核酸芯片微阵列分析概述

摘要生物芯片技术是二十世纪出现的最具有时代特征的一项革命性技术它用承载有成千上万种DNA和蛋白序列的厘米见方的固体芯片取代了传统生物分析中所用的凝胶滤器和纯化柱它的出现对生物农业医学领域乃至整个人类生活健康的各个方面带来了巨大的影响生物芯片技术的作用就像生物微处理器能够在基因组规模上对基因表达谱病人基因型药物代谢疾病的发生和进展过程进行快速和定量的分析生物芯片检测技术对生物学的发展具有革命性的意义通过应用生物芯片扫描仪人们能够自动读取生物芯片上的信息在短短几分钟内获取大量的数据而在以前要读取这些数据需要几个月甚至几年的时间在荧光检测技术中体现生化反应程度的荧光由生物芯片扫描仪中的激光激发并通过光电倍增管或CCD相机捕获形成数字图像此图像即是生物芯片实验分析的原始数据因此生物芯片扫描仪性能以及对原始图像的处理效果将对后续分析具有重要影响本课题来源于生物芯片北京国家工程研究中心所承担的十五国家863计划生物芯片专项的研发项目微阵列生物芯片扫描仪的研制该项目致力于研制基于CCD相机和激光扫描显微镜结构的国产化生物芯片检测仪器目标是研制出价格低廉性能优良的国产生物芯片检测系统样机能使用该仪器进行临床疾病诊断分析本文首先介绍了有关生物芯片的基本概念和几种常用的生物芯片检测技术其中重点介绍了生物芯片的荧光检测技术然后探讨了生物芯片和生物芯片激光共聚焦扫描仪的工作原理以及目前国内外研发的最新进展接着阐述了我们选用的设计方案并且给出了仪器的原理图和结构图着重介绍了自制生物芯片激光共聚焦扫描仪系统的硬件电路及其相应嵌入式软件的设计在本文的最后我们对扫描仪的线性度灵敏度和重复性等性能指标进行了测试结果表明此生物芯片扫描仪是一台高性能的检测系统关键词生物芯片生物芯片扫描仪微阵列信号检测AbstractThe magic of biochip analysis is sweeping through the agricultural and medical sciences, replacing traditional biological assays based on gels, filters, and purification columns with small glass chips containing tens of thousands of DNA and protein sequences. Biochip function like biological microprocessors, enabling the rapid and quantitative analysis of gene expression patterns, patient genotypes, drug mechanisms, and disease onset and progression on a genomic scale. Biochip detection instruments are revolutionizing biology. These ingenious devices allow biochips to be read in an automated fashion, providing an amount of data in a few minutes that would have taken months or even years to acquire with antecedent technologies.In this technique, fluorescence intensities, which reflect the degree of biochemical reaction, are detected by imaging the array with a laser and capturing the image with a photomultiplier tube or a CDD camera, resulting in the production of digital images. The images from the reaction arrays constitute the essential raw data for biochip. Therefore, biochip scanner and robust image processing are particularly important and have large impacts on downstream analysis.This project is come from National Engineering Research Center for Beijing Biochip Technology. The project is supported by “863” project on biochip, which is studying on laser confocal biochip scanner and CCD biochip scanner. The target is working out a cheap and work well laser confocal biochip scanner, which can be used in clinic diagnosis. In this paper, the basic concepts and general application flows of biochip technology are introduced, including the detailed principles of fluorescence detections for biochip. We discuss the principle of biochip scanner and the latest development and research in the world; we also introduce our design of biochip including its principle figures and structure figures. We introduce in detail that the system’s hardware and the embedded software. The performances, including linearity, sensitivity, repeatability and so on, are tested with special methods. This biochip scanner is a high performance detection system.Keywords: Biochip Biochip scanner Microarray Signal detection1 绪论1.1生物芯片技术1.1.1生物芯片技术生物芯片biochip的概念来自计算机芯片发展至今不过十几年时间但进展神速它是指能对生物分子进行快速并行处理和分析的指甲盖大小的薄型固体器件[1]生物芯片能够以生物学上史无前例的快速度和精确性来研究生物的基因组信息其发展的最终目标是将生命科学和医学研究中许多不连续的分析过程包括样品制备生化反应及检测分析等集成到由一块或多块芯片构成的芯片实验室Lab-on-a-chip[1]或微型全分析系统micro total analytical system, μTAS[2]中自从1991年Fodor[3]等人提出DNA芯片的概念后近年来以DNA芯片为代表的生物芯片技术[4]~[7]得到了迅猛发展目前已有多种不同功用的芯片问世而且有的已经在生命科学研究中开始发挥重要作用生物芯片按功能分有基因测序芯片[8]表达谱芯片疾病诊断芯片[9]药物筛选芯片样品制备芯片[10]生化反应芯片[11]结果检测芯片[12]等按工作方式分有被动式芯片和主动式芯片[1]两种根据芯片结构和工作机理分为微阵列Microarray芯片和微流体Microfluidic芯片[13] [14]前者是由排成阵列形式的生物分子包括核酸蛋白质等构成其分析应用原理都是基于抗原和抗体的结合核酸分子的碱基互补作用等生物分子之间的亲和作用力所以也可通称为亲和型生物芯片后者则是以各种微管道网络为结构特征用来实现对包含生化组份微流体的控制和检测分析包括常见的毛细管电泳芯片[15][16]PCR反应芯片[11]介电电泳分离芯片[17][18][19]等本文谈到的生物芯片为微阵列生物芯片微阵列生物芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量生物大分子比如核酸片段多肽分子甚至组织切片细胞等生物样品有序地固化于支持物如玻片尼龙膜等载体的表面组成密集二维分子排列然后与已标记的待测生物样品中靶分子反应反应结果用同位素法化学荧光法化学发光法或酶标法显示然后用精密的扫描仪或CCD 