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4种方法提取口腔致病菌DNA效果的比较王宁;都佳寅;张卫军【摘要】目的:比较酚-氯仿方法、Chelex-100提取方法、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)提取方法及试剂盒提取口腔致病菌DNA的效果.方法:用4种方法提取具核梭杆菌、嗜酸性乳酸杆菌、粘性放线菌及变形链球菌的DNA,比较OD260、OD260/OD230及OD260/OD280数值,同时进行基因组及扩增后的目的基因电泳,检测DNA的完整性及对PCR的影响.结果:Chelex-100方法提取的样本所含DNA浓度较高,但蛋白类的杂质较多.除粘性放线菌外,其他3种方法去除蛋白类杂质效果的差异无统计学意义.CTAB法和酚-氯仿法都可以较好地去除碳水化合物类杂质,对嗜酸性乳酸杆菌,CTAB的效果最佳(P<0.05).粘性放线菌对试剂盒提取效果有很大影响.结论:对DNA纯度及完整性要求不高的后续实验,Chelex-100为首选方法,否则经典的酚-氯仿方法及改进后的CTAB方法为首选方法.不同的细菌种类显著影响试剂盒的提取效果.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2018(031)009【总页数】4页(P1253-1256)【关键词】DNA提取;聚合酶链反应;电泳【作者】王宁;都佳寅;张卫军【作者单位】天津中医药大学第二附属医院口腔科 ,天津市 300150;天津市南开医院口腔科;天津中医药大学第二附属医院口腔科 ,天津市 300150【正文语种】中文【中图分类】R780.2目前对口腔致病菌的检测方面，基因组水平检测手段的应用日益广泛[1]。
由于口腔致病菌具有量少、菌落成分复杂等特点，不同DNA提取方法所得样品的纯度、浓度及完整性等方面存在较大差异[2，3]。
本实验从目前常见的酚-氯仿方法、Chelex-100提取方法、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)提取方法及试剂盒这4种方法中，筛选1种适合提取口腔常见致病菌DNA的方法，减少后续实验假阴性的可能性,同时兼顾快速、经济等方面。
Chelex—100法提取DNA用于差异甲基化基因座检测的研究目的通过对Chelex-100提取法提取的DNA用于酶切的研究，为差异甲基化在法医实际工作中的应用性研究提供一种快速提取酶切底物的方法。
方法HhaⅠ酶切基因组DNA，PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳检测，254 nm紫外灯下观察。
结果Chelex-100提取法提取的杂合子样本DNA加酶组只观察到来自父源的等位基因片段，而未加酶组能够观察到来自父源和母源的等位基因片段。
结论Chelex-100提取法提取的DNA能够作为酶切底物应用于差异甲基化基因座的研究。
[Abstract] Objective To provide a method of rapid extraction of enzyme substrate for differential methylation applied research in forensic practice by the study of the Chelex-100 extraction to extract DNA. Methods Genomic DNA was digested by Hha Ⅰ，with PCR amplification，detected with 2% agarose gel electrophoresis and observed under ultraviolet lamp，whose wavelength was 254 nm. Results The DNA samples with enzyme extracted by Chelex-100 from heterozygous observed was only the paternal allele fragments，while the paternal and maternal allele fragments were observed in the control group. Conclusion The DNA extracted with Chelex-100 extraction can be used as enzyme substrate，which is applied to study the differential methylation gene loci.[Key words] Differential methylation；polymerase chain reaction；Chelex-100越来越多的研究资料表明，来自双亲的同源染色体或者等位基因有功能上的差异：有些只有父源的基因有转录活性，而母源的等位基因则一直处于沉默状态，另一些基因的情况则相反。
自20 世纪50 年代Wat son 和Crick 提出DNA 双螺旋模型以来,分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展。
DNA 作为分子生物学研究的基础,在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深入,在此基础上产生的基因工程技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用。
研究和应用DNA 的基础是提取纯化结构完整的DNA ,为此针对不同来源的DNA 建立了不同的提取纯化方法。
本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物来源的DNA 的传统提取方法及近年来诸多的改良方法进行综述。
