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第五章 诊断酶学

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卫生部“十二五”规划教材全国高等医药教材建设研究会规划教材首都医科大学王培昌一、概述二、酶测定技术三、常用酶及同工酶测定的临床应用第一节概述一、酶的概念与特征（一）酶的组成、结构与功能1.酶的本质和特征2.酶的结构和功能（二）酶的催化作用机制1.酶活性中心是酶分子执行催化功能部位2.酶反应的诱导契合学说（三）酶的命名1.习惯命名法2.系统命名法（四）酶的分类与编号（一）酶的组成、结构与功能1.酶的本质和特征⑴酶的化学本质：绝大部分的酶是蛋白质，有些酶是核酸和酶蛋白组成的复合体，极少数酶是核酸。

⑵酶除了具有蛋白质的理化性质、一般催化剂的共同性质外，还具有极高的催化效率、高度的特异性（specificity）及催化作用的可调节性等特点。

⑶由酶所催化的反应称为酶促反应。

酶促反应过程中的几个概念：酶活性（activity）；底物（substrate）；产物（product）；激活剂（activator）；抑制剂（inhibitor）⑷核酶（ribozyme）：具有催化作用的核糖核酸。

2.酶的结构和功能⑴酶和一般蛋白质一样，具有一、二、三乃至四级结构。

单体酶（monomeric enzyme）寡聚酶（oligomeric enzyme）多酶体系（multienzyme）多功能酶或串联酶（tandem enzyme）⑵单纯酶（simple enzyme）：仅由氨基酸残基构成的酶。

结合酶（conjugated enzyme）：除含蛋白质外，还含有非蛋白部分（金属离子或小分子有机化合物），前者称为酶蛋白，后者称为辅因子。

（二）酶的催化作用机制1.酶活性中心是酶分子执行催化功能部位酶分子中能和底物特异结合并将底物转化为产物的区域称为酶的活性中心（active center），酶活性中心是由空间上彼此靠近的化学基团组成的具有特定空间结构的区域。

2.酶反应的诱导契合学说（induced fit hypothesis）在酶促反应中，酶与底物结合时，底物首先和酶分子上的活性中心相结合，形成酶-底物中间复合物（ES）。

在构象上相互诱导，致使活性中心与底物完全紧密结合，这一过程称为诱导契合学说。

（三）酶的命名1.习惯命名法根据酶所催化的底物、反应的性质以及酶的来源等进行命名。

此法虽较简单，但缺乏系统性，易造成混乱。

2.系统命名法国际酶学委员会于1961年提出了酶的系统命名法（又称EC 命名法）。

规定每一酶均有一个系统名称，它标明酶的底物与反应性质，底物名称之间以“︰”分隔开。

（四）酶的分类与编号1.根据酶所催化反应类型可将酶分为六大类，即：氧化还原酶类（oxidoreductases）转移酶类（transferases）水解酶类（hydrolases）裂解酶类（或裂合酶类）（lyases）异构酶类（isomerases）合成酶类…synthetases或连接酶类(ligases）‟2. 国际酶学委员会将每种酶用4个数字加以系统编号。

数字前冠以EC，数字之间用黑点隔开。

第一个数字表示酶的类别，第二个表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个表示酶的编号序数。

二、同工酶的概念与特征(一)同工酶的概念与特征同工酶是指催化相同化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。

同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征，这为同工酶用来诊断不同器官的疾病提供了理论依据。

(二)同工酶分类与命名1.分类根据同工酶的来源和结构不同，从基因角度可将其分为：单基因决定的同工酶、复等位基因同工酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。

2.命名至今尚无确切的方法，常以组织名称、亚基的数目和组成或发现地地名等命名。

酶同工酶种类相关疾病CK CK-BB,CK-MB,CK-MM(CK1,CK2,CK3)心梗、肌病、颅脑损伤、肿瘤LD LD1,LD2,LD3,LD4,LD5心梗、肌病、肺梗死、肝病、肿瘤ALP肝，小肠，骨，胎盘，肾肝胆疾病、骨病、妊娠、结肠炎、肿瘤ACP红细胞，前列腺，溶酶体前列腺癌、血液病、骨肿瘤γ-GTγ-GT1,γ-GT2,γ-GT3,γ-GT4肝癌、梗阻性黄疸AMY P-AMY(P1,P2,P3),S-AMY(S1,S2,S3,S4)急、慢性胰腺炎、腮腺炎ALT ALTs,ALTm心梗、肝病AST ASTs,ASTm心梗、肝病GP GP-BB,GP-LL,GP-MM(GP1,GP2,GP3)心梗、脑损伤、肾病、肌病GST GST1和GST2(GST-α),GST3(GST-μ),GST4和GST5(GST-π)肺癌、肝炎ALD ALD-A,ALD-B,ALD-C肝癌、肝炎、神经细胞癌NAG NAG-A,NAG-B,NAG-I肝病、肾病人体中几种重要的同工酶三、工具酶（一）工具酶参与的指示反应（二）酶循环法（三）代谢物浓度的酶法测定技术1.终点法（1）直接法（2）酶偶联法2.动力学法(一)工具酶参与的指示反应通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。

