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第2章 蛋白质分子设计

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第2章 蛋白质的构件-氨基酸

第2章 蛋白质的构件-氨基酸

二、氨基酸 ——蛋白质的构件分子
Protein Architecture
§１ 蛋白质的元素组成
碳50-55% 蛋白质的元 氢6-8% 素组成特点 氧20-23% 氮15-18% *平均含氮16% 硫0%-4%
有些蛋白质还含 有微量的磷、铁、 锌、铜、钼、碘等 元素。 蛋白质系数:6.25
氮 1 5 % -1 8 %
参照甘油醛
COO| H — C — NH 3+
氨基位置
L-Aa
D-Aa
什么是α-氨基酸？
• ----C-C-C-C-COOH
γ β α
• ----C-C-C-C(NH2)-COOH α-氨基酸
• ----C-C-C(NH2)-C-COOH
β-氨基酸
• ----C-C(NH2)-C-C-COOH
γ-氨基酸
当溶液的pH值低于某氨基酸的等电点时， 则该氨基酸带正电荷，在电场中向负极移动。
当溶液的pH值高于等电点时，则该氨基酸 带负电荷，在电场中向正极移动。 当液的pH等于等电点时，氨基酸所带净 电荷为零，在电场中不移动。
等电点的特点和意义： • 溶解度最低，易沉淀， 用于分离纯化等。
等电点时不电泳， 电泳液的pH值要 偏离等电点。
• 谷氨酸钠－味精；
• 天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并
使香味浓厚爽口；
• 天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：－甜味素APM
（4）农业
• 杀虫剂：刀豆氨酸、5-羟色氨酸可使南方毛虫拒 食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍 生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果； • 杀菌剂：N-月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病；-1， 4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等； • 除草剂：如N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；

第二章蛋白质的组成及物理化学性质

第二章蛋白质的组成及物理化学性质

Met
M
5.74
2. 极性中性氨基酸
• Gly、Ser、Tyr、Cys、Thr、Asn、Gln • Cys侧链的巯基失去质子的倾向较其它氨基 酸大，极性最强 • Gly侧链介于极性与非极性之间
2. 极性中性氨基酸
H
CHCOONH3+
甘氨酸 丝氨酸 酪氨酸
glycine
Gly
G
5.97
serine tyrosine
PTC- 氨基酸 苯氨基硫甲酰氨基酸
S
C
N H R
40℃， H+ 、硝基甲烷
N S
C N H C CH R O
可用层析法鉴 定出aa的种类
PTH- 氨基酸 苯硫乙内酰脲氨基酸
4. 重要的化学性质
Edman反应
此反应即是目前“蛋白质顺序测定”的设计原理
4. 重要的化学性质
丹磺酰氯（DNS）反应
此反应可用于测定肽链N端氨基酸的种类
R
O2 N
R
F ＋ H2N CH COOH
NO2
O2 N NO2
HN
CH
COOH ＋ HF
DNFB
DNP - 氨基酸
此反应最初被Sanger 用于测定肽链 N-端氨基酸
4. 重要的化学性质
R H2N CH COOH ＋
Edman反应
N C S
PITC
异硫氰酸苯酯
40℃，弱碱
H N OH C CH O
arginine
Arg
R
10.76
组氨酸
histidine
His
H
7.59
蛋白质的稀有氨基酸
• 蛋白质的稀有氨基酸是基本氨基酸的衍生物，没 有相应的三联密码子

第十二讲蛋白质分子设计

第十二讲蛋白质分子设计

本节小结
1、蛋白质分子设计：通过蛋白质模型和结构预测来构建具有新功能的蛋白质 2、分子设计分类：根据对蛋白质改造的程度、根据改造对象分为两类 不同，蛋白质分子设计分为三类 3、掌握蛋白质分子设计的程序
建模 → 优化 → 获得突变体 → 结构和功能分析 4、掌握蛋白质设计思路 （试验性科学=理论设计+实验过程）
认识具有能动性 意识对物质具有反作用 只要精神不滑坡，办法总比问题多
五、设计思路（9个步骤）
（一）获得原蛋白质的结构与能信息
一级和高级结构、功能结构域、同源蛋白、基因、理化性质
（二）建立原蛋白分子的结构模型（原蛋白结构模型）
模型来源：
PDB或文献
实验测试三维结构—衍射、NMR……
预测：如：同源蛋白进行三维结构预测
20种aa各具特殊的侧链，侧链基团的理化性质和空间排布各不相同，可形成多种 多样的空间结构，具有不同生物学活性。
一级结构不同，蛋白质功能和活性存在差异，甚至完全不同。
每种蛋白质具有特定的结构，执行其特定的功能
– 甚至一级结构上个别aa变化 → 特定功能的丧失或改变。 – 最经典的例子：镰刀型红细胞贫血病，即患者Hb 2条β链第6位Glu→Val – 蛋白酶：个别aa突变（关键aa），酶活性丧失
2、意义：（通过分子设计、人工改造蛋白）
理论上：解析蛋白质结构和功能关系 实践上：满足生产实践的需求
2、意义——理论上：
蛋白质分子设计是蛋白质工程领域的核心问题与前沿领域 是一门新兴的研究领域，是众多学科的交叉
结构生物学、信息生物学、分子生物学、蛋白质化学、细胞生物学、免疫学等
随其他学科的发展而不断地发展，其内容也在不断地更新。
4、结构和功能分析——蛋白质分子设计的流程