摄像技术记录通过计算机软件分析综合成可读的IC总信息从而判断样品中靶分子的数量[20][21]根据芯片上固定的探针不同微阵列芯片分为基因芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片等微阵列生物芯片的检测过程如图1.1所示图1.1 微阵列生物芯片的检测过程因为基因表达的模式和它们的功能密切相关因此微阵列生物芯片为研究人类衰老药物反应激素反应脑疾病膳食及其他临床相关研究提供了史无前例的信息微阵列生物芯片技术也能用来检测基因序列的改变因而为在遗传筛选测试诊断领域建立新方法扫清了道路组织芯片和蛋白芯片正在对传统的组织免疫和生化分析进行微型化改造加速了人们对肿瘤分类蛋白-蛋白反应酶活性的分析由于微阵列生物芯片技术具有研究细菌病毒线虫果蝇植物奶牛鸡小鼠大鼠及灵长目基因组的能力它正在成为生物化学领域研究的诺亚方舟1.1.2生物芯片技术的历史基础生物芯片技术的出现在生物学发展的历史上是独特的因为还没有其它的技术把如此多的学科结合在一起并且能对生物体系提供定量和系统的分析20世纪90年代早期在斯坦福大学[22]发展起来的生物芯片技术主要结合了六门学科的内容它们是生物学化学物理学工程学数学和计算机科学下面从生物学的角度来观察生物芯片技术在历史发展过程中的继承性早在1949年Pauling及其同事就描述了基因突变改变的蛋白质和疾病之间的关系Pauling的实验表明患有镰刀型贫血症的病人红细胞中的血红蛋白较健康人的在凝胶电泳分析时迁移距离不一样Pauling等人把这种现象正确地解释为两者的血红蛋白表面电荷不一致通过调查比较正常个体镰刀型贫血症基因携带者和患病者Pauling等人认为血红蛋白编码基因的变化是引起血红蛋白改变的原因随后的基因测序证明了这一点Pauling等人发表的论文为人类疾病的分子遗传分析铺平了道路也为现在的生物芯片技术在遗传筛选检测和诊断领域的应用奠定了概念上的基础在Science杂志上发表的这篇有关血红蛋白的论文是生物芯片技术历史基础上的一个里程碑Watson和Crick于1953年在Nature杂志上发表的一篇杰出的论文中预测了DNA 分子的化学结构通过使用结构化学和模型的数据作者正确地推测DNA分子包含两条方向相反的链两条链通过碱基之间的氢键力结合在一起Watson和Crick还建议了特异的碱基配对法则A-T和 C-G以及磷酸基团分布在外部的双螺旋结构随后的生化和结构研究证实了这些预测Watson Crick和Wilkins由于发现了核酸的分子结构以及核酸在生物体中传递信息的重要性而分享了1962年的诺贝尔奖双螺旋结构的发现是十九世纪科学发现最重要的突破之一也是现今生物芯片技术中杂交反应的化学基础DNA和RNA聚合酶能把核苷酸连接起来合成DNA和RNA链20世纪50年代圣路易斯华盛顿大学的Kornberg及其同事受到Cori实验室有关糖原磷酸化酶工作的启发发现了DNA聚合酶随后Cori的另外一名学生Ochoa又发现了RNA聚合酶的活性Kornberg和Ochoa由于发现了核酸和脱氧核酸生物合成的机制而荣获1959年的诺贝尔奖聚合酶证明有很多实际的应用包括作为DNA重组聚合酶链反应PCR和微阵列分析中的关键酶聚合酶的发现在生物学的发展史上有着非常重要的意义一个特殊的DNA聚合酶是反转录酶它能以RNA为模板来合成DNA这个酶的活性是1970年由Baltimore Temin和Mizutani发现的他们结合DNA聚合酶分析和放射性同位素标记的方法发现在劳氏肉瘤病毒和其他RNA病毒合成过程中有反转录酶出现反转录酶含有核酸酶的活性以及在RNA病毒合成过程中必须有反转录酶的出现都表明有来自病毒的RNA作为模板以后的研究证明了这一点反转录酶的发现是出乎意料带有戏剧性的因为它看上去和当时认为的遗传信息应该从DNA流向RNA而不能逆向流动的观点是相反的Baltimore Temin和Dulbecco由于发现了肿瘤病毒和细胞遗传物质之间的相互作用而荣获1972年的诺贝尔奖反转录酶有很多实际上的用途包括在第一次生物芯片芯片实验中用作标记的酶[23]在20世纪70年代斯坦福大学的研究者研究了基于硝酸纤维素膜和尼龙膜的许多应用途径这些方法为二十年后生物芯片技术的建立提供了基本的理论基础1975年斯坦福大学的Crunstein和Hogness发表了第一篇描述生物芯片的论文作者采用了硝酸纤维素膜点上细菌克隆的方法来分离果蝇基因他们发表的文章也表明了在DNA杂交实验中行和列的重要性斯坦福大学的Davis及其合作者也用硝酸纤维素膜来检测细菌的噬菌斑类似的工作也用在高等生物中鉴别了第一个差异性表达的基因哈佛大学的Maxam和Gilbert以及MRC中心的Sanger和合作者在1977年分别独立地发明了DNA测序方法Gilbert和Sanger由于他们在确定核酸碱基序列上的贡献而分享1980年诺贝尔奖Sanger化学方法被用来对人的基因组进行测序测序得到的数据信息又被用来构建DNA生物芯片1980年的诺贝尔化学奖被授予给斯坦福大学的Berg由于他对核酸生化性质的基础研究特别是在重组DNA方面所作的工作Berg及其合作者建立的DNA重组技术是20世纪最重要的科技进步之一并且显示出很多实际的应用包括现在生物芯片技术中用到的克隆文库的制备DNA聚合酶发现后引发的另一革命性发明是20世纪80年代早期Cetus公司的Mullis及其同事发明的PCR技术PCR技术可以从少量的遗传物质中制备数以百万计的DNA拷贝确保可以从任何生物样品中对任何一个基因进行DNA分析PCR 技术在生物芯片样品制备过程和生物芯片用于诊断过程中都有广泛的应用荧光染料数十年来一直用于生物膜的检测包括Waggoner和Stryer在20世纪70年代做的早期研究而后在20世纪90年代早期有人将花青素cyanine这种染料用于DNA探针的酶促制备过程Pinkel及其同事在20世纪80年代和90年代早期发明了双色标记和检测方法用于染色体分析以上在荧光和荧光显微镜方面所做的工作为现在的生物芯片技术中荧光标记和荧光检测的应用奠定了基础在玻片上进行的初期的杂交反应是20世纪80年代晚期和90年代早期由Mirzabekov及其合作者在莫斯科Fodor及其合作者1991年在Affymax公司Maskos 和Southern1992年在牛津大学Eggers及其合作者在Baylor Smith及其合作者在美国威斯康星大学分别进行的在Imperial Cancer Research Fund (ICRF)工作的Hans Lehrach及其同事在20世纪80年代后期开创性地把机械手用于DNA阵列的快速制备他们使用固体针在尼龙膜上点入基因组DNA克隆制备了较大的阵列尽管他们制备的阵列还比较大但他们的工作表明机械手可以用于阵列的制备高精度的运动控制系统可广泛地用于光引导原位合成接触式点样和喷墨式点样1.2 生物芯片的使用生物芯片的使用过程一般来说包括如图1.2所示的几个步骤样品处理目标分子富集转录文库制备增扩标记数据处理放射显影光化学电化学活性酶促反应综合信息分析检测洗涤分子间反应或杂交芯片制作配体点阵及固定化图 1.2 生物芯片使用过程 1.2.1 样品处理 生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体除少数特殊样品外一般不能直接与芯片反应必须将样品进行预处理例如从血液或活组织中获取的DNA/mRNA 样品在标记成为探针以前必须扩增以提高阅读灵敏度[24]根据样品来源基因含量检测方法和分析目的不同采用的分离扩增及标记方法也不同为了获得反应信号必须对样品进行标记标记方法有荧光标记法[25]生物素标记法同位素标记法等1.2.2 芯片制作生物芯片的制作需要做三方面的准备准备固定在芯片上的生物分子样品芯片片基和制作生物芯片的仪器研究目的不同期望制作的芯片类型不同制备芯片方法也不尽相同以基因芯片为例基本上可分为两大类一类是原位合成即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针适用于寡核苷酸一类是预合成后直接点样多用于大片段DNA有时也用于寡核苷酸甚至mRNA 1光引导原位合成法 AffymaxSanta Clara, CA 的Fodor 和他的同事在微电子工业的光刻技术基础上做了极具创意的改进发明了光引导原位合成法[26]用紫外光和固相化学合成的方法制作微阵列这种发明于上世纪九十年代初期的光引导原位合成方法发展非常迅速已经成为应用最为广泛的微阵列生物芯片制备方法中的一种Affymetrix 公司利用光引导原位合成技术制备核酸微阵列生物芯片2000年售出了超过200 000片用这种方法制作的微阵列生物芯片光引导原位合成前玻片表面先作硅烷化处理使玻片表面上生成活性胺基团然后用第二种含有特殊化学基团methylnitropiperonyloxycarbonyl MeNPOC 的试剂修饰活性胺基团MeNPOC 基团对于各种化学反应试剂都很稳定但可以被强紫外光照射大约30秒后有选择性地去掉MeNPOC 基团能够抑止任何没有紫外光介入下的化学反应因此被称为光保护基团去掉光保护基团后基片去除保护的表面上可以和特定种类的DNA 