影响微生物限度检查及方法验证的因素分析

影响微生物限度检查及方法验证的因素分析微生物限度检查法及其方法验证的主要特点在于检验对象本身的特殊性。

其特殊性为：（1）能繁殖的活细胞生物。

该活细胞处于不稳定状态，可随存放时间延长而亡，也可在适宜条件下大量繁殖。

而检测条件的状况不一可使其生长情况各异，因而常出现同批样品在不同条件下检测，有不同的结果。

但在保存条件相对稳定时，微生物在一定时间内处于动态平衡，在标准化的条件下操作结果仍可予与正确评估。

（2）不确定性。

药品受微生物的污染，其种类可以多样，污染情况依生产、设备、原料、管理、剂型等条件而定，非药品本身固有。

被污染批次中的不合格品是一个随机变量。

（3）分布的不均匀性。

这种不均匀性源于污染源的复杂性，如原辅料污染，工艺污染，空间污染和操作人员污染。

再者，微生物具有簇团性，簇团大小，紧密程度是可遗传的，簇团的分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。

除了上述检验对象本身的特殊性外，微生物限度检查法及其方法验证程序繁琐，检验周期长，干扰因素多，容易造成检验结果误差，现将主要原因分析如下。

1 标准菌株的选择和保存不当引起的实验误差实验中的对照菌株必须为标准菌株，其生物学特性应典型稳定，其细胞群应具有相似性和合适的培养，储存条件。

如形态变异、菌落变异、耐药性变异或受损等均可使平板中细菌呈丛集、分散不均或死亡。

2005版药典[1]要求所用标准菌株的传代次数不得超过五代。

实验中所用对照菌均为无芽孢杆菌，以菌液状态存活的时间都不长。

有研究表明[2]，分别用0.9%无菌氯化钠溶液和氯化钠-蛋白胨缓冲液制备的不同浓度菌液，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌在3天内活菌数下降约40%，5天内下降约70%，用0.9%无菌氯化钠溶液和氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液结果无明显差异（冰箱4℃保藏）。

建议采用新鲜培养物。

2 不同供试液制备方法造成的实验误差应按供试品的理化特性与生物学特性采取适宜的方法制备供液，制备供试液时，力求均匀分散。

测定结果与匀质方式及条件极为有关。

如有菌，分散充分时菌落生长数多，反之则少。

通常药品都有一定的pH值，分散度不同导致供试液不同的pH值而影响微生物的生长，可得到不同的实验结果。

应按药典首选匀浆仪法，并注意转速和时间，确保制备均匀的供试液。

转速4000 r/min，时间2分钟。

试验证明[3]，对8批水丸分别用匀浆仪和振荡器处理后，测定细菌数，其结果后者比前者少一半，经统计学t检验分析，差异有显著性（P<0.05）。

大量实验表明[4]，供试液作递增稀释时，分别吸取混悬液与上清液测定细菌数，霉菌数时，计数结果相差显著，上清液明显低于混悬液。

复方丹参片，六味地黄丸和刺五加片在部分细匀时细菌数分别为7.2×103个/克，2.4×104个/克和2.1×102个/克，而当完全细匀时细菌数分别为1.4×104个/克，3.4×104个/克和1.2×103个/克，差异均有显著性。

如果药品有抑菌作用，则在检查及方法验证时影响更为突出。

分散不均匀，试验开始时取样既造成误差，含药量高使活菌检出量减少，阳性对照菌回收率降低。

这时检验结果的准确性主要取决于供试品本身在试验条件下是否抑制被检微生物的生长繁殖，有抑菌作用的检验结果是不准确的，应排出其抑菌活性。

3 培养基的影响培养基是培养检测微生物的营养物，其质量的好坏，稳定与否直接影响检验结果。

通过对电炉直火加热融化培养基及用剩余培养基包扎冷藏后融化再使用的阳性对照实验[5]，发现这两种操作对实验结果造成的误差达21%和18%。

多次反复加热培养基，可使其中糖、微生物和氨基酸受破坏，影响质量。

而pH值的改变影响更为严重，因各种微生物皆有其适宜生长繁殖的pH值。

霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH为中性或微碱性的注皿时温度应控制在45℃，过高细菌易受损或致死。

注皿量约15 ml，厚度约4 mm，薄水分易散失，不利于微生物生长，过厚需氧菌不利于生长。

一些选择性培养基加入胆盐作为抑菌剂，抑制革兰阳性菌，使革兰阴性菌能良好生长，但有试验发现[6]，胆盐用量过大对大肠埃希菌也有抑制作用，且当加菌量较大时，革兰阳性菌也能生长。

