非编码RNA检测技术的研究进展

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）技术
生
命活动的发生是一系列相关基闪序列或表达水平改变的积 累，从总体水平上检测基因表达谱的变化，对解释各种生命
活动尤为重要。ＳＡＧＥ是一种高通量的研究技术，通过逆转 录得到ｃＤＮＡ，从而获得ＳＡＧＥ双标签，然后，通过连接、扩增 双标签片段并进行克隆、测序，以同一标签在某组织中出现 的频率，反映该标签所代表的基因在该组织中的表达丰度。 与微阵列芯片技术相比，ＳＡＧＥ可在未知任何基因或ＥＳＴ序 列的情况下，对靶细胞进行研究，具有显著的优越性。自 １９９５年Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ建立ＳＡＧＥ技术以来，该技术被广泛应用 于人类肿瘤ＲＮＡ在其胚胎发育不同时期的表 达变化‘引。 ２．４微阵列芯片检测技术微阵列芯片以高密度阵列为特 征，在微阵列上固定大量探针分子，并将标记样本与微阵列
ａｃｉｄ，
ＬＮＡ）作为正向引物，并用通用引物（反向引物）进行双向扩 增¨“。锁核酸这种特殊的双环状核苷酸衍生物的使用，能
列，检测特定的结合在每个片段上的碱基，从而进行基因转
录本的测序。 Ｓｏｌｅｘａ方法可在一个反应中同时加入４种核苷的标签，
明显降低核糖结构的柔韧性，增加磷酸盐骨架局部结构的稳
定性，增强杂交核酸链的亲和力。引物延伸ＰＣＲ具有灵敏 度高，检测范围广和通用性好等特点【１８‘１９Ｊ。 ２．２．３加ｐｏｌｙ（Ｔ）接头荧光定量ＰＣＲ。该方法通过加ｐｏｌｙ
基金项目 国家高技术研究发展计划（８６３）资助项目（２００７ＡＡ０２．
Ｚ１６５）。
技术进行的高丰度ｎｃＲＮＡ，如ｔＲＮＡｓ 或小核糖体ＲＮＡ。 ２．２实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ技术实时荧光定量ＰＣＲ技 术是一种高通量、灵敏的基因表达检测技术，常用于蛋白编 码基因表达检测，也被广泛地应用于ｍｉｃｍＲＮＡ或其他 ｎｅＲＮＡ的表达检测。该技术能有效地发现疾病或组织特异 性的ｍｉｅｒｏＲＮＡ生物标志物，同时，还被用于ｍｉｃｒｏＲＮＡ对干 细胞分化的研究¨“。通过该技术，可定量监测目的基因的 表达情况，筛选生物学功能相关的ｎｅＲＮＡ。 ２．２．１茎环引物荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ。该技术最早由Ｃｈｅｒｔ等 建立¨“，并被成功用于人类疾病相关ｍｉｅｒｏＲＮＡ的定量研 究¨…。检测灵敏度低和特异性差，曾是ｍｉｃｒｏＲＮＡ定量研究 的主要障碍，但茎环引物特殊的碱基堆积与空间约束力使荧 光定量检测具有更好的特异性和更高的灵敏度¨引。碱基堆
在组成人类基因组的３０亿个碱基对中，９ｒ７％的转录产 物为非编码ＲＮＡ（ｎｏｎ．ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ）…，其中包括小 ｎｅＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ和ｐｉＲＮＡ），中等长度ｎｅＲＮＡ（５０—
５００
了机体免疫、肿瘤发生等过程¨¨。目前，在ｎｃＲＮＡ的发现、 鉴定及功能研究等方面非常活跃，现有的研究结果表明，还 有大量的ｎｅＲＮＡ有待被进一步发现和鉴定。
术建立了与人类疾病相关的ｍｉＲＮＡ表达检测方法Ⅲ’。
２．５
Ｓｏｌｅｘａ测序法Ｓｏｌｅｘａ测序法是新发明并迅速得到广
泛应用的一种高通量基因表达检测技术，该方法是利用单分 子阵列来测定基因的表达情况。首先，将核酸从细胞中提 取，将其片段化为１００—２００碱基大小，分别有接头的芯片上，经反应后，将不同片段扩增。 在每个循环中，利用边合成边测序（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
安徽农业科学。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａ咖．ＳＣｉ．２０１０。３８（１１ Ｊ：５５４６—５５４８
责任编辑王强责任校对傅真治
非编码ＲＮＡ检测技术的研究进展