1 动物来源的DNA 的提取1. 1 经典提取方法酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法是提取DNA 最为经典的方法,目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的,这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞。
在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质,再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。
甲酰胺法是利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA 的结合,然后利用透析来处理DNA 样品。
这些经典方法获得的DNA 纯度很高,能够满足各种试验的要求,但操作繁琐,用时长,且所用试剂具有一定的毒性。
1. 2 玻璃棒缠绕法该法用盐酸胍裂解细胞,然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上,用一个带钩的或前端为U 形的玻璃棒在这两层液体的交界面慢慢搅动,沉淀出的胶状DNA 缠绕在玻璃棒上。
玻璃棒上的DNA 经多次乙醇浸泡并于室温下蒸干乙醇,由胶状逐渐回缩,然后浸入TE中过夜,使其重新吸水膨胀进而和玻璃棒分离。
这种方法对操作技术要求较高,但简单快速。
1. 3 血细胞DNA 的快速提取法采用非离子变性剂NP40 (乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解细胞,提取细胞核,然后用酚/氯仿抽提DNA。
这样从血液中分离获得的DNA 纯度高,能够满足各种临床检验和实验的需要。
也可采用NP40 和Tween- 20 同时作用破碎细胞膜,以避免SDS对以后步骤的负面作用。
DNA提取的几种方法(1)浓盐法：利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。
在提取过程中为抑制组织中的DNase 对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA 与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA. （3）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。
此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。
此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 .（4）水抽提法: 利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.真核细胞DNA的制备一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA 以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
全血中DNA 6种提取方法的比较畅晶晶;张素华;李莉【期刊名称】《法医学杂志》【年(卷),期】2009(025)002【摘要】目的比较经典有机法、改良有机法、常规Chelex-100法、IQ法、Qiagen法及SP法6种方法在提取DNA纯度和得率上的差异.方法收集10名健康志愿者的静脉全血各5mL,分别采用6种方法提取基因组DNA,通过紫外分光光度仪和荧光定量分析技术检测产物的纯度和浓度,计算得率,并使用统计软件对结果进行分析.结果常规Chelex-100法所得DNA的纯度明显低于其他方法,而另外5种方法所得DNA纯度的差异不具有统计学意义.改良有机法得率最低,IQ法得率最高.统计结果表明试剂盒方法抽提全血DNA的得率明显高于经典有机法、常规Chelex-100法和改良有机法,其差异具有统计学意义.结论与有机法和常规Chelex-100法相比,高质量试剂盒类方法更有利于法医学检材的DNA抽提.【总页数】4页(P109-111,114)【作者】畅晶晶;张素华;李莉【作者单位】复旦大学上海医学院法医学系,上海200032;司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室,上海200063;司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室,上海200063;苏州大学医学部法医学系,江苏苏州215123;司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室,上海200063【正文语种】中文【中图分类】DF795.2【相关文献】1.高质量竹黄菌全基因组DNA的提取方法比较 [J], 黄青青;乙引;魏洪美;任锡毅;刘永翔2.烟粉虱全基因组DNA四种提取方法的比较 [J], 戴恬美;吕志创;万方浩3.全血中DNA的5种不同提取方法比较研究 [J], 黄大鹏;陈建华4.黑曲霉Aspergillus niger全基因组DNA提取方法的改良与比较 [J], 蔡程山; 王雨; 白飞荣; 翟磊; 张天赐; 胡海蓉; 姚粟5.三种全血基因组DNA提取方法的比较 [J], 周红伟;田存章;张少恒;缑小曼;张艺丹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
