多管发酵法测定水中大肠菌群

多管发酵法测大肠杆菌群一、实验目的1、学习测定水中大肠杆菌群数量的国标测试法（主要为多管发酵法）2、了解大肠杆菌群的数量在水中的重要性二、实验原理我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85中关于生活饮用水的细菌标准具体规定如下：1、细菌总数1ml水中不超过100个。

2、大肠杆菌数1L水中不超过3个。

3、若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过10000个。

多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN 来表示试验结果的。

实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。

如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。

不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。

因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。

三、适用范围：大肠菌群系指一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

通常用此法作为粪便污染指标来评价食品以及饮用水的卫生质量。

四、检验程序：→→→→→→五、操作方法：5.1 以无菌操作，将检样10ml被测液放于含有90ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。

5.2 用1ml 灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均（均液的PH值应在6.5～７.5之间，必要时分别用1mol/L 匀，做成1：100的稀释液。

氢氧化钠（NaoH）或(1mol/L)盐酸（HCL）调节。

综合实验：多管发酵法测自来水大肠菌群组员：李妍、马万贵、石真真、李招柳、池小辉一、实验目的1、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系；2、测定自来水是否符合饮用水的卫生标准;3、培养学生自主设计并完成实验的能力，激发学生的科研主动性与积极性；4、通过实验了解检测水中大肠菌群的原理和方法。

二、实验原理大肠菌群——能在37 ℃24-48h内发酵乳糖产酸与产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，易于培养和观察。

粪便中存在大量的大肠菌群细菌，并且它们与水中存在的肠道病原菌成正相关性。

水中病原菌浓度很低，测定手续复杂，工作人员还有被感染传播的危险。

所以检测水的细菌学卫生标准，通常检测大肠菌群。

多管发酵法包括初发酵、平板分离和复发酵3个部分。

初发酵中发酵乳糖产酸、产气，根据培养基内指示剂颜色变化及杜氏小管内有无气体，判断是否为阳性(液体培养基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。

由于许多细菌不能发酵乳糖，不生长，而大肠菌群可发酵乳糖产酸（有机酸），产气（CO2+H2）乳糖起选择性碳源的作用。

溴甲酚紫是PH指示剂（碱性条件：紫蓝色；酸性条件：黄色，变色点PH=6.7），当大肠菌群的细菌利用乳糖产酸后，使原来的PH由中性下降呈酸性，培养基从紫色变为黄色。

另外，溴甲酚紫还具有抑制其他细菌（如芽孢杆菌）生长的作用)。

平板分离一般利用大肠菌群在伊红美蓝（EMB培养基）上形成紫色金属光泽菌落并结合革兰氏染色进行判断（作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核的、有金属光泽的深紫色菌落。

将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落）。

最后进行复发酵进一步证实。

三、实验材料及用具1、培养基：伊红美蓝培养基（EMB培养基）、乳糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白培养液、3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液2、溶液和试剂：革兰氏染色液、无菌水3、仪器及用具：三角瓶（2个）、发酵用试管（32个）、发酵用烧瓶（4个）、杜氏小管（36个）、培养皿（12个）、移液管、接种环、酒精灯、记号笔、油镜四、操作步骤（一）水样的采取1、自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5 min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。

3.3.2贮备培养基的配制
先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCl调节pH为7.2～7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115℃灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
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每100ml水样中总大肠菌群数近似数
接种量，ml
每100ml水样中总大肠菌群数近似数
3.3.3平皿培养基的配制
将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5％美蓝水溶液，加入已融化的贮备培养基中，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。

多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不的为阴性反应。

平板分离实验中把初实验产期产酸的试管的菌接到伊红美兰琼脂平板上然后培养24小时。

复发酵实验中将以上大肠杆菌阳性菌落，经涂色染色为革兰阴性无芽孢杆菌，通过次试验进一步证实原理：初发酵实验：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一个杜氏小管。

乳糖能其选着作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠杆菌能发酵乳糖而产气产酸。

为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为指示剂，细菌产酸后培养基由原来的紫色变为黄色。

初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不产气的为阴性结果。

平板分离：伊红美兰琼脂培养基有伊红和美兰两种染料，在此作为指示剂，大肠杆菌发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料及结合，使培养基产生有金属光泽的深紫色菌落。

