单克隆抗体

中文名称：单克隆抗体英文名称：monoclonal antibody; McAb; mAb第42天采血和ELISA检测第56天第四次免疫（抗原溶于PBS或盐水）第61天细胞融合细胞融合（一）融合剂细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。

聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。

用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。

50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。

也有采用30%～50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。

不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。

每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。

要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。

（二）融合过程融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。

融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。

3:1或5:1最为常用。

1．试剂与材料(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

(2)1640培养液100ml。

(3)完全1640液100ml。

(4)2.5%FCS－1640液50ml。

(5)HAT培养液100ml。

(6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。

如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。

(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

(8)40孔塑料培养盘。

2．操作方法⑴准备好脾细胞。

⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5%FCS－1640液。

⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。

⑷移去上清液。

⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。

⑹加预热至40℃的50%PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。

⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。

⑻重复⑺一次。

⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。

⑽重复⑼一次。

⑾加1640液15ml。

⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。

⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。

⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。

⒂轻摇后，放入5%CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。

⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。

注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。

⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。

在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。

大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。

杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。

⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。

在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。

同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

（三）细胞融合的关键1．技术上的误差常常导致融合的失败。

例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。

这必然要失败的。

2．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。

杂交瘤细胞克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。

不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。

而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。

杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。

如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。

产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1000倍。

利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。

1．材料大鼠神经胶质细胞株瘤杂交瘤细胞株（1）经高压灭菌的降植烷。

（2）Balb/c鼠：5~8周龄。

（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。

（4）RPMI—1640培养液（5）新生牛血清2．操作方法(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后1～9周内种植细胞。

(2)收取对数生长期的杂交瘤细胞，用5%FCS—1640液洗涤一次，1000r/min离心10min。

(3)取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用5%FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。

(4)给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107个细胞/ml）。

(5)接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。

血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。

提纯实验1．材料单克隆抗体制备流程[1](1)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液20mMol/LNaCl(2)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液40mMol/LNaCl(3)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液80mMol/LNaCl(4)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液(5)饱和硫酸铵液(6)DEAE—纤维素柱2．操作方法（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。

（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50%硫酸铵浓度。

（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5000r/min离心10min，去上清。

（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/LNaCl）中（溶液可能混浊）。

（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20mMol/LNaCl）中透析除盐。

（6）离心去沉淀。

单克隆抗体制备流程（7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量1A280unit=0.8mg蛋白质一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。

（8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/LNaClTris缓冲液平衡。

透析样品以Tris缓冲液等量稀释。

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。

大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脱。

测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。

杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。

免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。

免疫多次的多为IgG。

1．杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行。

3、将细胞培养上清（或特异亲和纯化的抗体）50μl加入酶标微孔板，每个标本加6孔，阳性对照也是加6孔每孔50μl。

然后每孔再加入50μl标本稀释液。

贴上封板膜37℃温育30分钟。

4、弃去板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。

再在每个标本的6孔中分别加入6种酶标二抗各100μl，通用阳性对照的6孔也一样。

在加样图上或酶标板上做好标记。

贴上封板膜37℃温育30分钟。

5、吸弃板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。

每孔分别加入显色剂A和显色剂B各50μl，换一张新的封板膜贴板避光37℃显色20分钟。

6、本试剂盒特异性好一般肉眼即可观察出结果，看显色蓝的那个孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类。

更可将反应终止液（每孔50μl）终止反应后用酶标仪450nm测定波长，630nm参考波长双波长测定结果，参看高值孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类。

阳性对照0D小于0.5实验无效，需要重做。

五、产品特点：高灵敏度、高特异性、结果容易判定。

当然您如果觉得很多试剂自己可以准备想省一笔费用，那您可以登陆网站选择我们为您准备的简装抗体鉴定产品C030215。

当然您也可以下次把标本交给我们来做并且不会增加太多费用！！六、保存条件：2-8℃避光保存效期一年。

不正确存放或过于频繁开启使用有可能因此使效期缩短。

七、注意事项：1、虽然本试剂盒过期后很久还有使用价值但还是请您在有效期内使用。

2、在检测腹水类单抗时要稀释到1/5万，虽然可以分辨但并不建议您这样做。

此类样品成分十分复杂，有干扰结果的可能。

在此种情况下您可以选择本公司的C030215抗体鉴定试剂。

它会给您带来满意的结果。

3、手洗板子时一定要把孔加满，停留10秒然后弃尽，最后要拍干净。

特别是在酶标二抗温育后洗板时一定要把酶吸出而不是甩出，要吸净。

这个在手工洗板时对结果很重要。

4、一次没用完的板子要带干燥剂放自封袋封好，随盒存放。

5、拿放板子时不要剧烈抖动，以免孔间交叉污染出现错误结果。

6、出现异常结果请随时咨询我们。

3．单抗的特异性鉴定可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。

4．单抗的效价测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。

不同的测定方法效价不同。

培养上清液的效价远不如腹水的效价。

采用凝集反应，腹水效价可达5×104。

而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。

单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。

5．必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。

克隆化方法经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。

克隆的时间一般说来越早越好。

因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。

但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。

克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。

一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。

克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。