纸层析的实验报告

纸层析的实验报告纸色谱实验报告2021第1部分：用纸色谱法分离氨基酸的实验报告前言纸色谱纸色谱又称纸色谱，是目前应用广泛的分离技术。

本世纪初，俄罗斯植物学家茨维特发现并利用这一技术证明植物的叶子不仅含有叶绿素，还含有其他色素。

现在色谱已经成为生物化学、分子生物学等学科中有效的分离分析工具之一。

它是一种以纸为载体的色谱。

固定相一般是吸附在纸纤维上的水，流动相是不溶于水的有机溶剂。

纸张还可以吸附其他物质作为固定相，如缓冲液、甲酰胺等。

将样品点在纸条的一端，然后用合适的溶剂将其涂在密封的容器中。

当组件移动一定距离时，每个组件的移动距离是不同的，最终形成分离的点。

取出纸张，待溶剂挥发后，用显色剂或其他合适的方法确定专色位置。

根据与已知样品的元件移动距离(Rf值)，进行定性分析。

使用点扫描仪或去除组分，用溶剂溶解组分，并用适当的方法(如分光光度法和比色法)进行定量。

纸色谱是生物化学中分离和鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质氨基酸组分的定性鉴定和定量测定。

它也是一种分离和分析工具，用于肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素和其他物质的定性或定量测定。

纸色谱使用过滤在以纸为惰性载体的分配色谱中，吸附在滤纸纤维素上的水为固定相，用于铺展的有机溶剂为流动相。

在环境分析和测试中，纸色谱有时用于分离样品成分，用于一些低精度分析，如3，4-苯并芘。

但是没有GC和HPLC普及。

在用于叶绿体色素分离，将叶片粉碎，滤出绿色液体，液体与层析液(石油醚)混合，滤纸逐一进入混合液。

四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下四条色素带。

由此可以找出各种颜料的相对含量和种类。

纸色谱法通常用于叶绿体中色素的分离。

叶绿体中的色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b，它们在色谱溶液中的溶解度不同。

大颜料的溶解度在带有色谱溶液的滤纸上迅速扩散，反之亦然。

颜料含量越高，颜料带越宽。

最后在滤纸上留下四条色素带，这样用纸层析就可以清晰地分离叶绿体中的色素。

氨基酸是蛋白质的基本单位，广泛应用于食品、医药、添加剂和化妆品行业。

随着生物工程技术产业的发展，它已逐渐成为21世纪世界主要产业之一。

对氨基酸的需求越来越大，品种变化越来越快，工艺改革越来越新。

目前世界氨基酸年产量100万吨，总需求800万吨。

自20世纪60年代以来，氨基酸在我国食品工业中的应用占61%，在饮料工业中占30%。

氨基酸在医药、日化、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术中的比重逐年上升。

氨基酸用于人类生活的许多方面：(1)食品工业中的应用(2)在制药工业中的应用(3)在饲料添加剂行业的应用(4)在化妆品行业的应用(5)在农业中的应用(6)在其他行业的应用氨基酸行业发展前景广阔：(1)传统的氨基酸生产方法(2)利用基因工程生产氨基酸(3)大力发展医药中间体，具体包括：氨基酸及其衍生物逐渐成为医药中间体非天然氨基酸是合成活性药物的重要原料生产高附加值的非天然氨基酸一、实验目的(1)硕士(1)纸色谱是以滤纸为惰性载体的分配色谱。

滤纸纤维上的羟基是亲水性的，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。

当有机相流经固定相时，物质连续分布在两相之间并被分离。

(2)溶质在滤纸上的移动速度用比移动值Rf表示。

(3)Rf=从原点到色谱斑点中心的距离/从原点到溶剂前沿的距离。

(4)物质的射频值在一定条件下是恒定的。

Rf值与物质的结构和性质、溶剂体系、色谱滤纸的质量和色谱温度有关。

在这个实验中，纸层析被用来分离氨基酸。

材料和方法三.实验设备和试剂(1)氨基酸标准溶液(1毫克/毫升)亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准溶液。

(2)80%甲醇(3)0.1%茚三酮丙酮溶液(4)氨基酸混合物(每种氨基酸500毫克/毫升)(5)正丁醇实验室仪器(1)新华滤纸 1(2)培养皿1(3)电吹风干燥箱1(4)吹风机1(5)毛细管4(6)针、线、尺 1(7)钟罩(高约430mm，直径约290mm，带研磨塞)1实验操作(1)滤纸选用国产新华一号滤纸，6cm7cm。

在距离滤纸2厘米处划线，并使用铅笔在直线上标记四个点作为采样位置(留下缝合空间)。

(2)取样取样应适当，样品过厚，斑点容易扩散或拉长，导致分离不清。

用毛细管吸取氨基酸样品，在与滤纸垂直的方向轻轻触碰样品斑点中心，样品就会自动流出。

样品的扩散直径应控制在0.5厘米以内。

在取样过程中，第二滴必须在第一滴之后干燥。

为了加速样品的干燥，可以用吹风机干燥，但温度不能太高，以免损伤氨基酸，影响定量结果。

滤纸两面与样品对齐，用线缝合，揉成筒状。

小心不要在接缝处碰到纸的两面。

避免溶剂由于毛细现象而沿两侧快速移动，导致溶剂前沿不均匀，影响Rf值。

(3)铺展层将圆柱形滤纸放入培养皿中(注意滤纸不要接触皿壁)。

当溶剂扩散到距离纸张上缘1cm左右时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂的正面位置。

酸性溶剂系统：正丁醇：80%甲酸：水=15:2(体积比)，茚三酮2ml。

温度25，时间1h。

注意：所用的溶剂系统应是新制备的，并均匀摇动。

(4)色彩发展待开发层基本结束后, 置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。

（5）Rf值的计算篇二：氨基酸的薄层层析实验报告实验六纸层析法观察转氨基作用【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用09救援一班第三大组李岚宇 20xx222336室温：28°（一）实验目的：1、学习氨基酸纸层析的基本原理。

2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。

（二）实验原理：转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。

转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。

氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。

各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：α―酮戊二酸丙氨酸谷氨酸丙酮酸本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。

纸层析属于分配层析。

以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。

有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。

由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示： ALT物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。

（三）实验材料与仪器：试剂：1、0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。

2、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。

3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH7.4后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。

4 、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后，加磷酸盐缓冲液至100ml。

5、0.1mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。

6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。

7、层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。

仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。

（四）实验步骤:1、肝匀浆制备：取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液1.0 ml,迅速研成匀浆，用上述缓冲液4.5ml混匀备用。

2、酶促反应过程（1）取离心管两支，编号：1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0. 5ml。

把对照管放沸水浴中加热10分钟，取出冷却。

（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液1.5 ml,摇匀。

（3）37℃保温，30分钟后取出，保温完毕。

（4）把测定管放沸水浴中煮10分钟，取出后冷却，过滤。

3、层析（1）取圆形滤纸一张（直径9cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约1 cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。

（2）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。

把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。

把测定液、对照液分别点在原点1、3处。

注意斑点不宜过大（应在直径0.5cm以下）。

在第一次点样点干后，再在原处同样点第2次。

（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。

（4）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿盖。

可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。

当层析液前缘到离滤纸边缘约1cm时，约25分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。

（5）显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。

（五）实验结果记录：（六）实验讨论：1、从表格（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。

2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。

3、层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。

4、点样点不宜过大，直径小于0.5cm. 20xx年9月19日。