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第50卷第3期辽 宁化工V〇1.50, No. 3 2021 年 3 月_________________________________Liaoning Chemical Industry__________March,2021分析检硎离子交换色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白的质量浓度刘佳欣，贺梦瑶，汤兴楠，栾凯雯(沈阳化工大学制药与生物工程学院.辽宁沈阳110142〉摘要：建立一种离子交换色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白质量浓度的方法。
采用cm-sepharose fastf l o w预装柱5 m L,配置质量浓度为10、20、30、40、50、60、70、S O i x g.m L—1的标准乳铁蛋白溶进行液色谱分离，p H值为7.0,浓度为0.02 mol C的磷酸盐溶液为起始缓冲液，进样量为1m L,流速1m L'm i i f1,浓度为 1 m o l‘L_lN a C l溶液洗脱，检测波长475m n。
回归方程：y=1.2774x+16.727 0,/?2=0.999,线性范围为1〇~80i x g'm L'平均加标回收率为96.56%。
此方法在分离牛初乳中的乳铁蛋白同时，又可以测定乳铁蛋白的含量，方便，快捷，结果准确可靠，重现性好。
关键词：离子交换；牛初乳；乳铁蛋白；检测中图分类号：T Q0658.6飞文献标识码：A文章编号：1004-0935 (2020) 03-0419-04乳铁蛋白（Lactoferrin,L F)是一种相对分子量 约为80 k D a的铁结合性糖蛋白，主要存于哺乳动物 的乳汁中m，经研究发现也出现在人和哺乳动物的胰液、胆汁和小肠分泌液等组织[21。
乳铁蛋白在乳 中的含量最为丰富，特别是在初乳中含量较高，人 初乳中乳铁蛋白的浓度可达到7 n^m L'牛初乳中 乳铁蛋白的浓度平均为1n^m L_U31。
乳铁蛋白具有 多种生物学功能，可以促进铁的吸收[41’抗癌，抗病毒，抗氧化，调节机体免疫反应|MI。
乳铁蛋白的评测方法乳铁蛋白是一种存在于乳制品中的重要蛋白质，具有对人体健康有益的功效。
为了评测乳铁蛋白的质量和功能，科学家们发展出了一系列的方法。
以下将对乳铁蛋白的评测方法进行详细介绍。
一、乳铁蛋白含量的评测方法：1. 尿素凝胶电泳：该方法将乳铁蛋白样品与标准品一同进行电泳，通过比较样品和标准品的带电量和迁移距离，可以计算出乳铁蛋白的含量。
2. 高效液相色谱法：通过将乳铁蛋白样品进行分离和检测，再与标准品进行比较，可以得出乳铁蛋白的含量。
二、乳铁蛋白结构的评测方法：1. 紫外光谱法：通过测量乳铁蛋白样品在紫外光下的吸光度变化，推断出乳铁蛋白的二级结构和三级结构。
2. 红外光谱法：通过测量乳铁蛋白样品在红外光谱范围内的吸收峰位和强度，可以推测出乳铁蛋白分子中的化学键和官能团。
3. 核磁共振谱法：通过测量乳铁蛋白样品在核磁共振仪中的信号，可以得到乳铁蛋白的原子组成和分子结构。
三、乳铁蛋白功能的评测方法：1. 铁离子结合能力评测：通过将乳铁蛋白与含有不同浓度铁离子的溶液接触，测量其对铁离子的结合能力，从而评估乳铁蛋白的铁离子结合能力。
2. 抗氧化活性评测：通过测量乳铁蛋白样品对活性氧自由基的清除能力，评估乳铁蛋白的抗氧化活性。
3. 免疫调节活性评测：通过观察乳铁蛋白样品对免疫反应的影响，评价乳铁蛋白的免疫调节活性。
四、乳铁蛋白质量的评测方法：1. 蛋白质含量测定：通过测量乳铁蛋白样品中的总蛋白质含量来评估其质量。
2. 脂肪含量测定：通过测量乳铁蛋白样品中的脂肪含量，评估其杂质含量。
3. 细菌检测：通过培养乳铁蛋白样品中的细菌，评估其卫生质量和微生物污染情况。
综上所述，乳铁蛋白的评测方法主要包括含量评测、结构评测、功能评测和质量评测。
这些评测方法可以帮助科学家们了解乳铁蛋白的质量、结构和功能，为乳铁蛋白的研究和应用提供科学依据。
随着科学技术的不断发展，评测方法也将不断更新和完善，以满足对乳铁蛋白质量的更精确评估需求。
乳铁蛋白含量标准
乳铁蛋白是一种重要的营养成分，它对人体健康有着重要的作用。
乳铁蛋白含量标准是指乳制品中乳铁蛋白的含量符合国家标准
的要求，保证产品质量和安全。
本文将介绍乳铁蛋白的作用、标准
要求以及检测方法，希望能对相关人士有所帮助。
首先，乳铁蛋白是一种重要的铁载体蛋白，它能够帮助人体吸
收铁元素，增强免疫力，促进生长发育，对婴幼儿和孕妇尤为重要。