复发酵实验：以上大肠杆菌阴性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢的，通过此试验进一步证实。

原理与初发酵实验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠杆菌阴性结果。

材料与用具：1.培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置杜氏小管）三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有杜氏小管）伊红美兰琼脂平板2．无菌水3. 用具载玻片灭菌带玻璃塞空瓶灭菌试管灭菌吸管方法：1水样的采取从不同水体（自来水、河水）中采集样品2自来水检查（1）初发酵实验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。

在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样。

利用多管发酵法检测水中大肠菌群数量作者：摘要：本实验利用多管法检测水中大肠菌群数量，以反映城市供水是否符合标准。

关键词：多管发酵法大肠杆菌最大可能数(MPN) 发酵试验平板分离前言：城市生活供水水质与人们生活息息相关，为确保饮水合用水安全，必须对其进行严格的常规监测。

但是水体中直接检测出病原微生物比较困难，因为它们数量极少，而且培养条件苛刻，分离鉴定比较困难。

因此常选用指示微生物作为水体中病原微生物数量的指标。

大肠菌在人体内和粪便中存在很多，受气污染的水体中较容易检测到大肠菌的存在，并且检测方法简单。

因此，常用大肠菌群为指标评价水的卫生质量。

1．原理：多管发酵法是根据大肠杆菌群细菌能发酵乳糖产酸产气及具备革兰氏染色阳性、无芽孢呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行实验，以求得水样中的总大肠菌群数，最大可能数（MPN）来表示实验结果。

2．实验2．1实验材料2．1．1 实验仪器：超净工作台、恒温培养箱、显微镜等。

2．1．2 培养基：乳糖蛋白胨培养基（分装于10支试管中，内涵倒置杜氏小管）、3倍浓度乳糖蛋白胨培养基（分装于5支试管中，内涵倒置杜氏小管）、伊红—美蓝（EMB）培养基。

（培养基均为灭过菌的）2．1．3染色剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥碘液、番红染色液。

2．1．4水样：拧开龙头流水5分钟后取自来水。

2．1．5其他：灭菌移液管、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。

2．2 实验步骤2．2．1初发酵试验：a 取5支装有3倍浓度乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积10ml；取5支装有乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积1ml；取5支装有乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积0.1ml。

b 用灭菌移液管分别吸取10ml水样加入到标记号的3倍浓度培养基试管中；分别吸取1ml水样加入到标记号的1倍浓度培养基试管中；分别吸取0.1ml水样加入到标记号的1倍浓度培养基试管中。

水中总大肠菌群的测定—多管发酵法
一．原理
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法查验。

多管发酵法的原理是依照大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，和具有革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行查验求得水样中的总大肠菌群数。

实验结果以最可能数（most probable number），简称MPN 表示。

三．仪器
(1)高压蒸气灭菌器。

(2)恒温培育箱、冰箱。

(3)生物显微镜、载玻片。

(4)酒精灯、3mm接种环。

(5)培育皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（一、五、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶、移液枪。

四．培育基及染色剂的制备
1．乳糖蛋白胨培育液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调剂溶液pH为～，再加入%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。

2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培育液：按上述乳糖蛋白胨培育液的制备方式配制。

除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。

1适用范围本标准适用于天然水和生活水中总大肠菌群的测定。

2方法概要总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37C 生长时能使乳糖发酵，在 24h 内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

总大肠菌群数系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。

总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。

本标准参照GB 5750-85制订。

3试剂和材料 3.1乳糖蛋白胨培养液：外购商品培养基或按下列方法自行配制。

3.1.1 组分蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g乳糖 氯化钠1.6 %溴甲酚紫乙醇溶液蒸馏水3.1.2 配制将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于 节pH为7.2〜7.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置于高 压蒸汽灭菌器中，以 115C 灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。

3.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液: 按上述乳糖蛋白胨培养液（ 3.1 ）各组分的称量增加三倍配制。

3.3 品红亚硫酸钠培养基（供多吕发酵法用） :外购商品培养基或按卜列万法自行配制。

3.3.1组分蛋白胨 10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾3.5g琼脂10〜30g蒸馏水1000ml无水亚硫酸钠5g 左右 5.0g 5.0g 1.0ml 1000ml1000ml 蒸馏水中加热溶解，用 1mol/L 的NaOH 或HCI 调332 贮备培养基的配制先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCI调节pH为7.2〜7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115C灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。

