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基因工程总结一．概念(1)原理：。
(2)优点：与杂交育种相比，；与诱变育种相比，。
（3）基因工程成功的原因：①成功拼接的原因：②成功表达的原因：二．基本工具1、两种酶：(1)：作用特点：。
(2)：E ·coli DNA 连接酶与T 4 DNA 连接酶的区别：2、一种运载体（1）条件：①；②；③具有特殊的标记基因（作用：）（2）种类：最常用；其他动植物病毒、三、操作程序(1)：方法：①：不知道脱氧核苷酸序列②：已知目的基因两端一小段序列，便于③利用化学方法人工合成：知道全部序列，且基因比较小。
这种方法不需要模板。
(2)——基因工程的核心基因表达载体的组成：(3)生物种类常用方法受体细胞将目的基因插入到Ti 植物动物受精卵将含有目的基因的表＋微生物原核细胞Ca 2处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA 分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 分子质粒的T-DNA 上→农达载体提纯→取卵转化过程杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得色体的DNA 上→表达具有新性状的动物(4)①目的基因是否插入到转基因生物的染色体DNA 上：②是否转录：③是否翻译：④个体水平鉴定：抗虫、抗病接种实验易错点说明：1、切割目的基因和运载体的要求：用限制酶。
目的是：。
同种的含义是：同一种或相同两种，即单酶切或双酶切。
选择双酶切的原因是。
2、工具≠工具酶；运载体≠质粒。
3、启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
启动子：。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
4、基因探针的要求：①单链②有③5、农杆菌转化法中的“2”次导入：第一次：将含有目的基因的T—DNA的质粒导入农杆菌；第二次（非人工操作）：将含有目的基因的T—DNA导入受体细胞并整合到植物细胞的染色体DNA上。
6、转化：。
绪论1.理论上的三大发现：（1）1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出 DNA是遗传信息的载体。
（2）1953年，美国科学家Watson 和英国科学家Crick提出 DNA Double Helix model。
1958年，Meselson 和Stahl证明 DNA半保留复制。
（3）1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能而分享诺贝尔生理医学奖。
2.技术上的三大发现:（1）限制性核酸内切酶的发现（1962年Arber ）（2）DNA连接酶的发现（1967Gellert）（3）基因工程载体的发现3.基因工程研究的内容：(1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。
(2)在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。
(3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。
(4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。
(5)从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。
(6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析；(7)将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
第二章基因克隆所需的工具酶一、限制性内切酶1．限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA 对生物细胞的入侵受到限制修饰作用：生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。
2．核酸内切限制酶的类型：I型、II型、III型3．核酸内切限制酶的命名法由H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性：a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂；b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；c.??? 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。
第一章一．名词解释1、基因工程:按工程学原理,将外源基因切割,与载体结合，导入受体细胞,使其稳定表达的过程.2、目的基因：开发人们特殊需要的基因产物或与优良性状相关的基因。
3、工具酶：体外进行DNA合成、切割、连接、修饰等过程需要的酶。
4、DNA药物：在受体细胞内表达产物有药理作用或通过定位整合直接抑制致病基因的DNA。