1教学设计-蛋白质的分子结构

1教学设计-蛋白质的分子结构

《蛋白质的分子结构》教学设计一、教材分析本节课是生物化学第二章第二节蛋白质分子结构的内容。

它是在学生学完氨基酸、肽、稳定蛋白质分子的作用力的知识后，转入难度较大的蛋白质分子结构的学习。

蛋白质是学生接触到的第一个生物大分子，部分学过生物的同学对蛋白质的了解也只是基础知识。

学生没有建立起蛋白质分子结构的概念。

因此本堂课蛋白质的分子结构是本章节的重点内容。

它与前面所学的氨基酸、肽等内容联系紧密：也为今后学习酶、理解其它生物大分子的结构奠定基础。

二、教学目标【知识目标】①掌握蛋白质的一级、二级、三级、四级结构的概念及其作用力②掌握蛋白质二级结构的基本类型和结构特点。

③理解蛋白质结构与功能的关系。

【能力目标】通过观察、总结、推理等手段，培养学生的观察思考、归纳总结和创造思维能力。

【情感目标】通过发现问題、解決问题的过程，培养学生的探素精神。

使学生完成由感性认识到理性认识的过程，促进学生形成正确的世界观。

三、教学重点与难点蛋白质的分子结构属于微观世界，是看不见、摸不着的，通过展示图片，动画讲解来帮助学生理解，仍要学生发主观能动性，所以本节课的重点是蛋白的一级结构、二级结构，难点是白质的空间结构。

四、教学方法根据本节课的内容及学生的实际水平，我采取启发式学法。

作为理解蛋白质功能的重要理论，蛋白质的结构是一个极其抽象的知识。

对于学生米说，蛋白质的创设一种氛国，引导学生进入积极思考的学习状态就很重要了。

而启发式教学就重在教师的启发，创设问题情景，以此调动学生内在的认知需求，激发学生的探究蛋白质结构的兴趣。

五、教学手段充分发挥电脑多媒体的辅助教学作用。

多媒体以图片、动画等多种形式强化对学生感观的刺激，加强教学的直观性，増强学生的感性认识，提高学习兴趣，使学生在主动获取知识的过程中完成重点、难点的学习，从面完成教学日标。

六、教学过程五、板书设计第二节蛋白质的分子结构一、蛋白质的分子结构（一）蛋白质的一级结构（二）蛋白质的空间结构1、蛋白质的二级结构（1）α-螺旋（2）β-折叠（3）β-转角（4）无规则卷曲2、蛋白质的三级结构3、蛋白质的四级结构二、蛋白质结构与功能的关系（一）蛋白质一级结构与功能的关系（二）蛋白质空间结构与功能的关系。

第02章 生物制品制备的一般步骤

第02章 生物制品制备的一般步骤

方法：离心、膜过滤、自然沉降。
目的：将细胞碎片或未充分破碎的组织等杂质去掉。 （三）目的产物的分离纯化 除去可溶性杂质，同时富集目的产物的过程，称之为分
离纯化。这是生物制品制备的核心。
方法：沉淀技术、离心技术、过（超）滤技术、层析技术、 萃取技术、电泳技术等，是生物制品制备的常用技术。 但应注意，生物分子千差万别，不同的目的产物，由于其 物理、化学性质不同，生物学特性迥异，因此没有一个方法适 合于任何生物制品的分离纯化
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
凝胶过滤法： 又称分子筛层析法
分子筛层析示意图
蛋白质洗脱体积与分子量的关系
将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱，记录各种蛋白质的洗脱 体积。以分子量的对数为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，作标准曲线。 待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离，记录其洗脱体积，然后 根据标准曲线计算其分子量。
四、蛋白质提取、纯化的一般步骤
1.选材： 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 原则：原材料来源充足；目标蛋白含量丰富；易于处理 和提取。 2.生物材料的破碎和预处理：常用的方法有组织匀浆法、
研磨、反复冻融、溶菌酶、高压破碎等。
目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成 分分离。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3.粗分离：将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、
离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确
估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验重复性 较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果有较大的影响。
三、蛋白质提取、纯化前的准备
在进行蛋白质的制备前，通常需要对以下几方面的内容加
以确定或预先了解。 ①明确实验目的和要求。科研、开发，还是要发现新的物 质。 ②通过文献调研和预备性实验，掌握目的蛋白质的理化性 质和生物学特性。如分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；热 稳定性；对配体分子的生物学亲和力等。 ③建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备蛋白质的关 键。 ④确定可能的技术路线和实验方案，这是最困难的过程， 要求具有很高的综合知识和实验技术水平。