3.3.3平皿培养基的配制将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。

再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10分钟以灭菌。

大肠菌群数的测定方法宝子，今天咱们来唠唠大肠菌群数咋测定的哈。

最常用的一种方法就是多管发酵法。

这就像是一场微生物的小比赛呢。

咱先得把样品采集好，比如说水啊或者食品之类的。

然后把样品放到乳糖胆盐发酵管里头。

这就像是给大肠菌群准备了一个特别的小屋子，要是有大肠菌群在，它们就会在这个小屋子里开始“搞事情”，发酵乳糖产酸产气。

你就可以看到小管子里有气泡啦，这时候就像是它们在跟你说“嗨，我们在这儿呢”。

要是在乳糖胆盐发酵管里有反应了，咱就得把这些有反应的培养液再接种到伊红美蓝琼脂平板上。

这个平板可神奇啦，大肠菌群在上面会长出有自己特色的菌落呢。

就像它们在这个新的舞台上展示自己独特的模样。

这些菌落可能是紫黑色的，还有金属光泽，就像一群穿着闪亮衣服的小演员。

通过数这些有特色的菌落，就能大概知道大肠菌群的数量啦。

还有一种方法叫滤膜法。

这个就像是用一个小筛子来筛出大肠菌群。

先把样品通过滤膜过滤，大肠菌群就被留在滤膜上啦。

然后把滤膜放到特定的培养基上培养。

那些大肠菌群就会在滤膜上慢慢长大，形成小点点一样的菌落。

咱们再数这些小点点，就能知道大肠菌群的数量咯。

不过呢，在做这些测定的时候呀，一定要注意卫生和操作规范哦。

就像咱们做饭得按照菜谱来一样，测定大肠菌群数也得按照严格的步骤。

不然的话，就可能得出错误的结果呢。

比如说，要是不小心把别的细菌也带进去了，那就像是一场混乱的聚会，根本分不清谁是谁啦。

总之呢，测定大肠菌群数虽然有点小复杂，但是只要按照方法来，就能够准确地知道样品里大肠菌群的情况啦。

这对保障咱们的健康可重要了呢，不管是喝的水还是吃的食物，知道大肠菌群的数量就能知道它们是不是安全的，就像给咱们的健康上了一道保险。

1适用范围及标准1.1适用于生活饮用水、水源水、游泳池水中大肠菌群的测定。

1.2技术标准GB/T 5749-2006 《生活饮用水卫生标准》GB/T 5750.12-2006 《生活饮用水标准检验方法微生物指标》DB 31/890-2015《公共游泳场所卫生管理规范》2检测原理2.1 总大肠菌群指一群在37 ℃、24 h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

2.2 耐热大肠菌群指一群在44.5 ℃仍能生长且发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

2.3大肠埃希氏菌是指一群能生长发酵乳糖产酸、产气且在含有荧光底物的培养基上44.5 ℃培养24 h产生β-葡萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

3仪器和设备3.1 高压蒸汽灭菌器3.2 冰箱：2 ℃—8 ℃3.3 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃3.4 天平3.5PH试纸3.6恒温水槽：44.5 ℃3.7生物安全柜3.8紫外光灯：6W、波长366nm3.9平皿：直径为9cm3.10试管3.11刻度吸管3.12小倒管3.13 金属接种环4培养基和试剂4.1乳糖蛋白胨培养基：称取乳糖蛋白胨于蒸馏水中加热溶解，充分混匀，分装到带有倒管的试管中(每管10 mL)，115 ℃高压灭菌20min。

（注：双料乳糖蛋白胨即蒸馏水不变，乳糖蛋白胨的成分量加双份。

）4.2伊红美兰琼脂平板：称取伊红美兰琼脂，加热溶解，倾注灭菌平皿，每皿约15ml。

冷凝后，倒置4℃冰箱保存，待用。

4.3革兰氏染色液（染色方法见试剂使用说明书）4.4EC培养基：称取EC培养基干粉，加热溶解，调PH为6.9±0.2，分装到带有倒管的试管中(每管10ml)，121 ℃高压灭菌20 min，备用。