二．基因工程理论依据（1)基因具有相同的物质基础(2)基因可以切割（3）基因可以转移（4）基因与多肽有对应关系(5）基因的密码是通用的（6）基因可以通过复制遗传给下一代三．基因工程研究内容（1）克隆载体的研究（2)受体的研究（3）工具酶的研究（4）目的基因的研究（5）新技术的研究第二章一．名词解释1、DNA变性：DNA在较高温下，双链间氢键断开，形成单链DNA的过程。
2、DNA复性：变性的DNA，降温时恢复为双链DNA的过程。
3、解链温度:让DNA达到50%变性的温度.4、复制子:从复制起点开始复制出一个DNA分子或片段的核苷酸序列。
5、启动子：不转录RNA，是RNA聚合酶的识别结合位点.6、转录区:能转录相应RNA,包括编码区和终止子。
7、操纵子：原核生物中两个以上基共用一个启动子。
8、内含子:真核生物转录区中的非编码间隔序列.9、限制性核酸内切酶:使一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。
10、稀切酶：有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制性核酸内切酶。
11、同裂酶:不同的酶有相同的识别序列。
12、同尾酶：切割不同识别序列产生相同末端的不同酶。
13、黏性末端：两条链断开位置是交错的，叫黏性末端。
14、平末端：两条链断开位置是平齐的,叫平末端。
15、位点偏爱:某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。
16、酶活单位：限制酶最适条件下60分钟切割1ugDNA所需的酶活性.17、容积活性：1ul酶活单位所具有的酶活性。
第3章基因工程1、什么是基因工程：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程的诞生（三个理论和三个技术）：基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程，具体有三大理论发现和三个技术突破。
1)理论基础：DNA是遗传物质；DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式；2)技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；基因工程载体的构建与应用●理论上的三大发现⑴、发现了遗传物质——DNA1944年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎双球菌转化实验⑵、揭示了遗传物质的分子机制：DNA分子的双螺旋结构和半保留复制1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的DNA双螺旋结构模型、半保留复制图，获1958年诺贝尔奖。
⑶、确立了遗传信息的传递方式：以密码形式传递1963年，美国尼伦伯格（M.W.Nirenberg）和马太（H.Matthaei）确立了遗传信息以密码形式传递，破译了编码氨基酸的遗传密码(3个核苷酸=1个密码子=1个aa)。
●技术上的三大突破⑴、世界上第一个重组DNA实验：实现不同来源DNA的体外重组1972年斯坦福大学化学家伯格（P.Berg）借助内切酶和连接酶将猴病毒SV40的DNA 和大肠杆菌λ噬菌体的DNA在试管中连接在了一起，第一次成功地实现了DNA的体外重组。
⑵、第一个基因克隆实验：重组DNA表达实验，是世界上第一个基因工程实验1973年美国斯坦福大学医学院遗传学家科恩（S.Cohen）将体外构建的含有四环素和卡那霉素抗性基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得了具有双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。
基因工程知识点总结基因工程，这个在现代生物学中熠熠生辉的领域，正以惊人的速度改变着我们的生活和对生命的认知。
它就像是一把神奇的钥匙，开启了无数未知的大门，为解决人类面临的诸多问题带来了前所未有的希望和可能。
一、基因工程的定义与基本原理基因工程，简单来说，就是按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外进行切割、拼接和重组，然后导入另一种生物的细胞内，使之稳定遗传并表达出相应产物的技术。
其基本原理基于三个重要的步骤：首先是获取目的基因，这就像是在茫茫基因海洋中找到我们想要的那一颗珍珠；其次是构建基因表达载体，相当于给这颗珍珠打造一个合适的盒子，使其能够安全、有效地传递；最后是将重组 DNA 分子导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
二、获取目的基因的方法1、从基因文库中获取基因文库就像是一个巨大的基因仓库，里面存储着各种各样的基因。
我们可以根据已知的信息，从这个文库中筛选出我们需要的目的基因。
2、利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 技术就像是一个基因的复印机，能够以极少量的基因片段为模板，快速大量地复制出我们想要的基因。
3、人工合成法如果已知目的基因的核苷酸序列，或者其氨基酸序列，我们可以通过化学方法直接人工合成目的基因。