因此，乳制品中乳铁蛋白的含量标准受到了广泛关注。
根据国家标准，乳制品中乳铁蛋白的含量应当符合一定的要求。
具体来说，牛奶中乳铁蛋白的含量应当不低于每升80mg，奶粉产品
中乳铁蛋白的含量应当不低于每100g 4mg。
这些标准的制定是为了
保证乳制品中乳铁蛋白的含量达到营养需求，确保产品质量和安全。
那么，如何检测乳制品中乳铁蛋白的含量呢？目前，常用的检
测方法主要包括免疫测定法、色谱法和质谱法等。
其中，免疫测定
法是一种常用的快速检测方法，通过专门的试剂盒可以快速准确地
检测出乳制品中乳铁蛋白的含量，具有操作简便、准确性高的特点。
在生产过程中，生产企业应当严格按照国家标准要求，对乳制
品中乳铁蛋白的含量进行检测，并确保产品符合标准要求。
同时，
消费者在购买乳制品时，也应当注意查看产品标签，选择符合标准
要求的产品，以保证乳铁蛋白的摄入量符合营养需求。
总之，乳铁蛋白含量标准是保证乳制品质量和安全的重要依据，对于生产企业和消费者来说都具有重要意义。
希望本文所介绍的内
容能够对相关人士有所帮助，促进乳制品行业的健康发展。
婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白含量测定李则均【摘要】以食品安全国家标准《食品中乳铁蛋白的测定(征求意见稿)》为参考,优化预处理步骤和梯度洗脱条件,肝素亲和柱净化,紫外高效液相色谱法测定婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白含量.检测波长280 nm,乳铁蛋白标准品出峰时间9.475 min.乳铁蛋白标准品工作液浓度50~250μg/mL,在此范围内线性回归方程y=129.67x-7.4719,R2>0.9991.乳铁蛋白定性重复性RSD%(n=6)为0.074,定量重复性RSD%(n=6)为0.996.乳铁蛋白加标回收率在93.4%~99.1%,平均回收率96.7%.【期刊名称】《中国乳业》【年(卷),期】2017(000)004【总页数】5页(P71-75)【关键词】婴幼儿配方羊奶粉;乳铁蛋白;肝素亲和柱;紫外高效液相色谱【作者】李则均【作者单位】黑龙江完达山乳品有限公司【正文语种】中文乳铁蛋白是一种非常重要的非血红素铁结合单体糖蛋白。
乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗病毒、抗真菌、抗氧化、抗辐射、抗过敏、抗癌和调节免疫系统的功能。
研究表明，人乳喂养的婴儿较婴幼儿配方奶粉喂养的婴儿抵抗力更高，不易患各种传染性疾病，主要是由于母乳中含有更多的乳铁蛋白、免疫球蛋白等多种活性蛋白，因此普通婴幼儿配方奶粉中合理的添加乳铁蛋白尤为重要。
羊奶与牛奶相比，羊奶的脂肪颗粒体积更小，维生素和微量元素含量更高，更易被婴幼儿消化吸收，因此婴幼儿配方羊奶粉越来越受到市场青睐。
婴幼儿配方羊奶粉中添加乳铁蛋白有着更广泛的前景，本文旨在确定一种准确、高效的婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白含量的测定方法。
目前乳铁蛋白的测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、高效亲和色谱法、高效毛细血管电泳法以及表面等离子共振技术等。
分光光度法测定乳铁蛋白含量准确性差。
酶联免疫吸附法、高效亲和色谱法和高效毛细血管电泳法样品前处理操作繁琐，预处理时间长。
乳及乳制品中乳铁蛋白含量的快速SDS-PAGE荧光检测方法李汉芳，黄珍，路梦凡，孙娜娜，徐丹，徐秦峰*（陕西科技大学食品科学与工程学院，陕西西安 710021）摘要：该研究采用新型的Chromeo P503（P503）染料替代考马斯亮蓝染色方法，以克服脱色染色步骤繁琐、耗时长（≥5 h）的不足，建立一种乳及乳制品中乳铁蛋白的快速简便十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）检测方法。
P503染料标记蛋白产生强烈的红色荧光发射，在30 min内一步操作即可完成，并且进行脱铁处理后消除乳铁蛋白铁饱和度对于荧光信号的干扰，保证定量的准确性。
根据凝胶成像图中78 ku蛋白条带是否存在及其灰度值的大小，实现乳铁蛋白的定性与定量检测。
在优化的实验条件下，线性范围为15~75 μg/mL，检出限为5.11 μg/mL，加标回收率在75.79%~108.09%之间，表明该方法具有较高的灵敏度和准确性。