4.510 %（m/m）硫代硫酸钠溶液：121 ℃高压灭菌20 min。

水中粪大肠菌群测定方法嘿，咱今儿就来说说这水中粪大肠菌群测定方法。

你想想看啊，水这东西，咱天天都得用，喝的、洗的、用的，要是水里有啥不干净的东西，那可不得了！这粪大肠菌群就是得重点关注的家伙。

咱先来说说多管发酵法吧。

就好像是个大侦探在找线索一样，把水样分成好多份，分别放到不同的管子里，给它们创造适合的环境，然后等着看有没有啥反应。

这就像是在观察一群小“嫌疑人”，看谁露出马脚。

如果有管子里出现了一些特殊的现象，嘿，那可能就找到目标啦！还有滤膜法，这就像是给水流过一个特别的滤网。

把水过滤一遍，那些粪大肠菌群就可能被留在滤膜上。

然后再去观察这个滤膜，看看有没有它们的踪迹。

这就好像是在沙滩上找贝壳，仔细地搜寻着。

平板计数法也挺有意思呢！把水样涂在平板上，就像给它们安排了一个小舞台，然后等着看哪些家伙会冒出来，在这个小舞台上“表演”。

通过观察这些“小演员”的数量和状态，就能大概知道水里的情况啦。

你说，这测定方法是不是挺神奇的？就像是给水里的这些小东西来了一场大排查。

咱得认真对待啊，不然喝了不干净的水，那肚子可不得闹腾啊！这可不是开玩笑的事儿。

而且啊，测定的时候可得细心再细心，不能有一点马虎。

这就跟咱做一件重要的事情一样，得全神贯注，不能出岔子。

要是稍微不注意，可能就错过了关键的信息，那可不行。

想象一下，如果因为测定不准确，导致我们以为水是干净的，结果却不是，那会带来多大的麻烦呀！所以说，这水中粪大肠菌群测定可真是个重要的活儿，一点都不能含糊。

咱普通老百姓可能平时不太会去做这个，但咱得知道有这么回事儿，得关注咱喝的水是不是安全的。

这也是对自己和家人负责呀！可别小看了这小小的粪大肠菌群，它们要是在水里闹腾起来，那可不好收拾呢！总之呢，水中粪大肠菌群测定方法是保障我们用水安全的重要手段，我们得重视起来，让我们的生活用水干干净净、健健康康的，这样我们才能放心地使用呀！你说是不是这个理儿？。

酶底物法与多管发酵法和纸片法测定水中粪大肠菌群方法比较背景介绍随着人口的不断加添和城市化的进程，水诘责题也越来越受到关注。

其中水中粪大肠菌群是判定水质是否达标的指标之一、因此，快速、精准地测定水中粪大肠菌群已成为保障公共卫生和水环境安全的紧要工作。

在测定水中粪大肠菌群时，目前紧要有三种方法：酶底物法、多管发酵法和纸片法。

本文将对这三种方法进行比较，以便选择适合的方法进行水质检测。

酶底物法酶底物法是利用粪大肠菌群分泌的β—D—半乳糖苷酶对其底物苯基—β—D—半乳苷（X—Gal）水解，产生可见的蓝色色素。

实在试验步骤如下：1.接受分光光度计，读取X—Gal水解产生的蓝色产物的吸取值。

吸取值越高，表明样品中粪大肠菌群的数量越多。

该方法具有快速、精准等优点，但存在确定的局限性，比如无法区分大肠杆菌和其他肠道菌，仅仅只能检测粪生源的水体样品。

多管发酵法多管发酵法是利用粪大肠菌群在固体培育基中进行培育，利用二氧化碳生成的压力变化判定粪大肠菌群的数量。

实在试验步骤如下：1.将含有气管的玻璃管一端紧贴于固体培育基上。

2.向不同的玻璃管中分别加入不同的水样，并进行固体培育。

3.通过察看玻璃管顶端气泡的产生和数量，判定样品中粪大肠菌群的数量。

该方法不仅可以检测含有粪便的水产品中的粪大肠菌群，而且适用范围广，可以检测非点源污染和净化污水等水产品中的粪大肠菌群，但操作多而杂、时间较长。

纸片法纸片法是将覆盖了0.5～1.0 ml水体样品的纤维素纸分别带入含有荧光素β—D—葡萄糖苷（MUG）的细菌培育基中，然后在黑暗中孵育后，通过紫外线灯照射MUG荧光显带样品，察看荧光显带情况，得出粪大肠菌群数量。