第二章 蛋白质分子设计

第二章 蛋白质分子设计

5）使用芳香-荷电-疏的相互作用
２、配体诱导组装 配位结合位点设计在结构中有几个相互作用 片断的界面处。如果这个位点对配体有很高的亲 和力，则结合配体的合适的自由能将充分克服熵 消耗并且驱动肽自组装
＋
3、通过共价交叉连接实现肽的自组装
• 设计全新蛋白的主要障碍是肽链的构象熵。当几 个没有连接的肽链进行自助装时，熵势垒比较难 以克服。通过共价交叉连接可以减少构象熵。 • 自然界唯一用于交叉连接的方法是二硫键。
蛋白质分子设计的基础
蛋白质生物功能 蛋白质功能与结构的关系
蛋白质一级结构与功能的关系
蛋白质空间构象与功能活性的关系
结构生物学与生物信息学促进蛋白质分子设计
蛋白质分子设计的原则
• 蛋白质来源：真菌、细胞、动物蛋白质和 植物蛋白质 • 筛选以及纯化蛋白质需要测定它们的序列、 三维结构、稳定性、催化活性等
４、在合成模板上肽的组装
• 在模板上组装合成蛋白的方法
• 特点：使用人工合成的模板代替天然蛋白中的连 接二级结构的单元 • 模板：寡肽，可形成两个反平行β折叠链。在链的 两端设计一个二硫键，形成一个环状结构。
5、线性多肽折叠为球状结构
• 不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠成球形 的确定的三维结构是蛋白质设计追求的目标之一 • 主要障碍：构象熵 • 实例:α-螺旋 根据α-螺旋的两亲性。形成的α-螺旋显著稳定 性是因为形成明显的疏水核，还有Glu 和Lys形成 的盐桥，螺旋偶极的电荷中和，增加了在螺旋/转 折连接处的柔性。
蛋白质从头设计的手段
１、二级结构模块单元的自组装：
优点：设计或合成都比较简单
缺点：蛋白质的稳定性（熵较大，依赖浓度） 结构的简单重复
α螺旋设计使用的策略

蛋白质分子设计[详细讲解]

蛋白质分子设计[详细讲解]