碱基充分反应微阵列生物芯片表面上的分子与DNA 碱基键合在脱氧核糖的3’位置这个位置上有一个活性氨基磷酸酯基团如图1.3 合成单元活化亲核反应键合重复图 1.3 光导原位合成的化学过程DNA 碱基连在玻片表面上这一过程被称为耦合每一个耦合过的碱基都在其5’羟基位有一个光保护基团如图 1.3用紫外光照射后碱基上的MeNPOC 基团被去掉且可与第二个碱基耦合重复去除掩膜基团耦合新的碱基步骤可以在玻片上合成各种序列的寡聚核苷酸利用光掩膜可以对微阵列生物芯片上特定区域有选择性的去除光保护基团从而在微阵列生物芯片表面的各个位置合成寡聚核苷酸光掩膜是半导体工业中用于生产微处理器用的镀铬模板光掩膜包括表面镀铬的玻璃板以及板上各个没有铬的区域如图1.4铬阻止紫外光通过而没有铬的区域则允许紫外光通过且照射到基片表面上因为掩膜可以加工成涂铬区域和不涂铬区域的不同种组合紫外光可以按照任何顺序照射到基片的各个区域这样可以用一组光掩膜逐步合成各种序列的寡聚核苷酸微阵列每个光掩膜可以在基片的任何位置合成DNA碱基镀铬模板上的单元可以做得很小能够制备点径为2050m的微阵列现在Affymetrix公司可以制备密度大于250000点/cm2的微阵列生物芯片光掩膜紫外光表面修饰有保护基团的基片键合后的碱基图1.4 按光掩膜定义的方式进行键合相比接触式和非接触式点样方法光引导原位合成的主要优势是任何序列的微阵列都可以用4种碱基A, G, C和T来构建用几种试剂代替为微阵列上每个位点制备和储存样品是其一大优势尤其是需要制备复杂的微阵列生物芯片时而劣势是其局限于制备短长度的寡聚核苷酸微阵列< 30个核苷酸光掩膜和微阵列生物芯片的加工成本也相当昂贵但是光引导原位合成法可能是最为经济的制备大量全基因组微阵列生物芯片的方法2点样法点样法是将预先通过液相化学合成好的探针PCR技术扩增后的cDNA或基因组DNA经纯化定量分析后通过由阵列复制器arraying and replicating device ARD 或阵列点样仪arrayer及电脑控制的机器人准确快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或玻片相应位置上支持物应事先进行特定处理例如以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷包被再由紫外线交联固定后即得到微阵列生物芯片点样的方式分两种其一为接触式点样[27]即点样针直接与固相支持物表面接触将样品留在固相支持物上其二为非接触式点样即喷点它是以压电原理将样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面打印法的优点是探针密度高通常1平方厘米可打印2500个探针缺点是定量准确性及重现性不好打印针易堵塞且使用寿命有限喷印法的优点是定量准确重现性好使用寿命长缺点是喷印的斑点大因此探针密度低通常只有1平方厘米400点点样机器人有一套计算机控制的三维移动装置多个打印/喷印头一个减震底座上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片根据需要还可以有温度和湿度控制装置针洗涤装置打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上检验点样仪是否优秀的指标包括点样精度点样速度一次点样的芯片容量样点的均匀性样品是否有交叉污染及设备操作的灵活性简便性等等图1.5所示为点样仪实物图图1.5 点样装置实物图1.2.3 芯片检测芯片结果的判读要依据标记的报告分子的种类来设计判读装置最早是用同位素标记法需经过曝光显影然后用具有寻址功能的扫描仪扫读荧光标记是芯片信息采集中使用最多也是最成功的一种报告标记它没有同位素的使用限制应用激光作为激发光源的共聚焦扫描装置具有极高的分辨能力可以定量测读结果并可以有极高的灵敏度和定位功能目前已被普遍用于芯片杂交结果判读[28]进行平行分析时需要采用两种或更多不同波长的激光来激发2种或2种以上的荧光素来示差显示杂交结果此时氩离子激光器及氦氖激光器是较好的选择例如General Scanning公司的Scan Array 3000是双色荧光标记双激光激发的[29]而其后的Scan Array 4000和5000则是四激光激发四色荧光标记的气体激光器虽然在性能方面有巨大的优势但是其体积较大而且使用寿命短限制了它在扫描仪系统中的使用最新的扫描仪系统中有些使用半导体固体激光器它体积小寿命长价格便宜而且随着科学技术的不断发展半导体固体激光器的性能也在不断提高逐渐接近气体激光器的性能使用半导体固体激光器取代气体激光器是未来生物芯片扫描仪开发的趋势1.2.4 芯片数据提取与分析微阵列生物芯片数据分析简单来说就是对微阵列生物芯片的图像进行处理对图像中斑点的荧光信号进行定量分析通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类最终整合荧光斑点的生物学信息微阵列生物芯片在一块片基上集成了数十个至数万个点的识别分子每个点对应于一个基因或一段核酸DNA RNA片断或cDNA序列和反应测定的光密度值对于多色荧光染料标记的芯片还包括了荧光强度的比例信息同时芯片制作的目的制作的条件和方法样品的制备反应条件清洗条件和检测条件等信息均与该芯片对应可见在芯片的制作测定前后都有大量的信息数据需要处理因此需要有一个专门的系统来处理芯片的数据[30]一个完整的芯片数据处理系统应该包括芯片图像分析和数据提取芯片数据的统计学分析目前商用芯片数据处理软件层出不穷并不断有新的软件推出常用的有Axon Instruments公司的GenePix Pro软件Biodiscovery 的ImaGene系列Parkard的QuantArray等微阵列芯片数据提取与分析主要包括图像数据提取芯片数据标准化处理Normalization比率Ratio分析基因聚类分析Gene Clustering[31][32][33]1图像数据提取激光扫描仪扫描芯片得到的Cy3/Cy5图像文件通过图像滤波定位信号斑点提取得到基因表达的荧光信号强度值和背景值最后以列表或矩阵形式输出提取的数据结果由于芯片的制作反应清洗和测定过程中难免灰尘的污染以及测定样品中核酸蛋白质细胞和组织碎片的干扰或者由于芯片扫描仪的噪音往往产生较大的刺峰信号如果不予以消除将影响实验的结果[31] ImaGene采用一种中值过滤器的方法这种方法只能消除较尖细的刺峰干扰对于较粗大的刺峰不能剔除对一些较粗大的背景噪声可以通过对二值化后的图像的进行图像分割计算各分割区域的特征圆度较好并且面积也比较符合指标的区域即可认为是信号点面积太大超过指标的区域或者面积比较大并且圆度指标比较差的区域可以认为是噪声点也有人采用基于模糊数学以及神经网络的数字形态学方法构造不同尺寸不同形状的滤波算子,经腐蚀膨胀等运算提高图像的质量[34][35][36]点样仪在芯片上所点点阵为一个阵列形式但是由于点样的误差这个矩阵形式的点阵会出现一定偏差例如整个点阵的扭曲或点阵中斑点位置的偏移而且由于芯片上较大组织碎片或者灰尘的污染得到图像中会出现尺寸较大且亮度较高的噪声点这些点使用模式识别的方法较难排除因此较多的软件对斑点的识别仍然需要人为干预和帮助最常用的斑点识别方法是在图像中选择需要识别的区域输入芯片阵列的行列数斑点半径和阵列的行列间距由计算机自动产生一个圆圈整列套在芯片图像中使每个圆圈内包括一个斑点由于点阵排列的不完全规则需要手动对单个点进行调整通常的定量程序可以提供不同的确定斑点信号值和背景值的方法可以选择整个斑点区域确定信号强度但因为斑点内像素强度并不一致因此斑点内有效信号像素并不组成一个圆形在精确定量的情况下需要在斑点区域内分离有效信号像素和背景像素[37][38]背景的测量方法也不尽相同对于标准的玻片片基微阵列生物芯片阵列上不同位置的背景水平是不同的因此通常对不同斑点选取不同的背景常以斑点圆形区域外的一个环状区域作为斑点背景区域微阵列生物芯片中阵列各斑点提取的数据有斑点像素均值斑点区域内各像素灰度值的平均斑点的面积斑点区域内像素总数斑点像素中值斑点区域内各像素灰度值的中位值斑点像素标准差斑点区域内像素灰度值的标准差背景像素均值背景像素中值和背景像素标准差等推荐使用斑点区域和背景区域像素灰度的中值作为斑点强度和其背景强度下文中若无特别说明均采用此方法计算斑点强度此外对于双色荧光标记的芯片还需要提取阵列各个斑点2种不同荧光的强度值比[31]图像分析的目的是将扫描得到的微阵列生物芯片图像变成一个斑点强度数据阵列在数据提取完成后必须将各样点的数据输出大部分软件将提取的数据按芯片上点阵排列顺序以TXT文本文件的格式存入磁盘以便供其他的分析处理软件调用或者将此数据集输入到特定的关系型数据库中保存便于进一步的分析处理和查询2芯片数据标准化由于样本差异荧光标记效率和检出率的不平衡需对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据芯片数据标准化正是基于此种。