三、基因表达载体的构建基因表达载体是基因工程的核心部分，它就像是一辆专门运输基因的列车，需要具备多个关键组件。
1、启动子启动子是基因表达的“开关”，它能够控制基因在何时何地开始表达。
2、终止子终止子则是基因表达的“刹车”，告诉基因在何处停止表达。
3、标记基因标记基因就像是一个个小标签，帮助我们筛选出成功导入目的基因的受体细胞。
4、目的基因这是我们最终想要表达的基因片段。
四、将目的基因导入受体细胞1、导入植物细胞（1）农杆菌转化法农杆菌就像是一个天然的基因运输工具，能够将其携带的基因转移到植物细胞中。
（2）基因枪法通过高速的微粒将目的基因直接打入植物细胞。
（3）花粉管通道法利用花粉管通道将目的基因导入植物的受精卵中。
二、简答题1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号. 基本原则: 3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号; 首字母: 取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母: 取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母: (1)取种名的第二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母: 若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体. 顺序号: 若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正体.2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。
条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。
概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。
3、影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？答：（1）DNA的纯度（2）DNA甲基化的程度（3）酶切消化反应的温度（4）DNA的分子结构（5）核酸内切限制酶的缓冲液4、什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。
基因工程复习资料一、知识点1.根据基因工程的定义，能替代基因工程的术语。
2. 含有II型限制性内切酶切位点的DNA 片段的特点。
3.已知一双链DNA分子，分别用限制酶Ⅰ、限制酶Ⅱ切割单独切割得到不同片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到另外的片段，据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况。
4．质粒分子生物学的描述。
5．在植物基因工程中广泛使用的载体。
6．质粒带有α互补的 lacZ'标记基因，那筛选培养基中加入显色底物和诱导物分别为？7．载体常用的选择性标记：抗生素、生化标记、营养缺陷型标记的包括哪些（要能区分缩写符号）。
8．DNA双链是靠什么化学键维持？9．能有效区分重组子与非重组子的是方法有哪些？10．离体cDNA 合成中所涉及的工具酶是有哪些？11．强化基因转录的元件是哪些？12．基因调控元件中属于负调控顺式作用元件的是哪些？13．关于包涵体的叙述。
14. 在单子叶、双子叶植物及动物的遗传转化过程中，应用最成功的间接转化法分别是什么15. 在对转基因植物进行分子鉴定时，检测外源基因的整合、表达、转录，分别可以采用哪些方法？16．细菌存在限制-修饰的现象，其生理意义是什么？17．Taq DNA 聚合酶的发现使得 PCR 技术的广泛运用成为可能，是利用其哪个特点？18．关于柯斯质粒（cosmid）描述。
19．Cosmid、 -DNA 、 Plasmid几种常用载体的装载量大小比较20．载体质粒 pBR322上的两个选择性标记： Ap r、 Tc r。
它们分别含有一个单一酶切位点： Pst I 、 Sph I。
若将一外源基因插入Ap r中的Pst I位点，那么转化子和重组子如何筛选，若插入Sph I又如何筛选？21．DNA-DNA,DNA-RNA分子杂交的化学原理是什么（靠什么维持其双链稳定性）？22．cDNA 法获得目的基因的特点表现为？23．原核生物启动子的特征是有哪些？24．强化 mRNA 翻译的元件是哪些？25．高等哺乳类动物基因在大肠杆菌中高效表达时，包涵体形成的原因是？26.动物基因转移法中的胚胎干细胞法有何特点？（）27. 如何正确理解基因漂移？28.熟悉pBR322、pUC18/19载体的组成元件及作用、简写所代表的含义。
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
基因工程高三知识点基因工程是现代生物学中的一项重要技术，通过改变生物体的遗传物质（DNA）来创造新的基因组合或改变生物体的性状。
在高中生物学课程中，学生需要掌握基因工程的基本原理、应用以及相关的伦理和社会问题。