蛋白质分子设计[引言]蛋白质是一类非常有用的物质，在生物体的进化过程中起着非常重要的作用。

与其它化学试剂比较：（1）分子量非常大；（2）在机体内稳定；（3）专一性的优劣。

分子生物学的发展弥补了上述缺点，如定位突变、PCR使蛋白质可能工程化生产。

蛋白质设计（蛋白质的结构、功能预测）涉及多学科的交叉领域，包括材料学、化学、生物学、物理及计算机学科。

其应用范围涵盖了药物、食品工业中的酶、污水处理、疫苗、化学传感器等，设计的蛋白质也不仅仅限于20种天然氨基酸，也包括非天然氨基酸、有机/无机模块。

蛋白质设计的目的：（1）为蛋白质工程提供指导性信息；（2）探索蛋白质的折叠机理。

蛋白质设计分类：（1）基于天然蛋白质结构的分子设计；（2）蛋白质从头设计。

存在问题：与天然蛋白质比较：（1）缺乏结构独特性；（2）缺乏明显的功能优越性。

第一节基于天然蛋白质结构的分子设计一、概述蛋白质结构与功能的认识对蛋白质设计至关重要，需要多学科的配合。

蛋白质设计循环如下：1．对要求的活性进行筛选。

2．对蛋白质进行表征，如测定序列、三维结构、稳定性及催化活性。

3．专一型突变产物。

4．计算机模拟。

5．蛋白质的三维结构。

在PDB中搜索，无纪录即进行X射线、NMR方法或预测并构建三维结构模型。

6．蛋白质结构与功能的关系。

蛋白质突变体设计的三个主要步骤：1．突变位点和替换氨基酸的确定。

（1）确定对蛋白质折叠敏感的区域。

（2）功能上的重要位置。

（3）其它位置对蛋白质突变体的影响。

（4）替换或加减残基对结构特征的影响。

2．能量优化和蛋白质动力学方法预测修饰后蛋白质的结构。

3．预测结构与原始蛋白质结构比较，预测新蛋白质性质。

上述设计工作完成后，再进行蛋白质合成或突变实验，分离、纯化并对新蛋白质定性。

二、蛋白质设计原理1．内核假设。

假设蛋白质独特的折叠形式主要由蛋白质内核中的残基相互作用决定。

所谓内核指蛋白质在进化过程中的保守区域，由氢键连接的二级结构单元组成。

第二章 蛋白质结构的组织形式

第二章 蛋白质结构的组织形式

结构模体(motif，structural motif）
αα模体 ββ模体（发夹式β模体） βαβ模体 反平行β层回纹模体 螺旋-转折-螺旋模体
αα
αα：常为两股平行或反平行的右手螺旋段缠绕
形成的左手超螺旋。两螺旋的排列如图，是纤 维状蛋白质的主要结构元件；
ββ（发夹式β模体）
成，其螺旋含量一般在60％以上，有的高 达80％。α螺旋在这类蛋白质中大多以反 平行方式排布和堆积，所以又称反平行α 结构。 按照螺旋排布的不同拓扑学特征，又可分 为一些亚组。肌红蛋白、血红蛋白、烟草 花叶外壳蛋白、细胞色素b，等均属此类结 构。
α型结构(αstructure)分类
(1) 线绕式α螺旋(coiled-coil α helix)：纤维蛋白的结构基础，有足够 强度和柔性 (2) 四螺旋束 (four helix bundle) (3) 珠状折叠(globin fold)：血红蛋白 (4) 复杂螺旋组合
a、DNA结合模体（DNAbinding motif）：专一地 与DNA结合。λCro、阻 遏蛋白等中发现 b、钙结合模体 （calcium-binding motif)： 对钙结合专一，又称 “EF手”。小白蛋白、 钙调蛋白、肌钙蛋白等
超二级结构特征描述
序列模式：是指蛋白质一段肽链上
每一残基构象和其氨基酸序列的关 系，描述的是蛋白质空间结构与氨 基酸序列的关系。 每一类型的超二级结构都有确定的 序列模式 应用：从蛋白质一级结构中预测哪 一段肽链含有哪种类型的基序。
/scop/
蛋白质是具有高度组织、结构极复杂的生物
大分子
第三节 蛋白质结构的形成 —多肽链的生物合成与折叠
了解这种复杂蛋白质结构的形成机理，对于

第二章 蛋白质分子设计

第二章 蛋白质分子设计

二、蛋白质功能的全新设计
蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的 结构又具有有趣和有用的功能。功能设计主 要涉及键合及催化。
为达到这些目的可以采用两条不同的途径： 反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功 能；从头设计功能蛋白质。
蛋白质的功能设计
１．通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能 ２．键合及催化的从头设计 ３．在全新蛋白质中引入结合位点 ４．催化活性蛋白质的设计 ５．膜蛋白及离子通道的设计 ６．新材料的设计
蛋白质的全新设计内容
蛋白质结构的从头设计
蛋白质功能的从头设计
取得的进展：血红素结合蛋白、 氧化还原活性蛋 白质、DNA结合蛋白及基于蛋白质的高分子材料。
一、 蛋白质结构的从头设计
1) 二级结构模块单元的自组装 2) 配体诱导组装 3) 通过共价交叉连接实现肽的自组装： -S-S-；
DAB 4) 在合成模板上的肽自组装 5) 线性多肽折叠为球状结构 6) 基于组合库的全新蛋白质设计
T4 lysozyme (contd.)
Tm (the melting temperature)
Tm (the melting temperature): the temperature at which 50% of the enzyme is inactivated (or more rigorously, 50% of the enzyme is unfolded) during reversible heat denaturation. The higher Tm, the more stable the protein. WT T4 lysozyme’s Tm: 41.9 °C
Introduction to Structural Biology: prediction,

第4讲-蛋白质3

第4讲-蛋白质3

习题
•7.已知20种氨基酸的平均相对分子质量是128，一
蛋白质分子有2条肽链组成，共有肽键98个，此蛋白
质的相对分子质量最接近于
（）
•A.12800 B.12544 C.11036 D.12288
•8.多个氨基酸分子缩合形成2条肽链的蛋白质时,相
对分子质量减少了900,由此可知,此蛋白质分子所含
的氨基酸数和肽键数分别是
• 氨基酸在PI时以_______离子形式存在,在PH大于 PI的溶液中大部分以_______离子形式存在, 在PH 小于PI的溶液中,大部分以_______离子形式存在。 兼性、负、正
• 蛋白质由许多_______通过_______形成一条多肽 链,在每条多肽链的两端有自由的_______基和自 由的_______ 基,这两端分别称为_______末端和 _______末端。 氨基酸、肽键、羧基、氨基、羧基、氨基
A.蛋氨酸 B.苏氨酸 C.组氨酸 D.半胱氨酸 E.丝氨酸
习题
• 30. 蛋白质中的非共价键有：
A.氢键 B.二硫键 C.盐键 D.肽键 E.疏水键
习题
• 31. 下列哪种蛋白质在PH＝5的溶液中带正电荷?
A.PI为4.5的蛋白质 B.PI为7.4的蛋白质 C.PI为7的蛋白质 D.PI为6.5的蛋白质 E.PI为3.5的蛋白质
•A.HbA α1亚基中的第六位谷氨酸被缬氨酸取代 •B.HbA α2亚基中的第六位谷氨酸被缬氨酸取代 •C.HbA β亚基中的第六位谷氨酸被缬氨酸取代 •D.HbA β1亚基中的第六位谷氨酸被缬氨酸取代
• 正常型 ---Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys ---
• β链
谷氨酸
• 镰刀型 ---Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys ---