1.生物信息学：研究大量生物数据复杂关系的学科，其特征是多学科模型;处理及分析，并以生物学知识2.二级数据库：3.FASTA序列格式：是将DNA始，其他无特殊要求。

4.genbank序列格式：是GenBank身，以“//”结尾。

5.Entrez检索系统：是NCBI点。

6.BLAST：7.查询序列（query sequence）索并进行相似性比较的序列。

P988.打分矩阵（scoring matrix）：在相似性检索中对序列两两比对的质量评估方法。

包括基于理论（如考虑核酸和氨基酸之间的类似性）和实际进化距离（如PAM）两类方法。

P29 9.空位（gap）：在序列比对时，由于序列长度不同，需要插入一个或几个位点以取得最佳比对结果，这样在其中一序列上产生中断现象，这些中断的位点称为空位。

P2918.直系同源：指由于物种形成事件来自一个共同祖先的不同物种中的同源序列，具有相似或不同的功能。

（书：在缺乏任何基因复制证据的情况下，具有共同祖先和相同功能的同源基因。

）19.旁系（并系）同源：指同一个物种中具有共同祖先，通过基因重复产生的一组基因，这些基因在功能上可能发生了改变。

(书：由于基因)UPGMA）：最初，每个序列归为一类，然后找到）：是一种不仅仅计算两两比对距算法要求进化速率保持恒定的缺陷。

）：在一系列能够解释序列差异的的进化树中找）：它对每个可能的进化位点分配一个概率，然tree）：在同一算法中产生多个最优树，合并这）：放回式抽样统计法。

通过对数据集多次）：开放阅读框是基因序列的一部分，包含一段codon bias）：氨基酸的同义密码子的使用频率与相量高的同功tRNA所对应的密码子，这种效应称为密码子偏好性。

30.基因预测的从头分析：依据综合利用基因的特征，如剪接位点，内含子与外显子边界，调控区，预测基因组序列中包含的基因。

31.结构域（domain）：保守的结构单元，包含独特的二级结构组合和疏水内核，可能单独存在，也可能与其他结构域组合。

微阵列芯片法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述微阵列芯片法是一种基于微纳米技术的生物组学分析方法。