3种方法联合运用提取人体脱落上皮细胞DNA郭燕霞;陈松;刘开会【摘要】目的寻求提高法医物证检验中附有人体脱落细胞载体检材的DNA检出率的方法. 方法根据案件检材的具体条件,选择3种提取方法即Chelex-100法、Chelex-100联合有机法和Chelex-100联合磁珠法. 结果采用了分步提取DNA法,可充分、有效地提取微量DNA,提高了人体脱落上皮细胞有效DNA的检出率. 结论根据第一步提取方法的检测结果,来调整下一步的提取策略,如是否加以纯化浓缩,可增加人体脱落上皮细胞有效DNA的检出率.【期刊名称】《法医学杂志》【年(卷),期】2009(025)001【总页数】2页(P42-43)【关键词】法医遗传学;提取法;脱落上皮细胞【作者】郭燕霞;陈松;刘开会【作者单位】公安部物证鉴定中心,北京,100038;公安部物证鉴定中心,北京,100038;公安部物证鉴定中心,北京,100038【正文语种】中文【中图分类】DF795.2在法医物证的实际检案中，越来越多的案件由于案件本身性质、作案过程及犯罪嫌疑人的反侦察意识增强等原因，在一些现场勘查中，很难发现血斑、精斑、毛发、烟头等常规生物检材。
随着DNA技术的不断发展，附有人体脱落细胞的载体检材成为当前法医界一个令人关注的热点，是许多案件侦破的关键证据[1-2]。
笔者结合日常办案时对人体脱落细胞检材的检验经验，根据案件检材的具体条件，分别采用了三种阶梯式提取方法。
1.1 材料1、2、3a和3b号检材均选自日常检案中疑载有人体脱落上皮细胞的案件检材。
其中1号检材为犯罪嫌疑人在凶杀案现场遗留的一只旧拖鞋，脚底部可见大量脱落上皮细胞。
2号检材提取于一火车上无人认领的行李包中的一件衬衣，包内藏有毒品。
3号检材为某杀人灭尸案嫌疑人家中搜到的疑为受害人（一老年妇女）的手表及戒指，其上无明显肉眼可见的可疑物质。
1.2 DNA提取1号检材取纱线反复擦拭转移拖鞋上脚底接触面的可疑人体脱落上皮细胞；2号检材取其领部与人体皮肤经常接触部位的适量布片（若领部有小毛球优先选用）；3号检材分别对可能较经常接触人体皮肤的部位，用纱线反复擦拭转移，手表擦拭物编号为3a，戒指擦拭物编号为3b。
DNA提取方法原理简介DNA是脱氧核糖核酸，是绝大多数生物的最主要的遗传物质。
随着生命科学技术的发展，从生物样本中提取DNA的方法也日益多样、成熟。
下面就几种常见的DNA提取方法的原理作个简介。
1 酚氯仿法酚氯仿法为DNA提取的经典方法，价格较低。
加入Tris饱和酚能使蛋白质变性，令DNA与组织蛋白质分开，同时抑制DNase的作用，保护DNA免于降解。
随后加入的氯仿/异戊醇经过混匀和离心后，能使溶液分为上层水相和下层有机相。
由于DNA存在于水相，蛋白质等杂质存在于有机相，这样就能使DNA与其他杂质分开。
吸取上层水相后，加入无水乙醇能使DNA从溶液中沉淀下来，经过离心去除上清液就能得到DNA沉淀了。
可以再使用75%乙醇洗涤一次，去除残留的一些有机物，使DNA更纯。
最后等乙醇挥发干燥后，加入TE缓冲液就能得到理想的DNA样本。
2 Chelex-100法Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学树脂，可以螯合多价离子。
Chelex-100法提取DNA是一种快速方便的方法，但DNA模板的纯度比较低，不适合长期保存。
Chelex-100溶液与血液样品等混匀后，通过煮沸、离心等步骤，可以使样品中大部分蛋白质变性，金属离子被Chelex-100螯合，从而使样品上清液的DNA模板能用于后续反应。
3 膜吸附法常用硅胶膜作为吸附DNA的载体。
部分的商品化DNA提取试剂盒会采用这种方法。
提取的DNA纯度高，效果好，但试剂盒成本较高。
其原理是在高盐缓冲液条件下，硅胶膜会吸附DNA，经过数次缓冲液洗涤离心后，吸附在膜上的DNA已经很纯，这时再用适当体积的低盐TE缓冲液进行洗脱。
4 磁珠法经过特殊表面处理的磁珠，在缓冲液条件下对DNA有很强的吸附力。
部分的商品化DNA提取试剂盒会采用这种方法。
提取的DNA纯度高，效果好，但试剂盒成本较高。
其原理是在缓冲液条件下，磁珠能吸附DNA，通过使用磁力棒能使磁珠聚集，去除含杂质的上清液。
法医实验室几种常用DNA提取方法及比较法医实验室几种常用DNA提取方法及比较(一)Chelex100法原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。
在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。
检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。
方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于0.5ml离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,000rpm离心5min，上清丢弃，管底留约20μl左右液体及检材基质，加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15mi n至数10小时不等，100℃8min，13,000rpm离心5mim，上清备用。
评述：1、Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法，Chelex100法是万能的。
目前，我们一切纯化方法都在Chelex100法的基础上进行，Chelex100法又不是万能的。
2、Chelex100法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制PCR反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。
所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。
特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。
DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜一个坑”，防止混乱检材。