SDS-PAGE和P503结合无需进行肝素亲和柱前处理，便可直接应用于乳及乳制品中乳铁蛋白快速简便的准确定量检测，P503染料标记还可以用于其它乳蛋白的SDS-PAGE快速低成本定量检测，从而为乳品质量控制和营养评价及加工工艺研究提供有力工具。
关键词：乳铁蛋白；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；Chromeo P503；快速标记文章编号：1673-9078(2024)04-296-302 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2024.4.0968Rapid SDS-PAGE Fluorescent Detection Method forLactoferrin Content in Milk and Dairy ProductsLI Hanfang, HUANG Zhen, LU Mengfan, SUN Nana, XU Dan, XU Qinfeng*(School of Food Science and Engineering, Shaanxi University of Science ＆ Technology, Xi’an 710021, China) Abstract: A novel dye (Chromeo P503, P503) was used as an alternative to Coomassie brilliant blue to address the drawbacks associated with the laborious and time consuming (≥5 h) staining and destaining processes. This facilitated the establishment of a rapid and simple sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) method for the detection of lactoferrin in milk and dairy products. P503 dye-labeled protein emits strong red fluorescence, which could be completed in one step within 30 min. The interference of lactoferrin iron saturation on fluorescence signal was eliminated after apolactoferrin preparation to ensure the accuracy of quantification. Qualitative and quantitative detection of lactoferrin was achieved based on the presence of a 78 ku protein band and its gray value in the gel image. Under optimized 引文格式：李汉芳,黄珍,路梦凡,等.乳及乳制品中乳铁蛋白含量的快速SDS-PAGE荧光检测方法[J].现代食品科技,2024,40(4): 296-302.LI Hanfang, HUANG Zhen, LU Mengfan, et al. Rapid SDS-PAGE fluorescent detection method for lactoferrin content in milk and dairy products [J]. Modern Food Science and Technology, 2024, 40(4): 296-302.收稿日期：2023-08-15基金项目：陕西省教育厅项目（22JC008）；陕西省科技厅项目（2021NY-174）作者简介：李汉芳（1999-），女，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全，E-mail：通讯作者：徐秦峰（1983-），男，博士，教授，研究方向：食品质量与安全，E-mail：296experimental conditions, the linear range was 15~75 μg/mL, and the limit of detection was 5.11 μg/mL, with a recovery of 75.79%~108.09%, indicating that this method