以下是基因工程的一些高三知识点。
一、基因工程的基本原理基因工程是利用DNA技术改变生物体的遗传信息，主要包括以下几个步骤：1. DNA提取：从感兴趣的生物体中提取DNA，通常使用PCR 技术扩增目标DNA片段。
2. DNA剪切：利用限制酶切割目标DNA，产生特定的切口。
3. DNA连接：将DNA片段连接到载体DNA上，形成重组DNA。
4. DNA转化：将重组DNA导入目标细胞中，使其具有新的遗传特性。
5. PCR扩增：使用聚合酶链反应扩增目标DNA的数量。
二、基因工程的应用领域1. 农业领域：基因工程可以用于改良作物，包括提高抗病虫害能力、增加产量、提高品质等。
2. 医学领域：基因工程可以用于制备重组蛋白药物，如胰岛素、生长激素等。
3. 环境领域：基因工程可以用于环境修复，包括通过基因修复技术降解污染物。
4. 科研领域：基因工程可以用于基因功能研究、疾病模型建立等。
三、基因工程的风险与伦理问题1. 生物安全风险：基因工程可能导致基因剥离和转基因生物的释放，风险包括基因污染、基因流动等。
2. 伦理问题：基因工程涉及到修改生物的基因组，可能引发对自然与人类的伦理关切，如人类基因改造、人类克隆等。
四、国际和国内基因工程的监管措施1. 国际监管：1992年生物安全议定书规定，转基因生物的跨国转运需要进行风险评估和合格证明。
2. 国内监管：我国设立了生物安全管理委员会，建立了转基因食品的安全管理体系。
五、基因工程的前景与挑战基因工程作为一种重要的生物技术，将会继续在农业、医学、环境等领域发挥重要作用。
但同时也面临着风险与挑战，需要加强监管、推动科学研究和公众教育。
总结：基因工程作为现代生物学的重要分支，已经在农业、医学、环境等领域取得了巨大的进展和应用。
基因工程期末复习第一章：基因工程1. 定义：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动称为基因工程。
2. 基因工程研究的主要内容或步骤：基因克隆的通用策略：涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴。
①从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；②在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；④从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；⑤从筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
3.三大元件：载体、质粒、片段。
第二章：分子克隆工具酶1、工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA修饰酶、核酸外切酶、单链核酸内切酶。
2、限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。
三种（Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶）3、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA 不被相应的限制酶所切割。
三种（）4、回文结构：双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，每条单链以任一方向阅读时都是一样的。
5、同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。
同裂酶可能进行同样的切割，产生同样的末端。
但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。
6、同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。
利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。
7、影响核酸内切酶活性的因素：①DNA浓度②DNA的甲基化程度③酶切消化反应的温度（大多数酶的标准反应温度37度）④DNA的分子结构。
一名词解释：1基因：是遗传信息的基本单位，携带着某种蛋白质或RNA的遗传信息。
从化学本质上看，基因是一段携带特定遗传信息的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列，是构成巨大遗传单位染色体的组成部分。
2基因工程：按照人们的愿望，进行严密的设计，利用体外DNA重组和转基因等生物技术，有目的地改造生物性状使之具有满足人们特定需求的能力。
最突出的优点：打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，使不同的物种之间可以进行遗传信息的重组和转移。
3 Tm：熔点温度或者解链温度，是DNA变性进行到一半时的温度4同裂酶：有时，一些限制性内切酶虽然来源不同，但是识别序列相同，这样的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。
此种酶切割位点可同可不同。
