羊膜为载体体外重建角膜上皮层和内皮层的实验研究

羊膜为载体体外重建角膜上皮层及内皮层的实验研究羊膜为载体体外重建角膜上皮层及内皮层的实验研究摘要关键诃：羊膜角膜上皮角膜内皮体外培养组织工程ｆ严重的眼表疾病及内皮病变所致角膜混浊是致盲的主要原因之一。

对角膜盲的治疗一直是眼科临床上的难点，目前的主要治疗方法——异体角膜移植面临着移植材料来源匮乏及免疫排斥反应两大难题，因而限制了它的临床应用。

而对于眼表重建和内皮失代偿等病变进行体外培养的细胞移植为治疗角膜混浊开辟一条崭新的途径，已成为目前研究的热点。

）广了本实验采用组织工程技术的原理和方法，探讨以人羊膜为载体支架种植角膜上皮和内皮细胞，通过体外培养形成角膜上皮层及内皮层的方法，为体外构建角膜上皮层和内皮层组织植片提供重要的理论依据和技术经验。

目的建立角膜缘上皮细胞及角膜内皮细胞体外分离培养方法，应用组织工程技术以羊膜为载体体外构建角膜上皮层及内皮层，为单层角膜组织移植的临床应用奠定基础。

／材料和方法ｆ。

联合应用酶消化和组织块贴壁法，获取纯度高、活力好的原代角膜上皮及内皮细胞，根据不同细胞生长的需要选择不同的条件，体外培养扩增，并对其形态学、免疫细胞化学和细胞生长代谢动态变化的一般规律进行观察。

用胰酶和ＥＤＴＡ（Ｌ－－胺四乙酸）混合液消化处理，去除羊膜的上皮细胞而保留其基底膜作为培养载体，分别以组织块法种植兔角膜缘上皮细羊膜为载体体外重建角膜上皮层及内皮层的实验研究羹文曩曩ＴｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｉｌｒｅｅｏｎｓｔｒｕｅｔｉｏｎｏｆｃｏｒｎｅａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｏｆｆｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｏｆａｍｎｉｏｔｉｅｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｖｉｔｒｏＡｂｓｔｒａｅｔ【Ｋｅｙｗｏｒｄｓｌａｍｎｉｏｎ；ｃｏｒｎｅａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ｃｏｒｎｅａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ；ｃｕｌｔｕｒｅ；ｉｎｖｉｔｒｏ；ｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏｒｎｅａｌｏｐａｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｃａｕｓｅｄｂｙｓｅｖｅｒｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｏｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｄｉｓｏｒｄｅｒｓｉｓａｍａｉｎｌｙｃａｕｓｅｏｆｂｌｉｎｄｎｅｓｓｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄ．ＴｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｏｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｏｆｃｏｒｎｅａｌｏｐａｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｓｖｅｒｙｄｉｆｆｉｃｕＲａｔｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄｔｈｅｍａｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄａｌｌｏｇｅｎｉｃｃｏｒｎｅａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｗｈｉｌｅｔｈｅｒａｒｅｄｏｎｏｒｇｒａｆｔｓａｎｄｉｍｍｕｎｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｏｌｍｉｏｎｉｓｃｕｌｔｕｒｉｎｇｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｏｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｉｎｖｉｔｒｏｆｏｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｈａｓｂｅｃｏｍｅａｎａｓｃｅｎｔａｎｄｖｅｒｙｐｒｏｍｉｓｉｎｇｍｅｔｈｏｄａｔｐｒｅｓｅｎｔ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｔｈｅｏｒｙａｎｄｍｅｔｈｏｄｏｆｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｒａｂｂｉｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎｔｈｅａｍｎｉｏｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅｔｏｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｃｏｍｅａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｉｎｖｉｔｒｏ．ａｉｍｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｂａｓｉｓｆｏｒｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＣＯｍｅａｌｔｉｓｓｕｅｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ｏｂｊｅｅｔｉｖｅＴｏｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｉｎｖｉｔｒｏｂｙｃｕｌｔｕｒｉｎｇｌｉｍｂａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓａｎｄｃｏｒｎｅａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｎｔｈｅａｃｅｌｌｕｌａｒａｍｎｉｏｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ，ｗｈｉｃｈｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒｆｕｒｏｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＭａｔｅｒｉａｌｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓＰｕｒｅｐｒｉｍａｒｙｅｐｈｈｅｌｉａｌａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｗｉｔｈｈｉｇｈｖｉｔａｌｉｔｙｗｅｒｅｈａｒｖｅｓｔｅｄｂｙｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｅｘｐｅｎｄｅｄａｎｄｔｈｅｎｅｘａｍｉｎｅｄｉｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅａｎｄｈｎｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｃｕｌｔｕｒｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍａｍｎｉｏｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅｂｙｒｅｍｏｖｉｎｇｏｆｉｔｓｏｗｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ｌｉｍｂａｌｔｉｓｓｕｅｓｏｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｅｅｄｅｄｏｎｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ｔｈｅｎｃｏｍｐｏｓｉｔｅｃｏｒｎｅａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏ，ｔｈｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｉｎｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，羊麒为戴体体外重建角膜上皮层及内皮层的实验研究ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｒｅｓｕｉｔｓ１．Ｐｒｉｍａｒｙｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｂｅｃａｍｅｃｏｎｆｌｕｅｎ“ｉｎ４～５ｄａｙｓ。

ｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅＣａｎｂｅｐｏｌｙｇｏｎａｌａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｉｇｈｔｌｙ，ｗｈｉｃｈｌｏｏｋｅｄｌｉｋｅｐａｖｅｓｔｏｎｅ，ｃｅｌｌｓｅｘｐｅｎｄｅｄｔｏ６～７ｐａｓｓａｇｅｓ．ＬｉｍｂａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｇｒｅｗｔＯｂｅｃｏｎｆｌｕｅｎｔｉｎａｗｅｅｋ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｏｌｙｇｏｎａｌａｎｄａｒｒａｎｇｅｄｉｒｒｅｇｕｌａｒｌｙ，ｔｈｅｖｉｔａｌｉｔｙｏｆｃｅｌｌｓｄｅｃｒｅａｓｅｄａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｃｈａｎｇｅｄｗｈｅｎｔｈｅｙｗｅｒｅｐａｓｓａｇｅｄｔｏ３－－４ｐａｓｓａｇｅｓ．ＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｓｈｏｗｅｄｐｏｓｉｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｆｏｒｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎＫ３．２．Ｔｈｅａｎｍｉｏｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｖｅｄｔｏｂｅｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｒｅｍｏｖｅｄｏｆｉｔｓｍｅｍｂｒａｎｅｂｙｏｒｉｇｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｗｉｔｈｏｕｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄａｍａｇｅｔｏｔｈｅｂａｓｅｍｅｎｔｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ目ｄａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｓｃａｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＳＥＭ）、３．Ｃｏｒｎｅａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｃａｎｂｅｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄｏｎｔｈｅａｍｎｉｏｆｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ．３－４ｌａｙｅｒｓｏｆｓｔｒａｔｉｆｉｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｗｅｒｅｆｏｒｍｅｄａｆｔｅｒｔ０ｄａｙｓ，ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｔｉｓｓｕｅｐｒｏｖｅｄｔｏｒｅｓｅｍｂｌｅｔｈｅｎｏｒｍａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｌａｙｅｒ．４．ＣｏｒｎｅａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｃａｎａｌＳＯ簟ＯＷａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｏｎｔｈｅａｍｎｉｏｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｔｈｅｃｏｍｐｏｓｉｔｅｔｉｓｓｕｅｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆ也ｅｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｔｈｅｍｏｎｏｌａｙｅｒｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｏｎｅｗｅｅｋ’Ｓｃｕｌｔｕｒｅ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｅｄｔｏｒｅｓｅｍｂｌｅｔｈｅｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓｉｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｃｏｎｅｌｕｓｉｏｎｓ１．Ｄｉｆｉｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏｓｅｐａｒａｔｅａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｃｏｒｎｅａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｉｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｃｅｌｌｓＣａｎｂｅｓｅｒｉａｌｌｙｓｕｂｃｕｌｔｉｖａｔｅｄａｎｄａｍｐｌｉｆｉｅｄ．２．Ｔｈｅａｃｅｌｌｕａｒａｍｎｉｏｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅｍａｄｅｂｙｒｅｍｏｖｉｎｇｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍａｐｐｅａｒｓｔｏｂｅａｎｅｘｃｅｌｌｅｎｔｓｕｂｓｔｒａｔｅｆｏｒｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｃｏｒｎｅａｌａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｉｌｓ．ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ３．ＴｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｃｏｒｎｅａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍＣａｌｌｂｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｖｉｔｒｏｂｙｃｕｌｔｕｒｉｎｇｌｉｍｂａｌｔＩＳＳＵｅＳａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｎａｍｎｉｏｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ。

ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓｑｕａｌｉｔｙｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｆｕｔｕｒｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．羊膜为载体体外重建角膜上皮层及内皮层的宴验研究芷文引言角膜是外界光线进入眼内的第一道窗口，严重的角膜疾病所致角膜混浊是当今世界致盲的主要原因之一。

其中角膜炎症、热化学烧伤、复发性翼状胬内等严重眼表疾病和大泡性角膜病变、内眼手术所致角膜内皮失代偿、Ｆｕｃｈ’ｓ角膜变性等则是导致角膜混浊的主要原因。

角膜混浊的治疗一直是牺床上的难题，角膜移植是治疗角膜混浊、恢复角膜透明的最有效方法。

目前主要应用的角膜移植为：同种异体角膜移植，异种角膜移植，人工角膜移植，自体角膜组织移植和体外培养细胞移植。

异种角膜移植和人工角膜移植，存在着严重的免疫排斥反应，移植物不能永久的替代角膜功能，最后被排出体外。

同种异体角膜移植是目前最常用的治疗方法，但仍然面临移植材料来源匮乏及免疫排斥两大难题，限制了它的ｌ｜盏床应用。

自体角膜组织移植对于双眼伤患者不适用，并且大量取材健眼会造成健眼损伤和视力下降。

而对于上皮或内皮疾病行体外培养的细胞移植因无合适的载体大多以失败告终。

近年来，组织工程技术的兴起和发展为解决这个难题带来了希望，为治疗角膜病开辟了一条崭新的途径。

组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理，研究开发修复与改善损伤组织结构和功能的生物替代物的一门科学。

其基本方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体降解吸收的生物材料支架，植入机体组织和器官缺损部位，在支架材料逐渐降解吸收过程中。

细胞继续增殖并分泌基质，最终形成相应组织，达到修复组织缺损，重建功能的目的。