has high sensitivity and accuracy. The combination of the SDS-PAGE and P503 methods enabled the rapid, simple, and accurate detection of lactoferrin in milk and dairy products, eliminating the need pretreatment of the heparin affinity column. P503 dye labeling can facilitate rapid and low-cost quantitative detection of other milk proteins using SDS-PAGE, providing a valuable tool for dairy quality control, nutrition evaluation, and processing technology research.Key words: lactoferrin; sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; chromeo p503; rapid staining乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf）是一种具有抗菌、抗病毒、增加成骨活性、降低腹泻发病率、促进肠道健康等多种生理活性的铁结合糖蛋白[1-3] ，例如最近研究发现，Lf能够辅助治疗新冠肺炎[4] 。
高效液相色谱法测定乳品中乳铁蛋白的含量岳虹;刘春霞;吕海燕;李素琴;赵贞;李翠枝【摘要】建立乳品中乳铁蛋白高效液相色谱的测定方法.采用pH值为7.0磷酸盐缓冲溶液做为提取剂,C18色谱柱分离,不同浓度的乙腈-0.5 mol/L的氯化钠溶液-三氟乙酸的二元系统进行梯度洗脱.每100 g奶粉(或每100 mL液态奶)中乳铁蛋白添加量为5～10 mg时,回收率大于90％.定量限为0.5 mg/100 g.该方法具有结果准确,操作简便,重复性好等优点,可用于乳品中乳铁蛋白的检测.【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2014(037)004【总页数】4页(P18-21)【关键词】高效液相色谱法;乳铁蛋白;肝素免疫亲和柱【作者】岳虹;刘春霞;吕海燕;李素琴;赵贞;李翠枝【作者单位】内蒙古伊利实业集团股份有限公司,呼和浩特 010010;内蒙古伊利实业集团股份有限公司,呼和浩特 010010;内蒙古伊利实业集团股份有限公司,呼和浩特 010010;内蒙古伊利实业集团股份有限公司,呼和浩特 010010;内蒙古伊利实业集团股份有限公司,呼和浩特 010010;内蒙古伊利实业集团股份有限公司,呼和浩特010010【正文语种】中文【中图分类】TS252.7乳铁蛋白（lactotransferrin，LF），为运铁蛋白中的一种多功能糖蛋白，在1939年从动物乳汁中发现[1-3]。
乳铁蛋白是人体免疫系统的组分之一，具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等特别强大生物功能[4-6]，被认为是一种极具开发潜力的食品和饲料添加剂[7-13]，因而建立准确高效的乳铁蛋白的检测方法成为至关重要的任务。
乳铁蛋白分析常存在分离度低，平行性差，检测结果不准确等问题[14-16]。
本实验建立了一种测定乳品中乳铁蛋白含量的新方法，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的缓冲溶液为提取剂[17]，C18色谱柱进行分离，采用紫外检测器检测，灵敏度高，检测结果准确，回收率精密度良好。
乳及乳制品中牛乳铁蛋白含量测定方法比较研究陈柔含，韩奕奕，马颖清，刘 洋，丰东升*上海市农产品质量安全中心曁农业农村部食品质量监督检验测试中心（上海），上海 201708摘 要：[目的]探讨两种不同检测方法测定乳与乳制品中牛乳铁蛋白的含量及应用研究。
[方法]对比高效液相色谱（HPLC）法和超高效液相色谱串联质谱（UPLC- MS/MS）法测定生鲜乳、调制乳、超高温瞬时灭菌乳、含乳饮料和奶粉样品等乳及乳制品中牛乳铁蛋白的含量，并对测定结果进一步比较和分析原因。
[结果]两种测定方法均具有较高回收率和较优的重现性，但两者方法对实际样品的测定结果具有一定差异性。