常用工具酶多为氧化还原酶类。

在临床生化检验中，许多项目的测定均有工具酶参与，最常用的有两类分光光度法：一类是利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢（H 2O 2），再加氧化发色剂比色；另一类是利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)H 的正/逆反应后，直接通过分光光度法或其他方法测定NAD(P)H 的变化量。

(二) 酶循环法酶循环法（enzymatic cycling methods）采用两类工具酶进行循环催化反应，使被测物放大扩增，从而使检测灵敏度提高。

目前临床上已应用于总胆汁酸的测定。

为了简化操作过程，并使酶试剂得以方便或反复使用，已有许多研究将水溶性的酶通过吸附、包埋、载体共价结合或通过酶分子间共价交联等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，这样制备的酶称为固相酶（或固定酶）（immobilized enzymes）。

（三）代谢物浓度的酶法测定技术1.终点法在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，测定反应达到平衡后待测物（底物）或产物变化的总量，即终点法（又称平衡法）。

(1)直接法：如果待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，如吸收光谱不同，则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析.(2)酶偶联法：如果酶促反应的底物或产物无可直接检测的成分，则可将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，而达到检测的目的，即为酶偶联法。

代谢物酶促终点法测定的基本条件是：①待测物浓度[S]应远小于其米氏常数Km，此时任何时刻的反应速率V=Vmax[S] / Km，呈一级反应；②反应配方中所用酶量（V）应足够大，而Km应小，以保证有较快的反应速度完成测定。

※终点法测定的实验设计中，主要应考虑以下问题：（1）工具酶的特异性：（2）Km大小要合适：（3）酶的用量（4）工具酶中的杂酶应低于允许限。

（5）反应平衡点：（6）附加剂：应不抑制酶的活性2. 动力学法根据米氏方程，当[S]<<Km，一般[S]/Km<0.2，最好<0.05，[S]+Km≈Km，此时呈一级反应，反应初速度v=k[S]。

如果能准确测定反应的初速度（v），采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度。

酶活性测定酶学测定方法酶质量测定固定时间法（fixed time assay）连续监测法（continuous monitoring assay）第二节酶测定技术一、酶活性测定（一）定时法测定酶活性（二）连续监测法测定酶活性（三）干扰因素（四）血清酶活性浓度测定的条件的优化（五）部分分析前因素对酶活性测定的干扰（六）酶活性浓度的单位（七）系数K值的计算与应用（八）临床酶学测定的标准化(一)定时法测定酶活性定时法是根据固定时间内底物消耗量或产物的生成量计算酶活性，这是早期测定酶活性浓度的方法。

用定时法准确测定酶活性浓度，必须了解不同酶促反应速率和时间的关系，应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在这段时间进行测定，避开延滞期和一级反应。

定时法中可能引起的误差(二)连续监测法测定酶活性连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。

1.直接法在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度等计算出酶活性浓度。

只有底物与产物之间，在理化性质等方面有显著差异时，才能使用直接法。

2.间接法采用酶偶联反应是间接法测定酶活性的主要技术特点。

(1)最简单的酶偶联反应（单底物反应且只有一个工具酶）模式为：Ex：被测定酶C：被检测物质Ei：指示酶Ex催化的反应称为始发反应，产生被检测物质产物C的反应称为指示反应。

(2)如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接起来，此反应称为辅助反应。

模式为：一般习惯将最后一个酶称指示酶Ei，其他外加的酶称为辅助酶（Ea）。

(3)偶联反应中存在几个时相：①预孵育期：反应一开始只存在底物A，不存在指示酶的反应。

②延滞期：加入底物启动反应，在启动后的一段短时间内，产物B开始出现并逐渐增加，但仍处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表测定酶的反应速率Vx 。