实在试验步骤如下：1.制备含有MUG的培育基。

2.将确定数量的水样加入到带有MUG的培育基中并进行培育。

3.在黑暗中察看培育基上产生的荧光显带情况，得出样品中粪大肠菌群的数量。

该方法具有灵敏度高、操作简便等优点，但也有局限性，例如无法检测混合大肠杆菌和其他的大肠杆菌感染和污染的水样。

微生物综合实验报告实验题目：水质微生物学分析——利用多管发酵法检测水中大肠杆菌群数量组员姓名：xxx作者单位：南京工业大学生物与制药工程学院专业班级：生物工程类1001班指导老师：xxx摘要：实验采用自来水作为样品，对样品进行接种，分离，纯化，培养得到具有不同特征的肠杆菌。

通过对肠杆菌的数量和形态特征的分析，确定自来水是否被污染和污染程度。

关键词：水源；肠杆菌；数量；污染前言：水是制药和食品行业使用最为广泛的原料，也是赖以生存和发展的物质基础。

水与药品、食品中的其他原料一样，必须符合既定的质量标准，如果水被污染就会影响多批次产品。

另外，对微生物实验室来说，水是各种培养基、缓冲液、检测剂的主要组成部分。

近年来，由于国际上一些地区和国家频繁发生恶性事件，饮用水安全和卫生问题引起了全球的关注，饮水安全已经成为全球性的重大战略性问题。

世界卫生组织调查表明：在发展中国家，各类疾病有8%是因为饮用了不安全、不卫生的水而传播的，每年大约有2000万人死于饮用不卫生的水。

必须严格控制水的微生物学质量，以保证医药食品产品、培养基、试剂等的质量的可靠性以及人类饮用水的安全。

我国饮用水水质微生物学指标：国际上目前主要的水质标准是世界卫生组织（WHO）制定颁发的《饮用水水质准则》制药用水微生物监测是为了监控控制性微生物从而将水中微生物含量维持在一定水平。

没有必要将水中存在的所有微生物都监测出来，只针对对产品对人具有潜在危害的致病性的微生物进行监控。

流行病学研究确认，水携带的病原菌的存在与肠道来源的细菌相关，肠道病原微生物进入水体，随水流传播可引起肠道病爆发流行，所以必须对水中病原微生物严格监控。

但要从水体中直接检出病原微生物比较困难，它们在水中的数量很少且培养条件苛刻，分离和鉴别都比较难，即使样品检测结果是阴性也不能保证没有病原微生物的存在。

因此，常用指示微生物作为水体中病原微生物的监测指标。

大肠菌群细菌在人的肠道和粪便中数量很多，受到粪便污染的水容易被检出，且检测方法比较简易。

证实有大肠菌群存在后，再根据复发酵的阳性管
（瓶）数查表，即得每升水样中的大肠菌群数。
▲ 将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管 结果查水 样的发酵管结果查表4
五 实验报告
实验课程论文
封面格式 《水处理微生物学》课程实验
水样管/ml 100 10 1 0.1 0.01
发酵结果
2 思考题
(1) 大肠菌群的定义是什么? (2) EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查 大肠菌群时，各起什么作用？
存在于肠道中的正常菌群,在正常生理情 况下不致病.
（1）大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli） E.coli
（2）产气杆菌（Aerobacter aerogenes） （3）枸橼酸盐杆菌（Coli citrovorum） （4）副大肠杆菌（Paracoli） 大肠菌群的生理习性与病原菌相似，并且外界 存活时间基本一致.
经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢 杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通 浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一 初发酵管的同类型菌落1--3个，37℃培养24h，结果 若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
同类型菌落① 深紫黑色、有金属光泽。 ② 紫黑色、不带或略带金属光泽。 ③ 淡紫红色、中心颜色较深。
3 复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片革兰氏染 色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再 进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸 又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
水样 接种
初步 发酵
产酸 产气
大肠菌群
厌氧芽孢杆菌
好氧芽孢杆菌
平 板 分 离
鉴 别 培 养 基
产酸 复发酵