[结论]HPLC法测定牛乳铁蛋白是通过肝素亲和柱纯化富集乳铁蛋白，测定的是非热变性牛乳铁蛋白的含量；而UPLC-MS/MS法测定的是热变性和非热变性牛乳铁蛋白的含量，不受热处理加工工艺的影响。
实验室可针对不同检测目的选择不同方法进行定量研究。
关键词：牛乳铁蛋白；液相色谱；质谱；乳及乳制品文章编号：1671-4393（2022）09-0095-07 DOI:10.12377/1671-4393.22.09.190 引言牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin，bLF）是牛初乳中非常重要的铁结合型大分子糖蛋白，其分子量为78~80 kDa。
由于其氨基酸序列中含有大量的精氨酸与赖氨酸，故其等电点在7.8~8.2，是一种呈碱性的蛋白质[1]，主要由动物的乳腺上皮细胞分泌及表达。
乳铁蛋白（LF）与铁转运和储存密切相关，且对免疫功能系统的调节具有正向作用，同时拥有广谱抗菌性、抗病毒、抗癌、抗氧化等强大的生物功能，因此被媒体报道为“奶黄金”。
在自然界中，人的母乳中LF的含量较高，在1.0~3.0 mg/mL的范围内[2]，而牛初乳中的含量相对较低。
因此商业上很多基金项目：上海市科委项目“乳及乳制品中乳铁蛋白等活性物质检测技术研究及其应用”（19391902700）作者简介：陈柔含（1996-），女，浙江台州人，硕士，助理畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；韩奕奕（1972-），女，上海人，硕士，正高级畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；马颖清（1984-），女，上海人，硕士，畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究；刘 洋（1994-），女，河北承德人，硕士，助理畜牧师，研究方向为食品营养品质检测技术研究。
资料四乳铁蛋白食品添加剂的质量规格要求、生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法或相关情况说明内蒙古伊利实业集团股份有限公司一、乳铁蛋白质量规格要求（一）感官指标（二）理化指标（三）微生物、污染物及真菌毒素指标二、检验方法（一）用反相高效液相层析法测定乳铁蛋白的纯度1. 样品准备对粉状乳铁蛋白，称出20 mg乳铁蛋白样品，用MilliQ水配成20 mL，1mg/mL的乳铁蛋白溶液，再通过0.2 μm的乙酸纤维素膜进行过滤。
2. 材料和试剂（1）MilliQ水（超纯水18 megohm resistivity）（2）95%的乙腈(氰化甲烷)（HPLC 级）（3）1%的三氟乙酸（TFA）2.1 缓冲液准备（1）缓冲液A：100% MilliQ水把1 L MilliQ水装在1 L 的SCHOTT瓶中。
（2）缓冲液B：95%的乙腈分别量取50 mL MilliQ水和950ml乙腈。
把二者混合，通过0.45 μm的滤膜进行过滤。
储存在1 L的SCHOTT瓶中。
（3）缓冲液C：1%的三氟乙酸用移液管量取25 mL三氟乙酸放入200 mL MilliQ水中，用MilliQ水补至250 mL。
转移到250 mL的SCHOTT瓶中储存。
3. 仪器设备（1）水基线体系控制和获得数据的设备（Empower）（2）水2695分离组件和2487双λ吸收检测器（3）反相高效液相层析柱---Alltech prosphere C4 300A 150mm × 4.6mm,with Alltech All-guard Guard 7.5 × 4.6mm.4. 高效液相层析的测量方法4.1 注射体积50 μL已过滤的乳铁蛋白样品或空白液注入柱中供分析。
4.2 梯度表4.3 温度柱子温度=35°C样品温度=10°C4.4 检测在波长280 nm处检测乳铁蛋白，乳铁蛋白的洗脱时间大约9.7分钟。
奶制品一直是人们饮食中重要的营养来源，其中的乳铁蛋白更是备受关注。
乳铁蛋白是一种在乳制品中富含的蛋白质，具有丰富的营养成分和重要的药理作用。
然而，乳铁蛋白的测定一直是个难题，而液相色谱法是一种常用的测定方法。
在接下来的文章中，我将通过深度和广度兼具的方式来探讨奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法，并共享我对这个主题的个人观点和理解。
让我们来了解一下乳铁蛋白。
乳铁蛋白是奶制品中的一种重要蛋白质，它不仅具有良好的营养价值，还具有抗菌、抗病毒和抗氧化等多种药理作用。
对乳铁蛋白的测定具有重要的意义。
液相色谱法作为一种高效、灵敏度高、选择性好的分析方法，已经成为乳铁蛋白测定的首选方法之一。