通过将数万至数百万个生物探针固定在芯片上，微阵列芯片能够同时检测大量样本中的多个目标序列或分子，并提供高通量、高灵敏度、高特异性的分析平台。

微阵列芯片的原理是将具有特定功能的DNA、RNA或蛋白质序列固定在芯片表面的离散区域。

这些固定的探针序列可以与待测样品中的特定目标序列或分子发生特异性的互补反应。

通过检测与探针序列结合的目标分子的信号变化，可以准确地识别和定量目标分子的存在和表达水平。

微阵列芯片的应用非常广泛。

在生物学研究中，它可以用于基因表达分析、基因突变检测、单核苷酸多态性分析等。

在医学诊断中，微阵列芯片可以用于癌症早期检测、基因治疗效果评估、药物毒性筛查等。

此外，微阵列芯片还可以用于农业育种、环境监测以及食品安全等领域。

微阵列芯片具有许多优势。

首先，它可以同时检测大量目标序列或分子，大大提高了实验效率和吞吐量。

其次，微阵列芯片的检测灵敏度高，能够检测到非常低浓度的目标物质。

此外，微阵列芯片还能够实现高通量、高特异性的分析，减少了实验的时间和成本。

综上所述，微阵列芯片是一种重要的生物组学分析工具，具有广泛的应用前景和巨大的发展潜力。

在未来，随着技术的不断进步，微阵列芯片将更加成熟和完善，为生物学研究和医学诊断带来更多的突破和进展。

1.2 文章结构文章结构主要分为引言、正文和结论三个部分。

在引言部分，本文将首先概述微阵列芯片的基本概念和原理，同时介绍文章的结构安排和目的。

在正文部分，将深入探讨微阵列芯片的原理、应用和优势。

首先，阐述微阵列芯片的原理，即通过微小尺寸的阵列结构实现高通量的生物分析和检测。

其次，介绍微阵列芯片在生物医学、生物工程和环境监测等领域的广泛应用，如基因表达分析、蛋白质芯片和微生物检测等。

最后，分析微阵列芯片相比传统方法的优势，包括高通量、高灵敏度、低成本和快速分析等方面。

生物芯片原理与技术复习题一、名词解释（59）1.基因芯片：把生物活性大分子（如蛋白质和核酸）或细胞等，密集排列在固定的固相载体上，形成微型的检测器件，固相载体通常是硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等2.反向杂交：是将各种不同的探针按有序的方式固定到固有的固相支持表面上，再与样本中标记的靶基因进行杂交。

3.实验设计：主要是指根据实验目的、实验材料及实验条件而选择合适的芯片，设计出最佳的样品生长、处理与收集方法，并在此基础上制定出杂交方案。

4.类型比较：通过比较不同样品类型的表达谱来找到差异表达的基因5.类型发现：通过基因表达谱的研究来对生物学样品进行分类6.MA散点图：横坐标为1/2(log2R+log2G),代表点的整体荧光读，用A（Average)表示，纵坐标为log2(R/G)=log2R-log2G,代表两种荧光强度的比值对数，即对数比，用M(minus)表示7.MA图可以更直观的观察系统偏移的形式及是否存在强度依存的系统偏移。

是log2R对log2G的散点图的一种转换形式，顺时针旋转45度并把尺度缩小为原来的1/2.8.信噪比：得到的真实荧光信号的一个重要参数，典型的信噪比是信号峰值除以信号的变异9.假阳性率：为假阳性基因数占芯片上基因总数的比例(％)，其计算公式可以简化为：PFR＝FP/N，其中N为芯片上的基因总数。

10.Gridding:划格，根据芯片阵列的行和列的数目由计算机生成的一个网格。

11.生物芯片：把生物活性大分子（如蛋白质和核酸）或细胞等，密集排列在固定的固相载体上，形成微型的检测器件，固相载体通常是硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等。

①狭义：微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列等②广义：能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件，主要还包括微流体芯片和“芯片实验室”12.生物学重复：基因芯片实验的目的是解释生物问题，因此选择来源于同一生物群体的不同样本进行实验是最好的方法13.探针（probe）:使用前标记了的，用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA或RNA或寡核苷酸序列。

第七章 微阵列芯片随着 cDNA 微阵列和寡核苷酸芯片（下文没有特别说明时，统称为 DNA 微阵列）等高通量检测技术的发展，我们可以从全基因组水平定量或定性检测基因转录产物 mRNA 。

在本章中，基因表达数据特指基于 DNA 微阵列实验得到的反映 mRNA 丰度的数据，而不包括基因表达最终产物——蛋白质丰度的数据。

由于生物体中的细胞种类繁多，同时基因表达具有时空特异性，因此，基因表达数据与基因组数据相比，要更为复杂，数据量更大，数据的增长速度更快。

基因表达数据中蕴含着基因活动的信息，可以反映细胞当前的生理状态，例如细胞是处于正常还是恶化状态、药物对肿瘤细胞是否有效等。

对基因表达数据的分析可以获取基因功能和基因表达调控信息，这是生物信息学的重大挑战之一，也是 DNA 微阵列能够在生物医学领域中广泛应用的关键原因之一。

基因表达数据分析的对象是在不同条件下，全部或部分基因的表达数据所构成的数据矩阵。

通过对该数据矩阵的分析，可以回答一些生物学问题，例如，基因的功能是什么？在不同条件或不同细胞类型中，哪些基因的表达存在差异？在特定的条件下，哪些基因的表达发生了显著改变，这些基因受到哪些基因的调节，或者控制哪些基因的表达？哪些基因的表达是细胞状态特异性的，根据它们的行为可以判断细胞的状态（生存、增殖、分化、凋亡、癌变或应激等）等等。

对这些问题的回答，结合其它生物学知识和数据有助于阐明基因的表达调控路径和调控网络。

揭示基因调控路径和网络是生物学和生物信息学共同关注的目标，是系统生物学 (Systems Biology) 研究的核心内容。

目前，对基因表达数据的分析主要是在三个层次上进行： 1 、分析单个基因的表达水平，根据在不同实验条件下，基因表达水平的变化，来判断它的功能，例如，可以根据表达差异的显著性来确定肿瘤分型相关的特异基因。

采用的分析方法有统计学中的假设检验等。

2 、考虑基因组合，将基因分组，研究基因的共同功能、相互作用以及协同调控等。

基因表达谱分析技术1、微阵列技术( microarray) 这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA 序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。

其原理基本是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针”(cDNA、ESTs或基因特异的寡核苷酸)，并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA 或mRNA 反转录生成的第一链cDNA 进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。

其优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达进行对比分析。

包括cDNA芯片(cDNA microarray)和DNA 芯片( DNA chips)。

cDNA 芯片使用的载体可以是尼龙膜，也可以是玻片。

当使用尼龙膜时，目前的技术水平可以将20000份材料点在一张12cmxi8cm的膜上。

尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了的双链cDNA 片段。

要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。

杂交的结果表示这一样品中基因的表达模式，而比较两份不同样品的杂交结果就可以得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。

杂交使用的探针一般为mRNA的反转录产物，标记探针使用32PdATP。

如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。

杂交时使用两种不同颜色的荧光标记不同的两份样品，然后将两份样品混合起来与一张芯片杂交。

洗去未杂交的探针以后，能够结合标记cDNA 的点受到激发后会发出荧光。

通过扫描装置可以检测各个点发出荧光的强度。

对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品中的丰度。

一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。

使用尼龙膜为载体制作cDNA 芯片进行研究的费用要比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。

微阵列数据分析（MicroarrayDataAnalysis）蔡政安副教授（台湾前⾔在⼈类基因组测序计划的重要⾥程碑陆续完成之后，⽣命科学迈⼊了⼀个前所未有的新时代，在⼈类染⾊体总长度约三⼗亿个碱基对中，约含有四万个基因，这是⽣物学家⾸次以这么宏观的视野来检视⽣命现象，⽽医药上的研究⽅针亦从此改观，科学研究从此正式进⼊后基因组时代。

微阵列实验(Microarray)及其它⾼通量检测(high-throughput screen)技术的兴起，⽆疑将成为本世纪的主流；微阵列实验主要的优势在于能同时⼤量地、全⾯性地侦测上万个基因的表达量，通过基因芯⽚，可在短时间内找出可能受疾病影响的基因，作为早期诊断的⽣物标记(biomarker)。