蛋白质设计

蛋白质设计
5.最优的氨基酸侧链几何排列 为了获得蛋白质结构及功能的专一性，我们 在构建一个蛋白质模型时必须满足所有合适 的几何要求，并且要满足蛋白质折叠的几何 限制
LOGO
四、蛋白质分子设计的程序
1、收集相关蛋白质的结构信息 2、建立所研究蛋白质的结构模型 3、结构模型的生物信息分析 4、选择设计目标 5、序列设计 6、预测结果 7、获得蛋白质 8、新蛋白质的检验 9、完成新蛋白质设计
LOGO
一、蛋白质分子设计的分类 （一）蛋白质分子设计的层次 可分为两个层次 在蛋白质三维结构已知基础上所进行的直接 将立体结构信息与蛋白质的功能相关联的高 层次的设计工作 在未知立体结构的情形下借助于一级结构的 序列信息及生物化学性质所进行的分子设计 工作
LOGO
一、蛋白质分子设计的分类
（二）蛋白质分子设计分类 按照改造部位的多寡分为三类： 第一类为“小改”，可通过定位突变或化学 修饰来实现；在已知结构的天然蛋白质分子 多肽链内的确定位臵上，进行一个或少数几 个氨基酸残基的改变，以研究和改善蛋白质 的性质和功能。 主要是臵换，删除或插入氨基酸，依赖基因 水平。
LOGO
总结 1.一种基因可编码产生多种蛋白质，一种蛋 白质可以产生多种活性多肽，一种活性多肽 可以产生多种功能 2.蛋白质的功能与高级结构相联系，生物学 活性和理化性质主要决定于空间结构的完整 性。 3.一级结构决定了它的二级，三级结构，如 果一级不破坏，就能恢复到原来的三级结构 一级相似的蛋白质，其基本构象及功能也相 似
第二章 蛋白质分子设计
第一节:蛋白质分子设计原理 第二节:基于蛋白质天然结构的分子 设计
第三节:全新蛋白质分子设计
LOGO
蛋白质分子设计
蛋白质是一类非常有用的物质 与化学试剂相比，蛋白质的分子量非常巨大，大多数 不能通过化学方法生产 专一性很强是蛋白质一大优点，但因此其应用范围却 受到影响 分子生物学的发展克服了上述缺点。特别是定位突变 及PCR 使得蛋白质可能工程化，但用随机方法从事蛋 白质工程研究的效率非常低

生物化学第二章 蛋白质

生物化学第二章 蛋白质
第二章
蛋白质
目 录
一、蛋白质的种类、含量与分类 二、氨基酸 三、肽 四、蛋白质的结构 五、蛋白质的性质 六、食物中的蛋白质 七、蛋白质的分离与纯化
一、蛋白质的化学组成与分类


主要组成元素：C、H、O、N、S 及 P、Fe、 Cu、Zn、Mo、I、Se 等微量元素。 百分数约为：碳占50~55%，氢占6~8%， 氧占20~30%，氮占15~18%及硫占0~4%。 大多数蛋白质所含氮素约为16%，因该元素容 易用凯氏(Kjeldahl)定氮法进行测定。 故蛋白质的含量可由氮的含量乘以 6.25(100/16)计算出来: 即：蛋白质含量＝6.25×样品含氮量
aa向正极移动 aa向负极移动 aa不移动
pI的测定：
酸碱滴定法； 基于aa所带基团 均可解离； 得到弱酸弱碱曲 线； 根据aa上可解离 基团的pK值计算 等电点： pK：解离常数。 以甘氨酸为例：

由此可知：



在生理pH内，aa 的羧基和氨基全部解离； 具有这种性质的物质称两性电解质； 带有相反基团的分子叫两性离子； 滴定中Gly的阳离子（R+）、阴离子（R-） 和两性离子（R°）的比例随pH而变； 当溶液中只有两性离子时， pH = pI
蛋白质氨基酸
蛋白质中存在的20种氨基酸，除脯氨酸外，在其 α -碳原子上都有一个自由的羧基及一个自由的氨基； 由于脯基酸的α -氨基被取代，它实际上是一种α -亚 氨基酸。此外，每种氨基酸都有一个特殊的R基团。
生物体内常见氨基酸的分类：

蛋白质氨基酸： 蛋白质中常见的20种氨基酸 稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20 种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些 稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。 如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。 非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨 基酸。