5 PCR技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，即聚合酶链式反应技术。
（已知的短片段1kb以内）6质粒不相容性：不同质粒有的可共存于同一细胞中，但有的不行。
不能同寓于一个细胞中的不同质粒称为不相容性质粒。
7转录单元：始于启动子，止于终止子，中间是一段转录区，转录为单链RNA的一段序列8杂种位点：hybrid site：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。
一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
9基因表达：基因通过DNA的转录和RNA的转译等过程，将其所携带的遗传信息转变成蛋白质(或RNA转录本)的过程。
10基因组文库：某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆数足够大以覆盖每一个基因。
11 ORF：开放阅读框，以起始密码子开始终止密码子结束的一串三联体核苷酸序列。
起始密码子：ATG终止密码子：TAA TAC TGA12克隆：动词：是指从一个共同祖先经无性繁殖得到的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊生命群体；名词：指从同一个祖先产生这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程。
13蛋白质印迹杂交技术：将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
14同尾酶：isocaudamer指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。
利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。
二选择题：1焦磷酸测序中没用到以下什么酶；（dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶都有）2克隆基因常用强效载体，哪种不适用于大肠杆菌，选Gal；3质粒克隆载体非必需元件，选融合标签；4外源基因在下列哪种中表达最完善（哺乳动物细胞）；5一个完整的转录单位不包括（复制起始位点）。
三简答题：1简要勾勒一副原核表达载体图。
（重点是要包括原核表达载体的６个要素：启动子、核糖体结合位点、多克隆位点、转录终止子、抗性筛选基因、复制起始点。
）2以EcoR I为例说明限制性核酸内切酶的命名原则：一般以提取这类酶的生物属名头一个字母和种名的头两个字母以及菌株（型）的代号来命名。
第一个字母：大写并斜写，表示所来自微生物的属名的第一个字母。
第二、三字母：小写并斜写，表示所来自微生物种名的第一、二个字母。
其它字母：大写或小写，表示所来自微生物的菌株号；罗马数字：表示在该菌株发现的限制酶的编号。
例：EcoR I: 来自于Escheria coliRY13的第一种限制酶。
3.简述α-互补法筛选重组克隆子的原理：噬菌体载体的基因间隔区插入E.coli的一段调节基因及lac Z的N端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物为β—半乳糖苷酶的α片段。
突变型lac - E.coli 可表达该酶的W片段（酶的C端）。
单独存在的α及W片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有β半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物。
4.简要比较大肠杆菌表达系统和几种常用的真核细胞表达系统的优缺点：1.大肠杆菌：最早用于表达外源基因的宿主细胞优点：具有遗传背景清楚、操作简单、表达效率高、易于纯化等优点；缺点：缺乏折叠复性系统、无翻译后加工和修饰系统、内源蛋白酶作用。
2.哺乳动物细胞和昆虫细胞：优点：能够正确折叠、翻译后加工和修饰系统完善，能够表达各种哺乳类细胞蛋白；缺点：这些表达系统往往操作比较复杂，表达水平低，不易推广使用。
3.酵母细胞优点：作为单细胞生物，能够像细菌一样在廉价的培养基上快速生长，能方便地操作外源基因。
能对翻译的蛋白进行加工和修饰，如二硫键的正确形成、前体蛋白的水解加工，表达产物与天然蛋白相同或相似。
可将外源基因与N-末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽的分泌，并对分泌蛋白进行糖基化修饰。
可采用MOX、AOX、lac 4等高表达的强启动子，并可诱导表达。
可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题。
缺点及改进措施：表达外源基因时，遗传和翻译的稳定性常受影响，如点突变，可通过高拷贝基因来解决。
翻译产物不稳定，可利用液泡蛋白酶缺陷型来解决。
选择翻译后具有修饰能力的酵母以及合适的载体。
分泌表达时前导肽去除不够完全，可加入间隔序列肽。
糖基化以甘露糖型为主，而且易过度糖基化，可改变宿主糖基化背景。
5.简述用于基因工程中DNA分子改造的四类工具酶及其作用，并举例说明：1.核酸酶：通过断裂相邻DNA链核苷酸之间的磷酸二酯键而降解DNA分子。