肝素抑制PCR反应，血红素抑制PCR反应，所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。
在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下，多洗是检验成功所必须的。
评述与展望Rev i ew and P r og r ess人体硬组织DNA 提取的研究进展黄娅琳1, 2*陈逸怡11 南京森林警察学院, 南京, 210023;2 国家林业局森林公安司法鉴定中心, 南京, 210023* 通讯作者, huangy a li************摘要牙齿、指(趾)甲、骨骼等硬组织由于具有不易受外界污染、保存时间长等优点成为法医物证检验中的常用检材。
人体硬组织硬度高、DNA 含量低，且DNA 包埋在大量的角质蛋白、钙质内，其DNA 提取的难度较大。
本文旨在对从人体硬组织中提取DNA 的方法进行综述。
关键词牙齿, 指(趾)甲, 骨骼, DNA 提取方法The Research Progress of the Extraction of DNA from Human Calcareous Tis suesHuang Y alin1, 2*Cheng Yiyi 11 N a nj i ng Forest Pol i c e C ol l e g e,N a nj i ng,210023;2 W il dl i f e M a t e r i a l Ev i denc e A ppr a i sa l Center of the State Forestry A dm i ni s tr a t i on,N a nj i ng, 210023* Corresponding author, huangy a li************DOI: 10.13417/j.g a b.033.000920Abstract Some of the calcareous tissues have the advantages that they can hardly be polluted so as to be preserved for a long time. The human calcareous tissues are full of so much calcium and keratin protein that the DNA are em-bedded in them, which is difficult to extracted. The methods about extraction of DNA from calcareous tissues are summarized in this paper.Keywords Teeth, Fingernails, Bones, Extraction method of DN ADNA 的提取是分子生物研究的基础技术，提取的DNA 的纯度及结构完整性是进行基因工程研究所必需的条件(张宁和王凤山, 2004)。
四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较作者：黄幼生，宋伟伟，邓晓佳，罗志飞，解娜【摘要】目的：探讨从微量福尔马林固定石蜡包埋组织（formalin fixation and paraffin embedded tissues，FFPET)中提取DNA的简单而高效的方法。
方法：采用Chelex100提取法、酚氯仿抽提法、单纯消化法、水煮法4种方法提取组织DNA；应用聚合酶链反应扩增100～500bp长度DNA片段，然后进行电泳分析，1年后重复PCR电泳分析。
结果：小于200bp长度DNA片段扩增，Chelex100提取法、单纯消化法阳性率分别为88.8%、78.8%，明显优于酚氯仿抽提法（15.0%）（P<0.01）及水煮法（21.3%）（P<0.01）。
随着扩增长度的增加，PCR扩增效率逐渐降低，Chelex100提取法PCR反应总阳性率为82.5%，单纯消化法为66.5%，水煮法为13.4%，酚氯仿抽提法为13.4%。
1年后重复PCR总阳性率分别为80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。
结论：Chelex100提取法方便简单，适用于微量石蜡组织DNA扩增分析；单纯消化法及水煮法在一定条件下适用于微量石蜡组织短片段DNA的扩增。
【关键词】石蜡组织;DNA提取;Chelex100提取法［ABSTRACT］ Objective: To explore the simple and effective method for DNA extraction from microamount formalin fixation and paraffin embedded tissues (FFPET). Methods: The DNA was extracted by four different methods: Chelex100 extraction, phenol chloroform purification, simple digestion method andwater cooking method. The DNA fragment with 100500 bp length was amplified by PCR. It was analyzed by electrophoresis, and the procedure including PCR and analysis was repeated 1 year later. Results: For amplification of DNA less than 200 bp, the positive rates of Chelex100 group and simple digestion group were 88.8% and 