接下来，我将从液相色谱法的基本原理和操作流程开始介绍。
液相色谱法是一种利用溶液在固定相与移动相作用下分离、纯化混合物的物理化学方法。
在乳铁蛋白的测定中，可以使用反相液相色谱法和离子交换液相色谱法。
在操作流程上，首先需要提取样品中的乳铁蛋白，然后采用适当的色谱柱和色谱条件进行分离和检测，最后利用标准曲线法计算样品中乳铁蛋白的含量。
这种方法的优点在于准确性高、重复性好、操作简便、对样品的前处理要求低等。
让我们来谈谈乳制品中乳铁蛋白测定液相色谱法的应用和发展现状。
液相色谱法在乳铁蛋白的测定中已经得到了广泛的应用，尤其在乳制品加工和质量控制中具有重要的实际意义。
随着科学技术的不断发展，液相色谱法在乳铁蛋白测定中也在不断完善和提高，例如采用高效液相色谱法、超高效液相色谱法等新技术，可以更加快速、准确地测定乳铁蛋白的含量。
我还想强调乳铁蛋白的测定对于保障乳制品的质量和安全至关重要。
乳铁蛋白不仅是乳制品中的重要营养成分，更是对乳制品质量的重要指标之一。
利用液相色谱法对乳铁蛋白进行准确、快速地测定，有助于提高乳制品的品质和竞争力，有效保障消费者的健康。
对于奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法，我的个人观点是，这是一项非常重要的研究课题，对于乳制品行业的发展和消费者健康都具有重要意义。
乳制品中乳铁蛋白的测定
作者：章寅高磊郑隽等
来源：《现代农业科技》2013年第16期
摘要采用高效液相色谱法建立了乳制品中乳铁蛋白测定的分析方法。
试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取，提取液经肝素亲和柱净化后，采用反相高效液相色谱柱分离，以二极管阵列检测器于280 nm处检测，采用外标法定量。
结果表明：乳铁蛋白在10.0～1 000.0 ug/mL 范围内线性良好，添加回收率为75 %～110 %，相对标准偏差（RSD）小于20%。
该方法具有灵敏度高、准确度高、重现性好的特点，适合检测机构或乳品企业日常样品中乳铁蛋白的检测。
关键词乳铁蛋白；高效液相色谱法；肝素亲和柱
中图分类号 TS252.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）16-0291-02
乳铁蛋白是近年来国内外开发研究速度最快的一种营养添加剂，由于其具有广谱抗菌、抗病毒感染、调节体内铁平衡、调解骨髓细胞的生成、抑制人体肿瘤细胞、同多种抗生素及抗真菌制剂协同有效治疗疾病等功效，使其产品在国内外乳制品加工中的应用范围日益广泛[1-3]。
我国《食品营养强化剂使用标准（GB14880-2012）》中规定婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的最大允许使用量为1.0 g/kg，而目前国内外未建立与乳制品中乳铁蛋白测定相关的国家标准。
为保证乳铁蛋白的安全生产和使用，该文建立了乳制品中乳铁蛋白的检测方法，最大限度地保证市场中乳铁蛋白添加型产品的安全和质量水平，以保证乳制品安全，促进行业健康发展[4]。
1 材料与方法
1.1 供试材料、试剂与仪器
1.1.1 供试材料。
供试材料为婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、成人配方奶粉。
1.1.2 试剂与仪器。
Agilent 1200 高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器。
肝素亲和柱（美国通用医药有限公司）。
乙腈（色谱纯，美国Sigma公司产品），无水乙醇、氯化钠、磷酸、磷酸氢二钠、三氟乙酸（分析级，国药集团化学试剂有限公司产品）。
超纯水Nanopure Life Science（赛默飞世尔科技有限公司）。
离心机Jouan Ceterifuge MR23i（赛默飞世尔科技有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 提取试剂的选择。
在相同试验条件下分别以水和磷酸缓冲液作为提取试剂，测定样品加标回收率，比较水和磷酸缓冲液对样品中乳铁蛋白的提取效果。
1.2.2 提取温度的选择。
乳铁蛋白分子量为80 kDa，是具有大约700个氨基酸残基序列的单体糖蛋白，并连接1～2个配糖体。
对于这一类大分子量的蛋白质，提取溶剂温度过高会造成乳铁蛋白结构的变化，致使检测结果偏离实际值。
研究分别选取25、50、60、70、80、
90 ℃进行比较。