③稳态期：产物B增加到一定程度时，Ex和Ei催化的反应速率相同，达到了稳态期。

此阶段特定波长处（如340nm）吸光度才会有明显的线性变化。

酶偶联法测定ALT的吸光度变化(4)指示酶的选择①Vx/(Km)x=Vi/(Km)iVi：指示酶的用量Vx：测定酶的测定上限(Km)x：分别是测定酶(Km)i：指示酶的米氏常数②米-曼氏方程在酶偶联反应中，指示酶催化反应速率Vi的计算公式为：式中Vx为测定酶的测定上限，(Km)i为指示酶的米氏常数，P为中间产物浓度。

③McClure 介绍的另一种近似计算法计算延滞期时所需指示酶的量。

假定酶偶联反应如下：第一个反应为零级反应，第二个反应为一级反应。

如测定时间很短，[C]浓度不高时，指示酶催化反应速率Vi 可通过下列公式进行计算：式中t*表示延滞时间，(Km)i 为指示酶的米氏常数，F b 是在t*时产物B 为其稳态浓度的百分数，一般选用0.99。

(三)干扰因素1. 其他酶和物质的干扰2. 酶的污染3. 非酶反应4. 分析容器的污染5. 沉淀形成(四)血清酶活性浓度测定的条件的优化测定酶活性浓度方法所选择的测定条件应是酶促反应的“最适条件”，即指在所选择温度下能使酶促反应的催化活性达到最大。

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诊断酶学精品课件

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种类 凝血酶原、Ⅹ 胰淀粉酶、 LDH、AST、OCT等
因子、Ⅻ因子、 胰脂肪酶、 ALT、CK、
纤溶酶原、
胰蛋白酶、 MDH等
ChE、CER、 ACP、ALP
LCAT、脂蛋白
等
脂肪酶等
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6
血清酶的去路
与血清酶的半寿期有关
半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶， 在血清中持续时间长。
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10
四、酶分析
（1）酶活力测定：以酶为分析对象，检测生物样 品中酶的活性或含量。
（2）酶法分析：以酶为工具（分析试剂）测定酶 的底物、辅酶、活化剂、抑制剂等。
不同点： 目的、对象不同
相同点： 利用酶的专一和高效催化化学反应为基础
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11
Section 3 酶促反应动力学
一、米－曼氏方程 二、Km与Vmax 三、酶促反应进程曲线 四、影响酶促反应的因素
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12
一、米－曼氏方程
Michaelis 和Menten提出的酶作用的中间产物学说:
E+S
K1 K2
ES K3
E+P
1913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系 的
方程式，即米-曼氏方程(Michaelis-Menten equation):
V V max[S] Km[S]
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的减少量或产物的生成量。 酶活性测定优点：灵敏、容易、测定范围广
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20
一、酶活性浓度测定方法
1. 按检测方法分类
根据产物或底物的理化性质不同（颜色、浊度、pH、气体、 荧光、放射性） ➢ 量气法、分光光度法、荧光法 ➢ 其他方法（ 放射性核素法、离子选择电极法，旋 光法、极谱法、HPLC或生物发光法等）
临床医学检验技士考试辅导第五章 诊断酶学练习题