针对金黄葡萄球菌能耐高盐而其他菌无此特性，对卵黄高盐培养基中不同浓度的氯化钠作了测试[7]。

结果，试验浓度均不能抑制大肠杆菌、枯草杆菌生长，其菌落数未见明显差异。

而一些对大肠杆菌抑制作用较强的药品[8]，可将增菌液由胆盐乳糖改为硫乙醇酸盐，结果阳性检出率为88%，大大高于胆盐乳糖25%的检出率。

应注意大肠埃希菌MUG培养基其pH值灭菌后不得过7.4，否则pH值偏高，MUG自行分解，产生荧光。

一般情况下[9]，湿热灭菌时，含有糖分的培养基温度需控制在115 ℃15～20分钟，不含糖分的培养基温度需控制在121 ℃15～20分钟。

虎红培养基灭菌温度在10℃以内的改变，可造成检验结果判断错误[10]。

干粉培养基，易吸潮，如存放不当出现凝块，则其凝固性较差，应避免使用。

试验用培养基，需经过质量鉴定，用已知典型反应菌株进行测试，其灵敏度及特征性反应应符合要求。

新鲜配制的培养基应在2～20 ℃避光保存，但不得冻结，保存时间不得超过2周。

分离平板在使用前应置36 ℃温箱内倒置孵育1～2小时，使其表面温暖湿润，利于分离。

培养基最好现用现配。

4 计数、观察的误差当细菌生长小而密集时，极易发生计数误差。

菌落计数时应仔细观察，必要时借助放大镜或低倍显微镜观察，以排除药渣，培养基沉淀物和小气泡等的干扰。

如仍难区别，可适当延长培养时间。

菌落蔓延生长成片或发生重叠影响计数。

药典规定菌落如蔓延生长成片，不宜计数。

这是由于平皿表面湿度过大，有利于动力菌泳动，促使菌落蔓延。

某些剂型如密丸、水丸最易成片状菌。

防止的方法有: 0.001%TTC琼脂法、开盖干燥法或换陶瓦盖法[11]。

不同的培养时间对计数结果的影响。

样品经24小时培养后，细小菌落容易漏掉，培养48小时后，菌落变大且有很多新生菌落，培养72小时后，菌落数增加不多，但菌落明显变大。

如细菌平皿有混杂的霉菌，因其生长旺盛，影响细菌的观察计数。

而霉菌在培养72小时后蔓延重叠生长严重，应于培养48小时后观察标记，并且观察时应轻拿轻放，忽反复翻转，以免早期形成的孢子散落在平皿的其他部位，又萌生新的菌落，导致计数误差。

控制菌生化反应均需按照规定的试验要求进行，如大肠埃希菌、沙门菌的三糖铁琼脂斜面反应的时间应在（24±2）小时，时间过长过短，都可能出现错误结果判断。

所以应在规定的培养环境下，严格遵守培养时间，以便真实的反映计数结果。

5 设备及人员的影响微生物的生长对温度的要求也较为严格。

在实际工作中尽管使用的都是恒温培养箱，但大多数的培养腔内都没有内置电扇，这样便带来温度差异/分层，这种差异带来的结果变化是显著的。

玻璃仪器、容量仪器须效验，保证取样量的一致性，特别在阳性菌加入时显得更为重要。

所用器械应洗涤干净，不残留酸碱及抑菌物质。

对实验所用器具根据材料的性质，采取相应的干热灭菌、湿热灭菌或消毒剂擦拭灭菌，且灭菌时间和温度均有明确规定[1]。

有实验[12]对市售的12批75%酒精用薄膜过滤法进行微生物限度检查，其中9批检出微生物，经革兰染色为阳性芽孢杆菌。

经考证该浓度的乙醇均为供应商采用自制纯化水稀释高浓度医用乙醇而成。

由于75%乙醇本身含有细菌，作为消毒剂就会成为新的微生物污染源，建议采用0.2 μｍ的疏水滤膜过滤，棉球湿热灭菌。

操作环境不合要求也会带来误差，应定期检查无菌室的空气是否符合规定。

严格无菌操作，操作马虎、随便易造成供试品再污染及已污染微生物的繁殖或死亡，从而不能真实反映试验结果。

6 抽样、取样误差微生物污染的不均匀性，势必影响试验结果[13]。

遵循随机原则的概率抽样可以保证抽选出代表性较高的样本，使样品具有代表性，保证样本推论总体的可靠性。

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