2-2 生命活动的主要承担者—蛋白质 教案

2-2 生命活动的主要承担者—蛋白质 教案

第2章第2节生命活动的主要承担者——蛋白质
【教学目标】
知识目标
1.说明氨基酸的结构特点，以及氨基酸形成蛋白质的过程。

2.概述蛋白质的结构和功能，解释蛋白质分子结构多样性与功能复杂性的关系。

能力目标
比较几种氨基酸的结构，写出氨基酸的结构通式。

看图说明氨基酸、多肽、蛋白质的关系。

学会分析、比较，获取信息。

情感目标
认同蛋白质是生命活动的主要承担者，进一步确立生命物质性的观点。

关注蛋白质研究的新进展。

【教学重点】
氨基酸的结构特点，以及氨基酸形成蛋白质的过程。

【教学难点】
脱水缩合反应中的有关计算。

【课时安排】 2课时
【板书设计】 第2章 第2节 生命活动的主要承担者——蛋白质
【教学反思】
1、氨基酸的结构通式、氨基和羧基的名称及结构，脱水缩合反应要求学生动手写，必须过关。

通过与学生交流发现，有的学生在课堂上虽然听懂了，但课后没有及时巩固，并不能准确的写出相关内容。

2、相关计算仍然是难点。

特别是“每种氨基酸都至少含有一个氨基酸和一个羧基”、“m 条肽链中至少含有m 个氨基和m 个羧基”要帮助学生理解。

如果不考虑R 基，每个氨基酸就只含一个氨基、一个羧基，如果有多个氨基或羧基，就说明R 基上有。

蛋白质分子设计

蛋白质分子设计

蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案。

虽然经过漫长岁月的进化，自然界已经筛选出了数量众多、种类各异的蛋白质，但天然蛋白质只是在自然条件下才能起到最佳功能，在人造条件下往往就不行，例如工业生产中常见的高温高压条件。

因而需要对蛋白质进行改造，使其能够在特定条件下起到特定的功能。

蛋白质的分子设计又可按照改造部位的多寡分为三类：第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装；第三类为“大改”，即完全从头设计全新的蛋白质（de novo design）。

有关全新蛋白质设计的内容请参见文献，本文不赘述。

常见的蛋白质工程改造包括提高蛋白的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系研究等。

由于对蛋白质结构-功能关系的了解不够深入，成功的实例还不很多，因此更需要在蛋白质分子设计的方法学上开展深入研究。

蛋白质的分子设计可分为两个层次，一种是在已知立体结构基础上所进行的直接将立体结构信息与蛋白质的功能相关联的高层次的设计工作，另一种是在未知立体结构的情形下借助于一级结构的序列信息及生物化学性质所进行的分子设计工作。

此处只探讨第一类分子设计，因为在利用三级结构信息的同时也运用了一级结构序列及有关生化信息，第一类的分子设计工作实际上已包含了第二类工作，而后者实际上是在不得已的情形下所进行的努力。

蛋白质分子设计的过程简单说来就是首先建立所研究对象的结构模型，在此基础上进行结构-功能关系研究，然后提出设计方案，通过实验验证后进一步修正设计，往往需要几次循环才能达到目的。

一般的分子设计工作可以按以下五个步骤进行：（1）建立所研究蛋白质的结构模型，可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。

（2）找出对所要求的性质有重要影响的位置。

同一家族中的蛋白质的序列对比、分析往往是一种有效的途径。

蛋白质的结构与功能(2)

蛋白质的结构与功能(2)

NH3+
+H+
R CH COO - +OH- R CH COO-
NH3 +
+H+
NH2
pH<pI
阳离子
pH=pI
氨基酸的兼性离子
pH>pI
阴离子
38
总结
a、各种aa的pI不同； b、同一pH下，各种aa所带电荷不同；用
离子交换、电泳将aa分开。 pH＜pI ：aa+ pH＞pI：aac、处于pI时，aa溶解度最小，易沉淀； 可分离aa。
26
半胱氨酸
-OOC-CH-CH2-SH + HS -CH 2-CH -COO -
+NH3
-HH
+ NH3
-OOC -CH -CH 2-S S -CH 2-CH -COO -
+ NH 3
+ NH 3
二硫键
胱氨酸
27
28
三、稀有氨基酸(也称修饰氨基酸)
是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。 （1）4-羟脯氨酸 （2）5-羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。 （3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中） (4)г-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。 （5）Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋
第二章 蛋白质的结构与功能 Chapter 2 Structure and Function of
Protein
1
第一节 蛋白质的一般概念
生命是蛋白体 的存在方式，这种 存在方式本质上就 在于这些蛋白体的 化学组成部分的不 断自我更新。
恩格斯《反杜林 论》1878

蛋白质结构与功能(3)