多管发酵法检测生活饮用水中总大肠菌群摘要：总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的在37℃生长时能使乳糖发酵、在24小时内产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌。

总大肠菌群既包括存在于人及动物粪便的大肠菌群，也包括存在于其他环境中的大肠菌群。

在日常的检测过程中，特别是在饮用水的检测中，总大肠菌群的检测对检测环境、检测人员的操作水平和经验要求都很高，且检测时间长达三天，因此其检测结果的准确率都和那提高。

笔者在长期检测中对一些检测过程中出现的问题着重进行了归纳，通过反复的试验，和仔细观察后，摸索出了一些规律和方法，在此加以总结，有助于以提高总大肠菌群检测的高效性和准确性。

关键词：饮用水、总大肠菌群、多管发酵根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。

在检测时可用多管发酵法，以100mL水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示的。

不同的方法标准略有差异，但检测步骤大体相同，即：乳糖发酵实验、分离培养和证实试验。

按《生活饮用水标准检验方法》微生物指标GB5750.12-2006的规定，总大肠菌群检测的步骤为：2.1.5.1乳糖发酵实验（初发酵）；2.1.5.2分离培养；2.1.5.3证实实验（复发酵）。

而检测的难点主要在于步骤2.1.5.1、2.1.5.3中“产酸产气”的确认及步骤2.1.5.2中的菌落形态及染色的确认。

初发酵阳性管，不能肯定就是总大肠菌群，经过证实试验后，有时可能成为阴性。

经过多次观察发现在复发酵成阳性的样品，在初发酵时都有着一些共同的现象。

在此，我们从曾经受过微生物污染水样中选出两个最具代表性的样品（污染1＃污染2＃）为例，加以说明。

1、乳糖发酵实验中产酸与产气的判断：分别取10ml水样接种到5只10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，置于36℃±1℃的培养箱内培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气，则报告总大肠菌群阴性，如产酸产气则进行下一步实验。

实验六水中大肠菌群(Coliform group)细菌的检测一、实验目的1.采用多管发酵法，以最近似数的方式测定水中大肠菌群数。

2. 掌握微生物实验中无菌操作技术方法。

二、实验原理如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原苗污染而引起肠道传染病。

由于肠道病原菌在水中数量较少，故从水中特别是自来水中分离病原菌常常非常困难。

大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。

即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源是否受粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。

一般规定每1000ml自来水中大肠菌群细菌不得超过3个．大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌，包括四种细菌：大肠埃希氏杆菌、枸椽酸盐杆菌、产气杆菌及副大肠杆菌。

它们有相似的生化反应，能发酵葡萄糖，产酸产气，但发酵乳糖的能力不同。

当将它们接种到含乳糖的远滕氏培养基上生长时，四种菌的反应不一样，大肠埃希氏杆菌的菌落呈紫红色带金属光泽；枸椽酸盐杆菌的菌落呈紫红或深红色；产气杆菌的菌落呈淡红色，中心色深；副大肠杆菌的菌落无色透明(因不利用乳糖所致)。

本试验采用多管发酵法，以最近似数的方式来记载，这一数字是根据概率公式来估算，有大于实际数字的倾向，在增加每种稀释度的试管重复数后，可减少偏差。

本法除了用于检测水样(淡水或海水)外，尚可用于泥浆、沉积物、污泥等的检测。

测定时先将这类固体或半固体样品预先称重，再加水稀释，可取50g 样品，置于盛有450ml灭菌磷酸盐缓冲液并装有玻璃珠、石英砂的锥形瓶中，振荡l~2min，便成10-1稀释，以用于检验。

三、实验材料1.培养基；1.1乳糖胆汁液体培养基：蛋白胨：20.0g， 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液：l ml，乳糖：5.0g，胆酸钠：5.0g将蛋白胨、乳糖、胆盐加热溶解于1000m1蒸馏水中，调pH值至7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液l ml，充分混匀，分装于有倒置杜汉氏小管的试管中，注意小管中不得有气泡，115ºC灭菌20min。