然⽽，由于这⼀类技术的⾼度⾃动化、规模化及微型化的特性，使得他们所⽣成的数据量⾮常庞⼤且数据形态⽐⼀般实验数据更加复杂，因此，传统统计分析⽅法已经不堪使⽤。

在此同时，统计学家并未在此重要时刻缺席，提出⾮常多新的统计理论和⽅法来分析微阵列实验数据，也⼴受⽣物学家所使⽤。

由于微阵列数据分析所牵涉的统计问题层⾯相当⼴且深⼊，本⽂仅针对整个实验中所衍⽣的统计问题加以介绍，并介绍其中⼀些新的图形⼯具⽤以呈现分析结果。

基因芯⽚的原理微阵列芯⽚即⼀般所谓的基因芯⽚，也是基因组计划完成后衍⽣出来的产品，花费成本虽⾼，但效⽤⽆限，是⽬前所有⽣物芯⽚中应⽤最⼴的，由于近年来不断改进，也是最有成效的⽣物技术。

⼀般⽽⾔，基因芯⽚是利⽤微处理技术，先把⼈类所有的基因分别固着在⼀⼩范围的玻璃⽚(glass slide)、薄膜(membrane)或者硅芯⽚上；然后，可以平⾏地、⼤量地、全⾯性地侦测基因组中mRNA的量，也就是侦测基因的调控及相互作⽤表达。

⽬前微阵列芯⽚⼤致分为以下两种平台:cDNA芯⽚及⾼密度寡核⽢酸芯⽚(high-density oligonucleotide)，两种系统⽆论在芯⽚的制备及样本处理上都有相当的差异，因此在分析上也略有不同，以下便就芯⽚的特性简略介绍。