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第五章诊断酶学一、A11、下列哪项因素对ALP参考值范围影响最大A、性别B、年龄C、职业D、饮食E、地域2、何种酶检查对肝病早期诊断有较大价值A、AKPB、ASTC、ALTD、ALPE、γ-GT3、反映肝细胞受损，膜通透性增加的血清酶是A、γ－GTB、MAOC、ALTD、chEE、ALP4、根据国际生化学委员会的规定，酶的一个国际单位是指A、最适条件下，每小时催化生成1μmol产物的酶量B、37℃下，每分钟催化生成1μm ol产物的酶量C、25℃下，其他为最适条件，每分钟催化生成1μmol产物的酶量D、30℃下，每小时催化生成1μmol产物的酶量E、在特定条件下，每分钟催化1μmol底物产生变化所需的酶量5、LD属于哪种酶类A、氧化还原酶类B、转移酶类C、异构酶类D、裂解酶类E、水解酶类6、目前公认的诊断急性心肌梗死最有价值的生化指标是A、CK－BBB、CK－MBC、CK－MMD、LD1E、LD27、CK是由2个亚单位组成的二聚体，产生的同工酶有A、2种B、3种C、4种E、6种8、关于细胞酶的释放，正确的是A、不同组织中酶进入血中途径不一B、由于Ca2+进入细胞内，使膜孔隙增大C、细胞内外酶浓度差异，影响酶流动速度D、最容易释放入血的是胞质中的游离酶E、酶流动的速度和数量受多种因素影响9、确认肝癌术后有无复发时，应首选哪项试验A、GGTB、碱性磷酸酶C、ALTD、异常凝血酶原测定E、甲胎蛋白10、血清γ－谷氨酰转肽酶（GGT）在人体组织细胞中含量最多的器官是A、肝脏B、肾脏C、心脏D、胰E、肠11、门冬氨酸和α－酮戊二酸可以作为下列哪种酶的反应基质A、ALTB、ASTC、ALPD、GGTE、AMY12、下列对血清酶活力测定的描述哪一项是错误的A、可测定产物生成量B、可测定底物的消耗量C、需要最适pHD、需要最适温度E、与底物浓度无关13、酗酒者常引起明显升高的酶是A、ALTB、CKC、ALPD、ASTE、GGT14、GGT增高明显的疾病是A、肝癌B、胰腺癌C、急性肝炎E、心肌炎15、人体内含AST活性最高的器官是A、肝脏B、脑C、心脏D、肾脏E、肠16、下列哪种酶与心脏功能是否正常关系不大A、ASTB、ALPC、HBDD、LDE、CK17、年龄引起酶变化最明显的酶是A、ALTB、CKC、ALPD、ASTE、GGT18、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）在人体何脏器细胞含量最高A、心脏B、脑C、肝脏D、肠E、肾脏19、1，4－糖苷键是下列哪种物质分子中的主要化学键A、蛋白质B、脂肪C、氨基酸D、淀粉E、以上都不是20、ALT测定显著增高时可见于下列哪种疾病A、慢性肝炎B、乙型肝炎急性期C、胆囊炎D、心肌梗死E、肝癌21、酶法测定血清三酰甘油中用到的酶有A、甘油激酸酶B、脂肪酶C、甘油磷酸氧化酶D、过氧化物酶E、以上都是22、CK同工酶由几个亚基组成A、2B、3C、4D、5E、623、诊断急性肝炎最敏感的指标是A、血总胆红素测定B、碱性磷酸盐C、丙氨酸氨基转移酶D、血清蛋白定量E、血清蛋白电泳24、反映肝细胞广泛受损的酶学指标是A、ASTB、ALTC、γ－GTD、MAOE、胆碱酯酶25、关于酶活性和质量测定，错误的是A、测酶质量比测酶活性灵敏度高B、可以测到以前不易测定的酶C、免疫方法特异性低D、酶质量和酶活性存在不平行E、免疫方法测定同工酶简单方便26、无黄疸病人血清ALP明显升高，应考虑A、慢性活性肝炎B、胆囊炎C、肝硬化D、肝癌E、脂肪肝27、血中酶清除快慢的主要因素是酶的A、分布B、数量C、运送D、半衰期E、以上均对28、磷酸甘油氧化酶法测定血清三酰甘油时，其中苯酚及4－氨基安替比林是A、氧化剂B、显色剂C、还原剂E、皂化剂二、A21、男，51岁，胸痛发作24小时，伴心悸、气短、面色苍白。

第五章 酶学诊断

第五章 酶学诊断

固相酶和离子敏感型电极组成的生物传感器，可用 于测定由酶催化的反应底物
（三）代谢物浓度的酶法测定技术
1.终点法
直接法 酶偶联法
2.动力学法
第二节 酶活性浓度的测定技术
一、酶活性测定
根据测定方法分类： 量气法、分光光度法（最常用）、荧光 法、放射核素法、电极法和其它方法。 根据对酶促反应时间的选择不同分类： 定时法 连续监测法
优点:
能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反
应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，
可在较短时间内完成测定。
缺点： 要求高，要求能够精确地控制温度、pH值和底
物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装臵及自动
监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些
要求。
直接连续监测法： 特点： 使用各种分析手段，在不停止酶反应 条件下直接测反应体系中底物或产物的变 化，从而计算出酶活性浓度。 应用最多的方法为分光光度法。 应用最广的反应系统 • NAD(P)H，可以测定大部分的脱氢酶， • 色素原底物，其本身为无色或微黄色， 在酶作用下生成有色化合物，适用于测 定水解酶和一些转移酶。
酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正 代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的 90%～95%、底物消耗率为1%～5%。这样既可以近似 地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪 费。
5.鉴定酶的种类
Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只 与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。 不同种类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可 在规定的条件下测定其Km值加以鉴定。
相关疾病
心肌梗死、肌病、颅脑损伤、肿瘤
肝胆疾病、骨病、妊娠、结肠炎、肿瘤
LD1、LD2、 LD3、LD4、LD5 心肌梗死、肌病、肺梗死、肝病、肿瘤 前列腺癌、血液病、骨肿瘤 急慢性胰腺炎、腮腺炎
初级检验士考试临床化学练习题第5章诊断酶学