多管发酵法测定水中大肠菌群
多管发酵法测定水中大肠菌群
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多管发酵法测定水中大肠菌群
一、试验目标 二、试验原理 三、试验材料 四、试验步骤 五、试验汇报
多管发酵法测定水中大肠菌群
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一、试验目标
1、学习测定水中大肠菌群数量多管发酵法。 2、了解大肠菌群数量在饮水中主要性。
多管发酵法测定水中大肠菌群
划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 ℃培养 18～24 h，将符合以下特征菌落进行染色镜检。
深紫黑色，有金属光泽；
紫黑色，不带或略带金属光泽；
淡紫红色，中心颜色较深。
多管发酵法测定水中大肠菌群
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（3）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌菌株重复初
步发酵试验。并依据初发酵管试验阳性管查表， 即得大肠菌群数。
多管发酵法测定水中大肠菌群
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2）平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外，还有其它细菌可能引 发糖类发酵，所以需要深入证实。
将初发酵管中已发酵菌液接种于伊红美兰 培养基，37 ºC培养24 h，依据菌落特征（带关 键、有金属光泽深紫色菌落），挑取可能为大 肠菌群菌落制片，经革兰氏染色，深入证实是 否为大肠菌群。
水样稀释： 10-1与10-2
接种：分别吸收1ml 10-2 、 10-1和原水样接入装 有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管 ；另取10ml原 水样接入装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 ， 混匀后，37 ℃培养24 h，24 h未产气继续培养48 h。
多管发酵法测定水中大肠菌群
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（2）平板分离 将经24 h和48 h培养后产酸产气发酵管，分别
2.思索题
（1） 何谓大肠菌群，它主要包含哪些细菌属？

水中总大肠‎菌群的测定‎—多管发酵法‎一．原理总大肠菌群‎可用多管发‎酵法或滤膜‎法检验。

多管发酵法‎的原理是根‎据大肠菌群‎能发酵乳糖‎、产酸、产气，以及具备革‎兰氏染色阴‎性，无芽孢，呈杆状等有‎关特性，通过三个步‎骤进行检验‎求得水样中‎的总大肠菌‎群数。

试验结果以‎最可能数（most proba‎b le numbe‎r），简称MPN‎表示。

三．仪器(1)高压蒸气灭‎菌器。

(2)恒温培养箱‎、冰箱。

(3)生物显微镜‎、载玻片。

(4)酒精灯、3mm接种‎环。

(5)培养皿（直径100‎m m）、试管（5×150mm‎），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000m‎L）、锥形瓶（500、1000m‎L）、采样瓶、移液枪。

四．培养基及染‎色剂的制备‎1．乳糖蛋白胨‎培养液：将10g蛋‎白胨、3g牛肉膏‎、5g乳糖和‎5g 氯化钠‎加热溶解于‎1000m‎L蒸馏水中‎，调节溶液p‎H为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙‎醇溶液1m‎L，充分混匀，分装于试管‎中，于121℃高压灭菌器‎中灭菌15‎m in，贮存于冷暗‎处备用。

2．三倍浓缩乳‎糖蛋白胨培‎养液：按上述乳糖‎蛋白胨培养‎液的制备方‎法配制。

除蒸馏水外‎，各组份用量‎增加至三倍‎。

3．伊红美蓝培‎养基：①贮备培养基‎的制备：于2000‎m L烧杯中‎，先将20g‎琼脂加到9‎00mL蒸‎馏水中，加热溶解。

再加2.0g邻酸二‎氢钾及10‎g蛋白胨，混合使之溶‎解，用蒸馏水补‎充至100‎0mL，调节溶液p‎H值为7.2～7.4。

趁热用脱脂‎棉或绒布过‎滤，再加入10‎g乳糖，混匀后定量‎分装于25‎0mL或5‎00mL锥‎形瓶内，于121℃高压灭菌1‎5min，贮于冷暗处‎备用。

②平皿培养基‎的制备：将上述制备‎的贮备培养‎基融化。

根据锥形瓶‎内培养基的‎容量，用灭菌吸管‎按比例分别‎吸取一定量‎已灭菌的2‎%伊红水溶液‎（0.4g伊红溶‎于20mL‎水中）和一定量已‎灭菌的0.5%美蓝水溶液‎（0.065g美‎蓝溶于13‎m L水中），加入已融化‎的贮备培养‎基内，并充分混匀‎（防止产生气‎泡），立即将此培‎养基适量倾‎入已灭菌的‎空平皿内，待冷却凝固‎后，置于冰箱内‎备用。