微阵列芯片技术的应用进展微阵列芯片技术的应用进展陈翔上海交通大学医学院附属仁济医院自90年代中期基因芯片问世以来.先后现了多种以微阵列技术为核心的生物芯片,如蛋白质出片,组织芯片和细胞芯片等.这些芯片的技术日趋成熟,且多已商品化.随着人类基因组工程的完成.人们逐渐将目光更多地投向基囚功能,表达捌控和表达后机制疾病关系的研究.但对于大量功能未知的基,原有的实验窜技术效率低下,显得有些力不从心.而生物芯片技术作为一项新兴技术.为研究基因的表达,调控和功能提供了一个全新的平台本文对近年来几种生物芯片技术在医学领域应用的进展作一介绍.一,基因芯片基因芯片是最早问世的生物芯片.茛幕木原理是以微点样技术在固体支持物上排列成高密度的微最探针矩阡.计算机扫描收集分子杂交信号,通过生物信息学分析,获得需要的信息.基因芯片具有高效率,低消耗,大通量,高精度以及能平行对照研究等特点.自1995年第一块eDNA芯片在美国斯坦福大学诞生以来.基芯片技术迅速脚用于动,植物和人类基因的研究领域,如病原微生物毒力相关基的分析;肿瘤诊断,预后判断相关基因的发现和研究;药物研发,疗效评估等.近年来,生物芯片技术不断发展,芯片中排列的不再只是核酸分子,蛋白质,组织以及细胞等均能以微阵列形式被排列于芯片中,为分子生物学,组织化学和细胞培养等技术注入了新活力.基因芯片的制备目前墨要有4种疗法:④光引导原位合成法:首先将受光敏保护基团保护的4种核苜酸固定在玻片上.然后根据设计要求,采用不的掩模板别玻片进行掩敝,光照处的光敏保护基团分解,暴露的地方即町加上新的被保护的核甘酸.如此循环就能以高密度和精度束制备DNA微阵列芯片目前已能在1.6cm2的玻片上合成40万组寡核苷酸.这种方法缺点是制备掩模板成本高,费时间.因为寡核苷酸的每个碱基位需4块掩模板,合成一块含25个碱基对的微阵列芯片就需100块掩模板.②电喷射原位合成法:在二氧化硅基底.制备高密度的小坑作为DNA合成的微型反应池,小坑内作羟基化亲水处理.小坑问作氟化疏水处理.然后根据文际要求,在4个电喷头中分别装入A,T,G和C核苜酸,由计算机控制芯片作x—Y方向的运动,将4种核苷酸喷射至适当的小坑中,合成DNA微阵列.③接触式点涂法:将事先合成的DNA探车1通过一个点接触装置自动点到玻片上的指定地点,合成DNA微阵列.该法较为快速,经济.(化学喷射法:通过压电晶体或其他推进形式,从喷嘴内定量地将生物样品喷射到片基.此方法与接ChinJGastmenterol,2006,V o1.1l,No.2冉志华上海市消化疾病研究所(200001)触式点涂法的区别是喷嘴不与玻片接触.此外,根据芯片片摹材质不同_兀』分为无机片基和有机片摹.无机片基主要包括半导体硅片和玻璃片,其探针主要在原位合成;有机片基主要为有特定孔释的薄膜,如酸纤维膜,聚丙烯膜和尼龙膜等,其探针主要是预先合成后点涂或者喷射上去的.根据片基上探针类型,基因芯片可分为eDNA芯片和寡核甘酸芯片.基因芯片的样品核酸分子经过标记,与固定在载体的DNAIj午列巾的分子探针进行杂交.样品标记常用荧光染料,如将Cy3一dCTP,Cy5一dUTP等掺人eDNA序列.通过激光共聚焦扫描仪搜集荧光信号.Troy等应用P或标记cI】NA,并通过放射白显影术.应用X线胶片收集杂交信号,较激光共聚焦扫描仪的敏感性更高,延长曝光时间可检测到基因的低水半表达.但曝光时间过长,高表达基因的杂交信号可导致胶片过度曝光,冈此需根据基表达情况.采用不的曝光时间多数eDNA芯片采用全长eDNA,聚合酶链反应(PCR)片段.由丁不同的基因长短不一,解链温度(rrm值)各异,众多基因存同一张芯片上杂交的条件很难统一,此外也很难分辨同源基冈和重叠基冈.而这个问题可在寡核苷酸芯片中得到解决这种芯片主要通过筛选合适的核酸片段(15～7O个核酸分子左右),采用PM.MM探针对设计:探针对由一个完全配(perfectmatch.PM)和一个错误位点匹配(mismatch,MM)探针组成.MM探针是有效的内参照,如同PM探针一样.可与非特异性的序列结合.使不同来源样品中的寸F特异性背景信号可被有效地定量,扣除.通常由16—20个探针对构成一组来检测某一基因.其中每对探针对分别针对同…基冈的不同部分.对两个同源序列的基因而言,可南多fI探针确定一个基因.以区分这两个基因的差异.寡核酸芯片的这种设计可捉一岛探针的灵敏度和特异性,但成本较高.基因芯片南十高密度地排列了大量的核酸片断,因此常以基因表达谱差异显示.基因芯片可筛选不同样本之间如肿瘤组织,癌前病变和正常组织的芹肆表达基因.亦可检测同增殖周期或某种靶基被诱导或敲除前后细胞基因的差异表达.Mao等应用eDNA芯片检测肝癌异常表达基.为寻找与肝癌发病相关的,有助于疾病诊断的新基因打下良好的基础.Tai等先诱导大肠癌细胞MIP101耐药(如5. 氟脲嘧啶,顺铂和依托铂甙),再应用寡核苷酸芯片筛选耐药株和敏感株的差异表达基因.发现富含半胱氨酸的分泌性蛋nfsecretedproteinacidicandrichincysteine.SPARC)基一讲●胃肠病学2006年第11卷第2期因在耐药株中的表达明显减少.进一步研究发现该基因表达的蛋白质在维持肿瘤细胞对放,化疗的敏感性,降低复发率等方面具有重要意义.而寡核苷酸芯片由于其结构特点, 对研究基因的多态性或变异有一定优势.Behrensdorf等构建的寡核苷酸芯片能快速平行地检测基因突变.该研究将野生型基因(p53)片断作为探针,与Cy3标记的样品扩增DNA片断杂交.Cy5标记muts蛋白.当样品出现单核苷酸突变时,与探针杂交可出现单碱基错配.muts蛋白能识别错配处并与其结合.通过检测Cy3可了解样品与探针的杂交情况.检测Cy5可发现单核苷酸突变部位.弥补直接应用DNA 测序效率低下的不足.此外,基于基因芯片在基因表达谱方面的进展.构建肿瘤分型系统对弥补肿瘤病理学分型的不足.特别是对原发病灶不明的转移癌具有意义.Bloom等筛选了2252个基因,应用cDNA阵列和寡核苷酸阵列构建混合性平台.对140例肿瘤标本进行分型诊断,准确率高达85%.对5O例已知原发灶的肝,肺和脑转移癌进行分型.准确率达84%.二,蛋白质芯片蛋白质芯片由基因芯片技术直接发展而来.基凶芯片侦测细胞mRNA的变化,而真正影响细胞生理状态的却是蛋白质.蛋白质芯片以微阵列方式将各种"捕获"分子固定在支持物上.识别并结合样本中的靶蛋白分子."捕获"分子主要为各种蛋白质.也可是各种能与相应蛋白质特异结合的其他分子.如寡聚核苷酸,小分子酶的底物等.多数蛋白质芯片为抗体芯片.即"捕获"分子为各种抗体.可识别样本中由染色剂标记的抗原蛋白.抗原抗体反应后,靶蛋白分子与芯片结合.通过收集芯片上的荧光信号,可在蛋白质水平了解样本的基因表达情况.但与mRNA不同.样本中各种蛋白质的浓度差异很大.且蛋白质的理化性质更为复杂.如Cy3 和Cy5可分别以不同的方式与各种蛋白质结合,染色亦会引起蛋白质化学修饰并破坏抗原表位.影响其与抗体的亲和力.因此在实验设计中应考虑标记过程产生的偏倚,并需对收集到的信号进行标准化处理目前常以酶联免疫吸附测定(ELISA)技术为基础构建蛋白质芯片,芯片上的抗体与样本中相应的抗原结合,将针对样本所属种属的生物素化第二抗体与结合在芯片L抗原的其他表位再次结合,然后将结合了辣根过氧化物酶或Cy3的卵白素与生物素结合, 通过显色反应或检测荧光信号便可了解样本蛋白质的表达情况.这种方法无需对样本抗原染色,避免了标记过程引起的误差.此外检测不同样本蛋白质表达谱差异时,为避免不同染料对样本标记时产生的误筹,设计r不少新的实验方法.如将Cy3标记的样本l和Cy5标记的样本2分别与蛋白质芯片反应,再将Cy5标记的样本1和Cy3标记的样本2 与另一相同蛋白质芯片反应.这样同一种样本就获得了两种不同染料的数据.经过校正,可中和不同染料标记样本时产生的偏倚.Barry等先将某种染料标记已知对照组的样本, 并与芯片反应,收集信号,再混合对照样本和等量的未被标记的待测样本,竞争性地与芯片抗体结合.通过分析信号衰?127减情况了解待测样本和对照组中各种抗原的比例,最后将1%的对照组样本与待测组混合并与芯片反应,由于对照组样本比例极低.得到的信号可作为背景信号予以扣除,使两样本蛋白质表达差异的比较更精确.蛋白质芯片的"捕获" 分子除抗体外,多为抗原性蛋白,可检测样本中相应的抗体.Duan等以微阵列的形式将HBsAg,HBeAg,HBcAg和HCV Ag同定于玻璃切片.标记了SPA的胶体金为指示剂, 免疫金银法显色,检测样本血清的HBsAb,HBeAb,HBcAb 和HCV Ab.共检测了305例血清样本,结果发现与用常规ELISA相比无差异.但这种方法能同时检测几种抗体而无交叉反应,且40rain内就可得到结果.三,组织芯片对大量组织标本进行某基因或其产物的检测研究十分费时费力.Kononen等于1998年首先报道了组织芯片技术在肿瘤表达谱中的应用.先对组织标本进行穿刺(根据HE 染色情况选择合适的穿刺点)得到圆柱状样本,然后将样本在预先打洞的石蜡块上按次序排列成微阵列.样本可来源于经甲醛固定的组织,也可是新鲜的冰冻组织.将该蜡块制成切片,采用免疫组化,原位杂交和原位PCR等技术,可同时对数百个组织样本进行DNA,RNA和蛋白质的检测.穿刺针直径从0.6～2mm不等.一般而言,组织直径为0.6mm便有充分的代表性,且单个样本直径越小.每个切片所载的样本数量越大.但某些微结构复杂的组织,如肝脏,直径需达到2film才能将汇管区和中央静脉同时包括在内,穿刺3次便能包含肝脏组织所有的解剖结构.总的来说该技术具有高通量,简便经济(减少制作大量切片所消耗的时间和材料,节约了大量抗体和试剂)以及结果可靠(大量样本同时检测,无批内批间误差)的特点,但组织芯片的制作十分复杂.需专门设备和经验丰富的技术人员.目前该技术已得到广泛应用.如Murray等将134例结肠癌TMNII期患者的肿瘤标本制成组织芯片,并对其进行c—Met,B—Catenin和p53 表达的免疫组化检测.结果这3个因子分别有35%,77%和65%的阳性率,并发现这些基因的表达与肿瘤复发,转移呈正相关.四细胞芯片以上几种生物芯片主要用于检测基困和蛋白质的表达情况,无法进一步明确基因的功能.2001年Ziauddin等首次报道了细胞微阵列技术.发现玻璃切片上的细胞能够摄取预先固定于切片上的DNA一脂质复合物,并在原位被转染, 构建基因异位表达的表现型.此后m现了更多有关细胞芯片的报道,主要是关于RNAi细胞芯片.其基本原理是将由脂质载体承载的针对各个目的基因的siRNA或shRNA和信号报告媒介(如含GFP,dsRed等序列的质粒,用来判断转染效率)复合物按矩阵微点样排列在玻璃片上,将该玻璃片放入细胞培养介质,使细胞与其接触并生长,逆转染,观察各点样点的目的基因被RNAi敲除后细胞的表现型.以此推断该基因的功能(1oss—of-functiongenetics).Mousses等将rhodamine罗达明标记且由脂质载体包裹的针对eGFP的128siRNA点样l仵玻璃片上,使能稳定表达eGFP的}teLa细胞在玻璃片卜生长.结果发现玻璃片上点样点范的细胞eGFP被有效地敲除并检测到罗达明的荧光信号,而周边细胞未受任何影响,这较此前其他学者的研究有明显进步.玻璃片上排列的各种siRNA复合物各自干扰细胞,结果之间有明确界限,互不影响,这对最终图像分析和结果判断极为重要.Yoshikawa等将转染试剂,信号报告质粒,纤维连接蛋白和不同siRNA制成复合物点样排列在片上,完成r刘叶干细胞的转染,T扰.这种尝试实现了悬浮生长的细胞株存细胞芯片中的应Hj,扩大了细胞株的选择范同..迄今为止,许多研究小组构建了由质粒编码的siRNA,shRNA艾库,应用这些义J年识别和研究了许多参与p53通路,蛋门酶体功能和核转录凶子(N').KB信号传导路径的新基凶. 五,数据处理和分析芯片上的信号经扫捕收集后,需绎标准化处理干n分析.才能得到最终结果数据标准化处理是为了消除实验技术所致的信号强度和实际基因表达量之间的差异,井使各个样本和平行实验的数据处于相同的水半.以得到具有牛物学意义的基因表达结果.数据标准化方法根据芯片种类,数据处理阶段和目的不同而有所差异.常用的舣荧光染色cDNA微列阵的信号处理基本包括以下过程:1.实验数据的预处理:图像分析软件通过对芯片背景以及杂交点的光密度分析,校准每个点的表达量,然后取样本基因与参照基因荧光信号强度的比值(R/G)怍为每个样本基因的相对表达量.数据处理均以比值对数的彤式进行分析2.数据标准化:主要方法有"看家基冈"法,局部加权回归法和空问偏倚的处理等.如果经以上.法标准化后的数据仍存在偏差.就需要针对具体的实验操作步骤冉没计山具体的标准化方法.如点样顺序标准化聚类分析是指根据基芯片的基表达数据.将基因按ChinJGastroenterol,2006,V o1.II,No.2照功能或相似的表达行为进行归类.聚类基因表达谱为研究基表达差异,表达模式等提供便利条件.聚类分析最常用的软仲是Eisen实验室开发的CLUSTER和TREEVIEW 程序,通过CLUsTER程序可进行简单的数据过滤,均值和中问值标准化以及数据转化.聚类分析包括分层聚类,K.均值聚类,组织映射和组成性分析4种主要的聚类算法.通过CLUSTER程序聚类分析的数据.可用TREEVIEw程序做m基冈袭达谱和层次树状图,不仅可找表达行为相似的基因,也可分析基冈之间的调控关系.八,芯片实验审以上所介绍的生物芯片以微阵列技术为核心.大多已相当成熟,并已商品化.而另?种形式的生物芯片一芯片实验率正处于研发阶段.芯片实验宰指将生物化学等领域中所涉及的样品制备,生化反应以及分离检测等基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上,以完成不同的生物化学反应,并对其产物进行分析的?种技术.其核心是存片基上刻若干根微通道作为一系列牛物检测反应的发生地.2()世纪9O印代初Manz等提H1_r以微电子加工技术为依托的芯片实验室的没想.1994年Ramsey在Manz的基础上改进了芯片毛细管电泳的进样方法.1995年Mathies 等存微流控芯片上实现rDNA等速测序,1996年Mathies又将PCR与毛细管电泳集成在一起.随着微型机电技术(bio.MEMS),X光深层曝光微电铸复制(LIGA)技术的应以及纳米技术的进腱,微流路芯片的集成化程度越来越高.并广泛应用,如DNA,RNA,蛋白质的检测分析以及细胞培养和分析等;且具有高效率,低消耗等特点.该技术将成为继微『j年列芯片之后的研发重点.综上所述,物芯片技术高效,经济,特别是在基因表达谱的显示'面有其特有的优势.随着废技术不断发展.如实验室误差逐步减小,数据处理更加完善以及成本逐渐降低. 将有更宽广的廊川守间.(2005—12—15收稿;2006—0llO修回)。

