，超声时产生大量的热，需在冰水浴中间断进行，一般选择超声强度和次数与包含体表达状况有关，表达量高，包含体致密的可以反复多次超声，和多次用超声缓冲液吹洗，8000－10000 rpm/min 10min弃上清，留取沉淀；对于表达量低，包含体不够致密的，在洗涤时就应注意，超声条件要温和，离心速度要提高12000－15000rpm/min 10－15min，必要时可以加入1－5％的TritonX－100和1－4M尿素浸泡过夜，或进行磁力搅拌以增加洗涤强度和净度。

二、包含体的变性常用的变性剂有8M尿素、6M盐酸胍、SDS。

尿素因价格低廉、呈电中性，变性条件温和，稀释复性后可以直接过离子交换剂进行纯化，常作为包含体变性剂的首选。

盐酸胍是强变性剂，复性时易出现沉淀，影响回收，且复性液中必须透析除净盐酸胍后，方可进行离子交换层析分离，不作首选；SDS与蛋白形成带负电的阴离子复合物，并与阴离子交换剂有强吸附，与阳离子交换剂不结合，更致命的弱点是常常会影响蛋白质的生物学活性，不常使用。

变性条件的选择，包含体变性完全与否直接影响进一步的复性，因此包含体的变性一定要完全。

对于易变性的包含体，室温放置或37℃1－3hr，甚至过夜变性，不易变性的包含体，可选择60℃3hr变性。

对于含有二硫键的蛋白质，为了变性完全，使二硫键完全打开，还应加入还原剂ß－ME和DTT。

三、蛋白质的复性蛋白质复性的最大问题，是在复性过程中形成中间体和多聚体，中间体阻碍作用大的使蛋白质正确折叠困难，复性就困难；阻碍小或无阻碍的容易复性。

实验报告题目:单元四:重组蛋白的分离纯化及检测指导老师:王磊日期:2013/11/7-201311/9一．实验目的：1、学习亲和层析的原理；2、掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作；3、了解和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；4、掌握SDS-PAGE分离蛋白质组分的操作方法；5、了解Western blotting的原理及其意义，掌握Western blotting的操作方法；6、应用Western blotting 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上的重组蛋白。

二．实验原理：(1)亲和层析：以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。

蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。

已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。

过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。

在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。

金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。

本实验用IPTG诱导表达的蛋白质GFPuv是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。

(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：由丙稀酰胺单体（acrylamide)和交联试剂N，N’－甲叉双丙稀酰胺（N,N-methylene bisacrylamide)在催化剂存在的情况下聚合而成的三维网状结构的凝胶，改变单体的浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径大小的凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：①化学聚合－催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），通常控制这两种溶液的用量使聚合在1h内完成；②光聚合－催化剂：核黄素，通过控制光照时间和强度可控制聚合时间。

（完整版）1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。

调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。

分装成15瓶（每瓶200ml）。

2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。

37℃过夜。

第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。

2、诱导（超净台）加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。

25℃摇床培养4小时。

3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。

注意配平。

4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。

将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。

离心收集上清液。

600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。

超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。

探头浸没于菌液中，不可伸入过长。

注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。

5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。

将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。

第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。

2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。

3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。

用洗脱液调零，测OD280。

（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。