准确吸取1 mL 200 μg/mL的标准溶液于EP管中，分别于25、50、60、70、80、90 ℃下恒温水浴1 h，上机测定[5-6]。
1.2.3 肝素亲和柱的选择。
肝素（Heparin）是一种含硫酸酯的酸性多糖，有文献报道乳铁蛋白可与这类多负电荷分子糖胺多糖结合。
故在该文中采用HiTrapTM Heparin HP（1 mL）肝素亲和柱作为目标化合物纯化和浓缩的前处理步骤。
通过经过和未经过肝素亲和柱纯化的样品比较图，分析其对乳铁蛋白检测应用的可行性[7]。
1.3 液相色谱条件
色谱柱：C4，5μm，300A（孔径），250 mm×4.6 mm（内径）；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样体积：50 μL；流速：1.0 mL/min；流动相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈，梯度洗脱参数如表1所示。
1.4 样品前处理
1.4.1 提取。
准确称取1 g试样（试样中含乳铁蛋白0.1～10.0 mg）于50 mL烧杯中，加入5 mL温热的磷酸氢二钠溶液（温度不超过50 ℃），搅拌使样品完全溶解，将样品全部转入50 mL具塞塑料离心管中，再向原烧杯中加入5 mL磷酸氢二钠溶液，合并2次液体。
漩涡振荡器振荡2 min，于室温下3 000 r/min离心10 min。
将上层脂肪层和下层沉淀层之间的液体小心转移到另一个50 mL离心管中，再向原离心管中加入5 mL磷酸氢二钠溶液重复操作1次，合并2次液体作为样品提取液备用。
1.4.2 净化。
肝素亲和层析柱先用5 mL磷酸氢二钠溶液平衡，处理完毕后加入样品提取液，待样品液体完全流出后，再用10 mL磷酸氢二钠溶液淋洗，弃去全部流出液。
最后用3 mL磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱，收集全部流出液，用磷酸氢二钠-氯化钠溶液定容至3 mL。
将收集溶液过0.45 μm水相滤膜，供液相色谱-DAD检测分析用。
2 结果与分析
2.1 提取试剂的选择
试验证明，在同样的试验条件下用磷酸缓冲液作为提取试剂的回收率比水作为提取试剂高50%。
另外，样品中含有比较高浓度的蛋白类物质时，乳铁蛋白在磷酸盐缓冲液中的溶解度优于水中；后续试验采用肝素亲和的活化需要磷酸盐缓冲液；采用缓冲液作为提取试剂可以保证样品上柱前的pH值在试验要求范围。
2.2 提取温度的选择
试验数据表明，随着温度的上升，乳铁蛋白的结构发生了变化。
从表2可知，目标峰的峰高由25 ℃的76.9降低至90 ℃的22.2。
因此得出结论，为了保证试验结果的准确性，在乳铁
蛋白提取过程中必须控制提取缓冲液的温度在50 ℃以下。
2.3 肝素亲和柱的选择
从图1可知，未经过肝素亲和柱纯化的样品成分比较复杂，给乳铁蛋白的检测造成了相当大的难度，经过肝素亲和柱纯化的样品，杂质就比较少，峰形比较好，符合检测的要求。
2.4 线性关系及方法检出限
用液相色谱法测定不同浓度的乳铁蛋白标准溶液，其测定结果表明乳铁蛋白的标准溶液与峰面积响应值之间存在着较好的线性关系，从表3、图2可知，相关系数R2为0.999 1，回归方程分别为y=2.540 7x-13.275。
根据限量检测要求，对婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、成人配方奶粉等几类样品中乳铁蛋白进行了加标回收重复试验。
根据信噪比S/N=3，试验结果表明，该方法检出限均达到20 mg/100 g。
2.5 回收率的测定
应用该方法，添加标准物质，对婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、成人配方奶粉3类样品中进行乳铁蛋白回收率的测定，从表4可知，按已确定的样品提取条件和色谱条件测定添加回收量，试验表明平均回收率达到75%～100%，相对标准偏差
3 结论与讨论
采用高效液相色谱法（HPLC）的方法测定乳制品中乳铁蛋白含量的测定。
试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取，提取液经HiTrapTM Heparin HP柱或相当者净化浓缩后，用反相高效液相色谱柱分离，于紫外检测器280 nm处检测，外标法定量。
该方法与文献中报道的方法相比，具有操作方便简单、耗时较短、重复性好、回收率高、灵敏度高的优势。
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