78.8%, respectively, which were significantly effective than phenol chloroform purification group (15.0%) (P<0.01) and water cooking group (21.3%) (P<0.01). The amplication efficacy decreased as the length increase. The total positive rates of PCR were 82.5% in Chelex100 group, 66.5% in simple digestion group, 13.4% both in water cooking group and phenol chlorform group. And the positive rates in repeated assessment were 80.1%, 31.7%, 2.5% and 9.2%. Conclusions: Chelex100 extration method is easy and applicable in amplification analysis of DNA extracted from mircoamount paraffin embedded tissues; while simple digestion method and water cooking method are suitable to analysis of short length DNA fragment extracted from mircoamount paraffin embedded tissues.［KEY WORDS］ Paraffin embedded tissue; DNA extraction; Chelex100 extraction医院病理科存在大量各种疾病甲醛固定石蜡包埋组织（formalinfixed and paraffin embedded tissues， FFPET），为分子病理研究提供了大量的信息来源。
几种单头螨线粒体基因组提取方法的比较目的：比较几种单头螨线粒体基因组提取方法。
方法：参考文献的方法，分别用酚氯仿抽提法、Chelex-100抽提法和蛋白酶K法提取单头螨的总DNA，用COⅠ引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，比较不同抽提方法的结果。
结果：酚氯仿抽提法未能扩增出目的基因，而Chelex-100抽提法和蛋白酶K法均成功扩增出了目的基因。
结论：Chelex-100抽提法和蛋白酶K法均可用于单头螨线粒体基因的提取，前者获得的模板量大于后者，但是提取效率小于后者。
螨类是一种体型微小的节肢动物，在分类上属于蛛形纲（Arachnida）、蜱螨亚纲（Acari）的寄螨目（Parasitiformes）和真螨目（Acariformes）[1]。
螨体大小一般都在0.5 mm左右，有些小到0.1 mm，大多数种类小于1 mm。
其种类和分布都及其广泛，现在研究较多的是农业螨类和医学螨类，前者如叶螨，后者如尘螨等[2]。
尘螨的分泌物和死亡螨体的崩解物是一种重要的过敏原，可引起过敏性皮炎、过敏性哮喘等疾病[3-5]。
因目前大多数螨类都存在抗药性的问题，所以药物防制较为困难，目前在螨类的防制上遗传防制是目前研究的热点[6-7]。
而研究螨类的分子进化时常需要提取单头螨类的线粒体基因组，因螨类个体微小，单头螨DNA的提取极其困难[8]，笔者比较了文献介绍的几种常用的提取方法，用PCR扩增单头螨的线粒体COⅠ基因，结果报道如下。
1 材料与方法1.1 材料与试剂Chelex-100 （Sigma，C7901）、平衡酚（pH 6.7～7.8）、氯仿-异戊醇（24∶1）、无水乙醇、醋酸钠、1×TE液缓冲液、蛋白酶K（>600 U/mL，Thermo）、匀浆缓冲液、研磨缓冲液（STE）、10×Buffer（Mg2+Free）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP Mixture（20 mmol/mL）、Taq酶（5 U/μL）、DNA marker均购自上海生工。
改良Chelex-100法快速提取转基因农产品DNA蔡翠霞;肖维威;康文杰;周琳华;吴永彬;郑远金;马文丽【摘要】旨在建立一种从转基因农产品中快速提取DNA的方法.分别采用改良Chelex-100法和常规CTAB法提取转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA,测其浓度和纯度,PCR扩增其内源基因(Lectin)、启动子(CaMV35S)和品系特异性序列,对两种方法进行比较和评价,并研究两种方法提取的DNA在-20℃下保存一个月内的检测效果,以及改良Chelex-100法在玉米、小麦和水稻等其他转基因农产品的应用效果.结果表明,改良Chelex-100法能够快速在1.5h之内从样品中提取DNA,所提取的DNA直接用于PCR扩增反应,产物电泳条带清晰明亮.两种方法提取的DNA在-20℃下保存一个月内的检测效果未见明显差别.该方法在玉米、小麦和水稻等转基因农产品的应用效果稳定.因此,改良Chelex-100法提取的DNA可以作为PCR扩增模板用于转基因农产品检测.该方法具有经济、简便、快速、安全的特点,适合转基因农产品大规模筛选和鉴别.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)010【总页数】5页(P210-214)【关键词】Chelex-100法;CTAB法;DNA提取;PCR【作者】蔡翠霞;肖维威;康文杰;周琳华;吴永彬;郑远金;马文丽【作者单位】南方医科大学基因工程研究所,广州 510515;南方医科大学基因工程研究所,广州 510515;南方医科大学基因工程研究所,广州 510515;南方医科大学基因工程研究所,广州 510515;南方医科大学基因工程研究所,广州 510515;南方医科大学基因工程研究所,广州 510515;南方医科大学基因工程研究所,广州 510515【正文语种】中文近10余年来，现代生物技术的发展在农业上显示出强大的潜力，转基因作物应运而生，并逐步发展成为能够产生巨大社会效益和经济效益的产业。