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第五章诊断酶学一、A11、LDH由H和M亚基构成的四聚体，组成几种同工酶A、2种B、3种C、4种D、5种E、6种2、下列反应中无过氧化氢产生的是A、尿酸氧化酶法B、总胆固醇酶法C、三酰甘油酶法D、尿素酶法E、葡萄糖氧化酶法3、骨ALP增加通常不见于A、骨折愈合过程B、恶性肿瘤转移性骨损伤C、Rickets病D、Paget病E、肝癌4、大多数酶促反应是A、可逆反应B、不可逆反应C、不受底物浓度的影响D、不受产物生成量的影响E、以上均不对5、人体含ALT最丰富的组织是A、肝细胞B、心肌C、骨骼肌D、红细胞E、肾脏6、下列哪种酶是血浆特异酶A、胆碱酯酶B、脂肪酶C、转氨酶D、乳酸脱氢酶E、淀粉酶7、诊断心肌梗死，特异性最好的酶是A、CK-MbB、LDHC、α-HBDHD、CPKE、GOT8、“酶胆分离”通常是哪种疾病的征兆A、急性心肌梗死B、肝癌C、肝坏死D、脂肪肝E、胆石症9、无黄疸患者血清ALP明显升高，应考虑A、脂肪肝B、胆囊炎C、肝硬化D、肝癌E、慢性活性肝炎10、酶活性测定方法中的平衡法又称为A、中止反应法B、终点法C、动力学法D、速率法E、连续检测法11、正常成人心肌组织中LDH同工酶的含量顺序为A、LDH1＞LDH2＞LDH3＞LDH4＞LDH5B、LDH2＞LDH1＞LDH3＞LDH4＞LDH5C、LDH3＞LDH1＞LDH2＞LDH4＞LDH5D、LDH4＞LDH3＞LDH2＞LDH1＞LDH5E、LDH5＞LDH2＞LDH1＞LDH3＞LDH412、连续监测法，常通过监测哪处波长吸光度的变化来计算LD酶的活性A、260nmB、280nmC、340nmD、410nmE、620nm13、多用于胰腺炎诊断的血清酶是A、CK和CK-MBB、ALP和AMYC、ALT和ASTD、AST和AMYE、AMY和LPS14、关于细胞酶的释放，正确的是A、不同组织中酶进入血中途径不一B、由于Ca2+进入细胞内，使膜孔隙增大C、细胞内外酶浓度差异，影响酶流动速度D、最容易释放入血的是胞质中的游离酶E、酶流动的速度和数量受多种因素影响15、连续监测法测定酶反应速度是指A、在反应速度变化恒定期间，酶反应的初速度B、在最适反应pH条件下，酶反应的初速度C、在37℃条件下，酶反应的平均速度D、在适宜的酶浓度条件下，酶反应的初速度E、在酶反应的最佳条件下，酶反应的平均速度16、下列有关同工酶的叙述哪一个是正确的A、同工酶的蛋白结构相同B、催化功能相同，理化性质不同C、同工酶的免疫学性质相同D、同工酶是由两个以上不同亚基组成的E、同工酶在细胞内的定位相同17、人体GGT含量最高的组织器官为A、肝脏B、胰腺C、肾脏D、心肌E、脑细胞18、ALT测定显著增高时可见于下列哪种疾病A、慢性肝炎B、乙型肝炎急性期C、胆囊炎D、心肌梗死E、肝癌19、一个酶活力的国际单位（U）是指A、在实验规定条件下，每分钟催化1mmol底物反应所需的酶量B、在实验规定条件下，每分钟催化1μmol底物发生反应所需的酶量C、在37℃条件下，每分钟催化1μmol底物发生反应所需的酶量D、在实验条件下，每秒钟催化1mol底物反应所需的酶量E、在最适条件下，每小时催化1mol底物发生反应所需的酶量20、属分泌性酶的是A、胆碱酯酶B、胰酶C、丙氨酸氨基转移酶D、乳酸脱氢酶E、肌酸激酶21、CK-MM含量最高的器官是A、心B、肝C、肾D、肺E、骨骼肌答案部分一、A11、【正确答案】D【答案解析】LDH是由两种不同的亚基（M、H）构成的四聚体，形成5种同工酶，即LDH1（H4）、LDH2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH4（H3M）、LDH5（M4）。