李艳，丁先锋＋，苗杰
（浙江理工大学生命科学学院，浙江杭州３１００１８）
摘要非编码ＲＮＡ（ｎｏｎ．ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ，ｎｅＲＮＡ）广泛存在于生物体中，不编码蛋白质，以ＲＮＡ的形式在许多生命过程中发挥着重要的作 用。随着越来越多ｎｃＲＮＡ生物学功能的揭示，检测ｎｃＲＮＡ在不同生理和病理状态下表达谱的变化，已迅速成为研究的热点。为了将 ｎｅＲＮＡ更好地应用于农业生产和生物医学研究，笔者对ｎｃＲＮＡ最新检测技术的原理与应用进行了综述。
２
ｎｔ）和长ｎｃＲＮＡ（＜５００ ｎｔ）瞄ｏ。近年来，人们已将注意力
ｎｃＲＮＡ的检测技术 近年来，随着越来越多ｎｃＲＮＡ生物学功能的揭示，检测
逐渐扩展到这部分非编码ＲＮＡ的鉴定和功能研究上，并在 ｍｉＲＮＡ研究领域取得了突破性进展。大量研究表明，非编码 ＲＮＡ在生物体的生长、发育和凋亡等过程中起着重要的调控 作用，并与人类肿瘤的发生密切相关。此外，也有研究表明， 在各种胁迫条件下，植物体会诱导表达一些特定的小ＲＮＡ 对环境变化作出应答。
（Ｔ）接头的办法，使ｓＲＮＡ逆转录得到的ｃＤＮＡ长度增加，可
以直接进行荧光定量ＰＣＲ反应。具体步骤：首先，将总 ＲＮＡ、包括ｓＲＮＡ进行多聚腺苷酸化；然后，用加ｐｏｌｙ（Ｔ）的 接头进行逆转录，得到ｃＤＮＡ；最后，用ｓＲＮＡ特异性的前引 物和与ｐｏｌｙ（Ｔ）接头序列互补的反向引物，进行实时定量 ＰｃＲ反应．检测ｓＲＮＡ的表达情况¨ｏ驯。利用该方法．可分 析一些Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ无法分析的ｓＲＮＡ组织表达情况，因此 被广泛应用于动植物ｓＲＮＡ的表达研究中。同样，荧光定量 技术在蔬菜致病变种的检测研究中也发挥着重大作用．ｚ“。 此外，该技术还被广泛应用于基因芯片等筛选结果的验证。
关键词非编码心Ａ；检测技术；实时荧光定量ＰｃＲ；微阵列芯片；Ｓｏｌｅｘａ测序技术
中图分类号Ｑ５２ 文献标识码Ａ 文章编号０５１７—６６１ｌ（２０１０）１ｌ－０５５４６—０３
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆ Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ＬＩ Ｙａｎ
ｅｔＡｂｓｔｒຫໍສະໝຸດ ｃｔａｌ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１００１８） Ｎｏｎ．ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）ｉｓ ｋｎｏｗｎ ｉｎ ａ ｗｉｄｅ ｖａｉｌｅｔｙ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｗｈｉｃｈ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｅｎｃｏｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｕｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ
采用边合成边测序，可减少因二级结构造成结果的缺失，并
具有所需样品量少、高通量、高精确性的特点，可同时检测上
亿个核苷酸片段。因此，在同～个芯片或几个芯片上花费很
少的成本就可测定全基因组。Ｓｏｌｅｘａ技术的应用，为目前遗 传分析和功能基因组等研究提供了全新的技术手段，Ｃｈｅｎ 等人利用该技术在三文鱼中发现了１１３条新ｍｉＲＮＡ，并且用
鉴定ｍｉＲＮＡ著称，但相对于传统、普遍使用的ｍｉＲＮＡ定量 方法还存在一定的不足，这可能是由于测序深度不足，或一 些ｍｉｃｒｏＲＮＡ存在特殊修饰而带来的问题。 ２．６表面增强拉曼光谱法（ｆｕｒｆａｃ七一ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ
ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ
ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ｌ
ｎｅＲＮＡ在不同植物生理、动物或人病理状态下表达谱的变 化，迅速成为生理和病理研究的热点。在这种情况下， ｎｅＲＮＡ的表达检测量ＰＣＲ，还包括新近发展 起来的基因芯片技术、高通量测序技术以及表面增强拉曼光 谱法。
２．１
ｃＤＮＡ克隆策略长度在２０一５００ ｂｐ的ＲＮＡ大多为
ｎｃＲＮＡ。ｎｃＲＮＡ可将由变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离到的 ｎｃＲＮＡ进行逆转录后加—１５ ｎｔ，而 得不到全长的ｅＤＮＡ克隆¨“，因而常采用在３’端加上Ｃ一尾 巴，在Ｔ４ ＲＮＡ连接酶的作用下连上寡聚核苷酸接头，最后对 连接产物进行ＲＴ．ＰＣＲ扩增ｏｔ３１。Ａｌｅｘｅｉ等人在此基础上，对 ＳＭＡＲＴ（Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ
２．３
ＲＴ—ＰＣＲ和生物芯片技术进行了验证陋１。有人曾通过新一 代测序新技术，分析以水稻为代表的农作物大规模分子设计
育种，提出通过对水稻核心种质育种材料体系的全基因组测 序，开发功能性分子标记和特异基冈芯片，缩短将基础研究 成果应用于实际育种生产的时间，为真正进入分子设计育种
时代奠定基础‘２“。尽管Ｓｏｌｅｘａ测序技术以高效率、高精确
ｍａｎｙ ｋｅｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｗｉｔｈ ｌｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ．ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｃＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｓ ｂｅｃｏｍｉｎｇ ａ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｈｏｔｓｐｏｔ．Ｗｅ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗｅｓｔ ｄｅｔｅｃｄｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆ ｎｃＲＮＡ １．０ｒ ｔ｝｜屺ｂｅｔｔｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｃＲＮＡ ｉｎ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃ・
Ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ。
ＳＢＳ）的原理，在单分子阵列中加入４种荧光标记染料的核苷
和聚合酶，在酶的作用下，每个单链ＤＮＡ分子通过互补碱基 的配对被延伸，通过ＣＣＤ采集荧光信号，快速扫描整个阵
ｃＤＮＡ的合成，并在小ＲＮＡ的５’端引入通用引物结合区域。
在定量ＰＣＲ的扩增过程中，使用锁核酸（１０ｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ Ａｔ ５’ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）
性∞ｊ，以及参与胁迫下植物生理代谢的调节№１。某些ｌｌｌｉ—
ｃｒｏＲＮＡ还能在逆境，如过冷、干旱的环境中诱导表达盯“’。 随着研究的深入，人们将会发现更多的与胁迫有关的ｍｉＲ・ ＮＡ，通过检测非编码ＲＮＡ，研究与其相关的靶标蛋白，进而 解释特殊的生理机制，如从ｍｉＲＮＡ调节途径的角度，探讨病 毒侵染和植物生理特征变化的关系，对病毒致病机理的研究 提供基础等一Ｊ。在动物中，特别是在疾病的发生过程中， ｎｃＲＮＡ所起的作用也不容忽视。ｎｃＲＮＡ与中枢神经系统的 功能和调控相关，其中，ｍｉＲＮＡ的失调直接与神经变性疾病 的发病机制相关，可作为疾病潜在的生物标记¨０‘。此外， ｎｃＲＮＡ的表达异常可导致人类恶性肿瘤的发生。因为其参与