以Chelex 100为介质抽提DNA近年来，DNA的分析技术已广泛地应用于肿瘤学的研究中。
获取DNA 的传统方法是以新鲜、-70℃或液氮保存的标本为材料，通过蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提而获取DNA。
1987年，Fey等［1］首先用NP40成功地从骨髓涂片中提取到较高分子量的DNA，用于Southern印迹分析。
国内的一些学者［2,3］也用相似的方法，从骨髓涂片中提取到DNA。
但这两种方法均需蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀等步骤，操作复杂，费时。
同时，需要在多个离心管之间转移，增加了标本间的交叉污染。
由于PCR技术对DNA样品的纯度和分子量的要求相对较低：对微量的DNA即可扩增，且只需待扩增的靶序列完整即可，不要求高分子量。
因此，部分降解的DNA均可作PCR检测。
由于PCR有极高的敏感度，需严格控制标本间的交叉污染，同时为了适应血液系统恶性肿瘤标本来源的特点，我们通过与常规酚、氯仿提取DNA进行比较，以了解以Chelex 100为介质提取DNA对PCR的影响。
一、材料和方法1.细胞：(1)细胞株：B-NHL细胞株-村林细胞。
(2)外周血有核细胞：由健康志愿者提供。
2.DNA获取率比较：(1)将不同培养瓶中已培养的村林细胞混合；A组取10份，5 ml/份；B组取10份，0.5ml/份。
(2)A组用酚、氯仿抽提DNA ：按Sambrook等［4］介绍的方法提取DNA。
(3)B组用Chelex 100为介质提取DNA：将已培养定量的村林细胞加入Eppendorf管中，加去离子水1ml，间歇振荡30 分钟。
15 000r/min离心5分钟，弃去上清液470 μl，加10% Chelex 100 170 μl，56℃温育30分钟。
超速振荡15秒，沸水浴8分钟，15 000 r/min 离心5分钟，上清液即为DNA模板［5］。
(4)DNA定量：在微量紫外分光光度计上分别测两种不同方法提取DNA的吸光度(A，曾称光密度OD)值，换算出DNA的浓度和获得量：DNA浓度(μg/ml)=OD×50×稀释倍数260DNA获得量(μg)=DNA浓度×DNA溶液体积 (5)统计学处理：采用两样本均数检验法进行检验。
DNA实验室常用的DNA提取方法有哪些？DNA实验室常用的DNA提取方法有Chelex100法、有机法、磁珠法、盐析法、NaOH法等，本文详细介绍这些方法。
(一)Chelex100法原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。
在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。
检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR 反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。
方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于0.5ml离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,000rpm离心5min，上清丢弃，管底留约20μl左右液体及检材基质，加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15min至数10小时不等，100℃8min，13,000rpm离心5mim，上清备用。
(二)有机法原理：有机法提取DNA一般是指用平衡酚(又叫饱和酚)、氯仿等按不同比例混合，采用不同方法提取DNA。
DNA易溶于水，不溶于有机溶剂，蛋白质分子表面带有亲水性基因，很容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能够顺利地进入到水溶液中，形成稳定的胶体溶液。
在有机溶剂存在的情况下，破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，使蛋白质变性沉淀，离心后，有机溶剂于试管底层(有机相)，DNA继续稳定的存在于上层水相，蛋白质沉淀存在于两相之间。
水相中的DNA在大量冷无水乙醇及单价阳离子存在的情况下，水会溶于乙醇中，而DNA从水相中析出，沉淀，通过离心回收。
方法：剪取适量检材，置于0.5ml离心管内，清洗方法同用Chelex100法提取DNA，加入适量纯水及终浓度为100μg/ml PK，37℃-56℃孵育15min至数10小时，有时间隔一段时间补加适量PK →13,000rpm 5min → 吸上清于另一管 → 加入等体积平衡酚 → 振荡或颠倒彻底混匀 → 13,000rpm5min →吸上清水相于另一管，加入等体积1：1混合平衡酚：氯仿 → 振荡或颠倒彻底混匀 →13,000rpm 5min → 吸上清水相于另一管 →加入等体积氯仿 → 振荡或颠倒彻底混匀 →13,000rpm 5min → 吸上清水相于另一管 →加入2.5倍体积冷无水乙醇冷冻保存10min以上 →13,000rpm 5-10min → 弃上清 → 室温凉干或100℃ 5min烤干 → 加入10-20μl纯水 → 室温溶解或100℃5min帮助溶解 → 离心上清备用(三)磁珠法原理：(异)硫氰酸胍(GuSCN)是强烈蛋白变性剂，不破坏蛋白质一级结构，能破坏细胞膜及核膜蛋白，并使核酸酶失活，释放DNA。