切割、缩短、或降解核酸分子，有核酸外切酶和核酸内切酶2.连接酶：催化相邻核苷酸的游离5'-磷酸基团和3'-羟基形成二酯键的酶。
连接核酸分子3.聚合酶：催化以核酸链为模板合成新核酸链的酶。
包括DNA聚合酶和RNA聚合酶。
复制核酸分子4.修饰酶：能催化稀有碱基参入RNA或DNA，或对原有碱基进行修饰的酶，以防止限制性内切酶的破坏。
去除或添加化学基团6.重组克隆载体构建策略：目的基因片段被插入到载体中，生成一个嵌合体或称作重组DNA 分子；载体作为一个运输工具将目的基因转运到一个宿主细胞中；在宿主细胞中载体复制产生大量同一拷贝，同时也使目的基因得到扩增；宿主细胞增殖时，重组DNA分子的拷贝转移到子细胞中，随着载体进行进一步复制；细胞多次分裂后，一个由相同细胞组成的细胞群体，或称作一个克隆被生产出来，每一个细胞都包含一个或多个重组DNA分子的拷贝，此时重组分子所携带的目的基因就被克隆了。
7.基因工程技术路线：通过基因文库筛选、PCR扩增或人工化学合成等手段获得目的基因；构建所需基因载体；目的基因与载体在体外重组后导入受体细胞，进行增值或表达等。
基因工程一般包括四个步骤，也即技术路线：一、取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二、构建基因的表达载体；三、将目的基因导入受体细胞；四、目的基因的检测与鉴定。
8.cdna文库的建立：cDNA文库是指某生物某一特定的发育时期、特定的组织或器官所转录的mRNA形成的cDNA片段与载体连接而形成的克隆的集合。
cDNA文库是有时效性的，cDNA 文库只反映mRNA的分子结构。
文库构建基本程序：①分离提取含有目的基因的组织细胞的总RNA或者总mRNA；②cDNA的第一链的合成；③cDNA的第二链的合成；④将cDNA双链重组到载体上9简述链终止法测序原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将长度上相差一个核苷酸碱基的单链DNA分子相互分离开来。
10简述PCR产物克隆过程：①特殊的克隆载体（T载体）；②设计含限制性酶切位点的引物。
四论述题：1.根据自己所掌握的基因工程方面的知识，谈谈IPTG诱导目的基因在pET载体表达系统中高效表达的原理：1)噬菌体DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)是最常用的表达菌株，噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导蛋白的表达方式与lac启动子一样都是iptg诱导。
2)表达菌株BL21(DE3)上带有lacI基因，T7 RNA 聚合酶编码基因以及lacUV5启动子，lacUV5启动子可以启动T7 RNA 聚合酶的表达;3)表达质粒如pET-28质粒带有T7启动子和编码阻遏蛋白lacI的基因，在插入目的基因后，lacI是失活的;4)在非诱导条件下，表达菌株中表达出的lacI阻遏蛋白可以作用于T7 RNA 聚合酶前的lacUV5启动子，从而抑制T7 RNA 聚合酶的表达。
IPTG是乳糖类似物，可以与阻遏蛋白lacI 结合，使其对lacUV5启动子失去阻遏作用，T7 RNA 聚合酶得以合成，继而与pET-28质粒上的T7启动子结合，启动下游基因包括目的基因的表达，从而产生目的蛋白。
2.pcr产物的克隆方法：黏性末端连接，将PCR产物回收后，利用引物中附加在5’端的限制酶切位点，可直接用相应的限制性内切核酸酶酶切后产生黏性末端，与载体连接，产生重组DNA；产物尾部加dT或ddT，Taq DNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。
利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个ddTTP,而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH 连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复；平末端连接，由于TaqDNA聚合酶能在PCR产物3’端加上非模板依赖的多余碱基，因此可用T4DNA聚合酶处理补平末端，然后用平末端连接克隆PCR产物。
3.题目很长。
主要就是设计实验方案，包括整套基因工程的具体流程到最后在dna、rna、蛋白质水平鉴定表达产物和产物活性的鉴定：基因工程基本操作：目的基因的获取（从基因文库，利用PCR技术，人工合成），基因表达载体的构建（目的基因，启动子，终止子，标记基因），将目的基因导入受体细胞（显微注射法，基因枪法，农杆菌转化法），目的基因的检测与鉴定（分子水平的检测——目的基因是否插入，转录，翻译，个体水平的检测）1PCR实验的基本步骤：模板DNA变性：反应混合物加热到94 ℃，双链DNA分子解链；引物退火：变性后，将温度降低到55℃左右，从而使引物模板DNA特异性互补配对；延伸：升温到72 ℃，Taq DNA聚合酶结合到引物3’端，合成与模板DNA互补的新链。
重复循环。
2为什么基因克隆和PCR如此重要：这两种技术都能够将目的基因从细胞的所有其他基因中分离出来，获得纯的单一基因样品。
3PCR与基因克隆技术的比较：一个PCR可以在数小时内完成一个基因克隆可能要花几周甚至几个月因而，PCR技术比基因克隆要方便快捷的多。