蛋白质结构与功能(3)
为什么蚕丝和蜘蛛网的丝心蛋白中Gly， Ala较多？
蛋白质的二级结构---转角在蛋白质中普 遍存在（几乎占球蛋白的1/3，位于球蛋 白的表面，Gly,Pro常出现）
常见的二级结构都有典型的键角和氨基酸
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成分（只有Gly常被发现）
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Hale Waihona Puke 蛋白质三级结构：1．绝大部分球蛋白既含α-螺旋，也含β-折叠结构。 2．残基侧链所处位置由其极性决定：
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球蛋白结构的多样性决定了其功能的多样性（酶， 运输蛋白，调节蛋白，免疫蛋白等）
多种球蛋白的分析揭示其共同的结构模式（超二级 结构，结构域，a-a转角， β- a- β环， β- 桶）
β-
蛋白质四级结构有简单的二聚体，也有大的复合体 （寡聚体，多聚体，TMV）
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蛋白质变性与折叠
• 蛋白质结构改变导致功能丧失 • 氨基酸序列决定蛋白质空间结构 • 多肽链的折叠是一个渐进的过程 • 某些蛋白质的折叠需要协助（分子伴侣，热激蛋
·非极性残基Val、Leu、Ile、Met、Phe常位于蛋白质 内部，形成疏水性内核；
·带电荷极性残基Arg、His、Lys、Asp、Glu常位于蛋 白质分子表面；
·不带电荷的极性基团Ser、Thr、Asn、Gly、Tyr、Trp 常位于蛋白质分子表面（位于分子内部时与其他基 团形成氢键）。
12
1.什么是传统机械按键设计？
• The End
26
21
蛋白质工程
• 从DNA入手，改变基因，定做新的蛋白质的技术。 这一新技术综合运用蛋白质的三维结构、结构与 功能的详细信息，重组DNA 技术，用定位突变基 因的方法直接修饰或人工合成基因，有目的地按 照设计来改变蛋白质分子中任何一个氨基酸残基 或结构区域，从而定向地改造蛋白质的性质，使 其具有人们所希望的性能的新型蛋白质，或者创 造自然界不存在的性质独特的蛋白质。（见下图）
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第二章 蛋白质分子设计
Chapter two Protein Design
引 言
在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体 外的许多重要任务： 酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子； 抗体起到防护的作用; ……
从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质: 生物合成不需要消耗很多能量 专一性很强 不产生副作用并且能很快降解
有机磷水解酶 (Organophosphorus Hydrolase, OPH) 的改造：
提高对特定底物的催化效率;
扩大底物范围;
增加酶的稳定性
Dong Y J, 2005
目的和意义
通过对 MPH 的结晶和三维结构的测定，研究 MPH 活性中心的结构，并通过定点突变及活性测定 来验证，确定 MPH 的结构和功能的关系，为MPH 的改性和利用提供科学的依据和良好的材料。 OPH 是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农药 降解酶，同时也是应用最为广泛的农药降解酶，为 此对甲基对硫磷水解酶的深入研究将有利于甲基对 硫磷水解酶的广泛应用。
• 二：探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架 的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及 本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找 定性和定量的规律。
（一）蛋白质分子设计的层次
• 分为两个层次：
• 一是在蛋白质三维结构已知基础上的分 子设计 ； • 二是在三维结构未知的情况下，借助一 级结构序列信息及生物化学性质进行分 子设计工作。
1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明 显的功能优越性 2、三级结构的确定性较差
第一节 蛋白质分子设计原理
计算机模拟 功能分析
基因构建 突变蛋白质产品
Protein 设计循环
蛋白质分子设计的流程
天然蛋白质
蛋白质结构预测
蛋白质三维结构 结构与功能的关系
蛋白质晶体学
பைடு நூலகம்
数据 的输 入
蛋白质突变体设计及结构预测
• 并与对应的天然蛋白质进行比较，检验 突变设计的效果，
• 同时进一步修正设计方案。
（四）定位突变残基的鉴定 (p56)
根据结构信息
确定残基的突变 蛋白质中功能 残基的鉴定 突变方法鉴定突变 功能残基
利用蛋白质同源性 鉴定功能残基
1．根据结构信息确定残基的突变
• 最有效最直接的方法
• Alan Fersht和GregWinter等测定了酪氨酰tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该 酶的Cys35被结构相似的Ser所取代后的结构， 发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3’ 羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证 实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。
甲基对硫磷水解酶基因的分析
以1393位的TGA结束的可能的ORF有八个,MW:34.4kD –ATG:368，398 bp 典型的启动子序列结构:TTGCAA-17个氨基酸-TATACT (320-365bp) 典型的核糖体结合位点:AGGA (381 bp)
结论：MPH基因的CDS: 398—1393（331aa)
• 对氧化的稳定性
• 对重金属的稳定性 • pH稳定性
• 替代表面羧基，把Met转换为 Gln、Val、Ile或Leu
• 替换表面荷电基团，His、Cys 以及Tyr的置换 • 专一性的改变，增加逆转数， 改变酸碱度
• 提高酶学性质
（二）定位突变的种类
要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序 列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因 直接修饰法、盒式突变技术等。 根据基因突变的方式，分为以下3类： 插入一个或多个氨基酸残基； 删除一个或多个氨基酸残基； 替换或取代一个或多个氨基酸残基。 要达到基因定位突变的目的，多采用体外 重组 DNA 技术或 PCR方法。
蛋白质分子设计原理