DNA微阵列技术介绍及其应用DNA微阵列技术（microarray）指在固体表面（玻璃片或尼龙膜）上固定成千上万DNA克隆片段，人工合成的寡核苷酸片段，用荧光或其他标记的mRNA,cDNA或基因组DNA探针进行杂交，从而同时快速检测多个基因表达状况或发现新基因，快速检测DNA序列突变，绘制SNP遗传连锁图，进行DNA序列分析等的一种新技术，其基本原理是基于Southern杂交或斑点杂交技术。

将DNA 微阵列称为基因芯片实际上是不确切的。

生物芯片(bioship) 属于分子生物电子学范畴，只采用DNA或蛋白质等生物高分子为骨架制成大规模集成电路，用于研制第六代智能计算机。

DNA 微阵列有两种基本形式，即点样型DNA 微阵列和原位合成型DNA 微阵列。

点样型DNA 微阵列，通过PCR扩增的上万个DNA克隆，或常规合成的寡合苷酸被点样固定在一定固体表面（玻璃片，尼龙膜），用一组标记探针单独或混合处理检测。

制备方法：采用常规技术制备DNA，用点样仪自动点样在玻璃片上。

1.制备DNA片段：采用特异引物从各个克隆进行PCR扩增或将基因组DNA克隆到通用载体，然后纯化后重悬浮于3*SSC，使终浓度为0.5ug/ul. 2.微阵列制作：玻璃片清洗，包被多聚赖氨酸（35ml 多聚赖氨酸，35ml PBS,280ml ddH2O)，双蒸水冲洗，干燥。

用微阵列仪点样，每种样品放5nl，用介层连接确定其互补序列。

制备方法：可改装一台半导体光印刷仪，采用光导向结合化学原理合成各种寡核苷酸探针。

1.玻璃片清洗后包被一层多聚赖氨酸。

2.在玻璃片上每个一定间距连接上带有光不稳定保护基的羟基。

3.UV照射，通过光印刷仪的遮盖膜使UV只穿过特定微孔射向玻璃片，将孔下的光不稳定保护基除去，产生自由羟基。

4.加入5’端带光不稳定保护基的磷酰胺碱基与自由羟基连接。

5.使遮盖膜微孔对准邻侧另一光不稳定保护基，重复4.5.依次有序进行，第一层碱基连接完毕后再进行第二层第三层.......。