金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要 求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂 分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。 对于金属Pr，围绕金属中心的第二壳层中的相互作 用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主 链的相互作用。
最优的aa侧链几何排列。Pr侧链构象由空间两个立 体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置) 结构及功能的专一性。这是Pr设计最困难的问题
（二）蛋白质分子设计的分类
• 1．定点突变或化学修饰法 • 2．拼接组装设计法 • 3．从头设计全新蛋白质
三、蛋白质分子设计的原则 (p50)
• 1．活性设计
• 2．对专一性的设计
• 3．Scaffold设计(框架)
• 4．疏水基团与亲水基团需合理分布
• 5．最优的氨基酸侧链几何排列
蛋白质分子设计原理
蛋白质应用受限的原因
蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因:
(1)蛋白质分子量非常大(10，000-1，000，000)， 不能通过化学方法生产;
(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其 它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的; (3)专一性致使其应用范围受到影响。
蛋白质设计目前存在的问题
Match to Vector:
Strong
Moderate
Weak
Segment of suspect origin: Segments matching vectorStrong match:
1-113, 3838-4071 bp
。
真正的目标序列：114~3,837 bp。
同源序列搜索（Blastn :114-3837 bp ）
• RNase T1 的结构改造是分子设计中的一 个成功实例 • T1核糖核酸酶含有104个aa残基，天然酶 有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人 在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键， 热稳定性增加。
T4噬菌体溶菌酶
1. 突变引入二 硫键 2. 去除Gly或引 入Pro
1 2
3
1 The nucleotide sequence including mpd from Pseudomonas sp. WBC-3 2 Plesiomonas sp. M6的甲基对硫磷水解酶基因 匹配区为134~1866，Identities=1720 bp／1733 bp(99％) CDS: 331aa (398-1393bp) 3 Pseudomonas putida的甲基对硫磷降解蛋白基因 匹配区为168~1393，Identities=1025／1026(99％) CDS: 341aa (368-1393bp) 两个基因的CDS不一致，分别匹配于MPH的398，368-1393bp
有机磷农药的长期广泛使用 已经使很多水体及土壤被严重 污染，而且直接影响到人们的 身体健康。
敌敌畏、对硫磷（1605）、 甲拌磷（ 3911）、内吸磷 （1059）、乐果、敌百虫、 马拉硫磷（4049）
例：甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase, MPH ）结构和功能的研究
突变体的结构预测，将预测的结构与原
始的蛋白质结构比较
4．构建突变体，获得突变体蛋白
依据所设计好的突变，利用化学合 成或PCR等方法构建突变体。进行基因 测序验证突变体后，将突变体进行表达， 纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。
5．突变体蛋白质的检验
• 测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定
性、催化活性等，
序列设计
• 设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易 于形成α螺旋的残基； • 设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于 形成β折叠片的残基；
• 而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。
溶菌酶结构
• 例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性 分子的设计
• Cutte成功设计了一个具有明显
的核酸酶活性的34肽，该肽可水
例如: 通过引入二硫键期望提高蛋白质的 稳定性，面临的一个问题是：怎样选择合 适的突变位点？ 蛋白质中的二硫键具有一定的结构特征， 随机选择突变位点引入二硫键会给整个分 子带来不利的张力，不但不会提高蛋白质 的稳定性，反而会降低蛋白质的稳定性。
3．预测突变体的结构
根据所选定的氨基酸残基位点及突
变后的氨基酸种类，利用相关软件进行
解下列底物，但活性依次降低：
polyC、polyA、polyU、polyG。
其主要活性源于二聚体；而 天然核酸酶仅消化polyC、polyU、 polyA。
四、蛋白质分子设计步骤 （p52）
设计目标
蛋白质数据库 修正设计 建立结构模型 获得目标蛋白质 检测
结构信息分析
蛋白质分子设计步骤图
序列合成
第二节 基于天然蛋白质结构的分子设计
MPH与OPH的序列比对
二者同源性仅为13.6%，确定MPH是一个有别于OPH的蛋白质。 二者在功能上的相似性不能用蛋白的一级序列的相似性加以解 释，推测二者功能上的相似性与其一级序列构成的高级结构中 活性中心结构的相似性有关。
内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内 核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）
Pr 内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结 合一个水分子或惰性气体），没有重叠 所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。 蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白 质键所取代
疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及 不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力
（三）定位突变的程序 （p55）
1．建立所研究蛋白质的结构模型
可以通过X射线晶体学、二维核磁共
振等测定结构，也可以根据类似物的结
构或其他结构预测方法建立起结构模型。
2．找出对所要求的性质有重要影响的 位置 • 在改造中如何恰当地选择突变残基 是一个关键问题，这不仅需要分析 残基的性质，同时还需要借助于已 有的三维结构或分子模型。
几何优化及蛋白质动力学研究