有机酚法和Chelex_100法提取不同组织微量DNA效果比较

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4种方法提取口腔致病菌DNA效果的比较

4种方法提取口腔致病菌DNA效果的比较王宁;都佳寅;张卫军【摘要】目的:比较酚-氯仿方法、Chelex-100提取方法、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)提取方法及试剂盒提取口腔致病菌DNA的效果.方法:用4种方法提取具核梭杆菌、嗜酸性乳酸杆菌、粘性放线菌及变形链球菌的DNA,比较OD260、OD260/OD230及OD260/OD280数值,同时进行基因组及扩增后的目的基因电泳,检测DNA的完整性及对PCR的影响.结果:Chelex-100方法提取的样本所含DNA浓度较高,但蛋白类的杂质较多.除粘性放线菌外,其他3种方法去除蛋白类杂质效果的差异无统计学意义.CTAB法和酚-氯仿法都可以较好地去除碳水化合物类杂质,对嗜酸性乳酸杆菌,CTAB的效果最佳(P<0.05).粘性放线菌对试剂盒提取效果有很大影响.结论:对DNA纯度及完整性要求不高的后续实验,Chelex-100为首选方法,否则经典的酚-氯仿方法及改进后的CTAB方法为首选方法.不同的细菌种类显著影响试剂盒的提取效果.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2018(031)009【总页数】4页(P1253-1256)【关键词】DNA提取;聚合酶链反应;电泳【作者】王宁;都佳寅;张卫军【作者单位】天津中医药大学第二附属医院口腔科 ,天津市 300150;天津市南开医院口腔科;天津中医药大学第二附属医院口腔科 ,天津市 300150【正文语种】中文【中图分类】R780.2目前对口腔致病菌的检测方面，基因组水平检测手段的应用日益广泛[1]。

由于口腔致病菌具有量少、菌落成分复杂等特点，不同DNA提取方法所得样品的纯度、浓度及完整性等方面存在较大差异[2，3]。

本实验从目前常见的酚-氯仿方法、Chelex-100提取方法、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)提取方法及试剂盒这4种方法中，筛选1种适合提取口腔常见致病菌DNA的方法，减少后续实验假阴性的可能性,同时兼顾快速、经济等方面。

Chelex—100法提取DNA用于差异甲基化基因座检测的研究

Chelex—100法提取DNA用于差异甲基化基因座检测的研究目的通过对Chelex-100提取法提取的DNA用于酶切的研究，为差异甲基化在法医实际工作中的应用性研究提供一种快速提取酶切底物的方法。

方法HhaⅠ酶切基因组DNA，PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳检测，254 nm紫外灯下观察。

结果Chelex-100提取法提取的杂合子样本DNA加酶组只观察到来自父源的等位基因片段，而未加酶组能够观察到来自父源和母源的等位基因片段。

结论Chelex-100提取法提取的DNA能够作为酶切底物应用于差异甲基化基因座的研究。

[Abstract] Objective To provide a method of rapid extraction of enzyme substrate for differential methylation applied research in forensic practice by the study of the Chelex-100 extraction to extract DNA. Methods Genomic DNA was digested by Hha Ⅰ，with PCR amplification，detected with 2% agarose gel electrophoresis and observed under ultraviolet lamp，whose wavelength was 254 nm. Results The DNA samples with enzyme extracted by Chelex-100 from heterozygous observed was only the paternal allele fragments，while the paternal and maternal allele fragments were observed in the control group. Conclusion The DNA extracted with Chelex-100 extraction can be used as enzyme substrate，which is applied to study the differential methylation gene loci.[Key words] Differential methylation；polymerase chain reaction；Chelex-100越来越多的研究资料表明，来自双亲的同源染色体或者等位基因有功能上的差异：有些只有父源的基因有转录活性，而母源的等位基因则一直处于沉默状态，另一些基因的情况则相反。

两种DNA比较

自20 世纪50 年代Wat son 和Crick 提出DNA 双螺旋模型以来,分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展。

DNA 作为分子生物学研究的基础,在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深入,在此基础上产生的基因工程技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用。

研究和应用DNA 的基础是提取纯化结构完整的DNA ,为此针对不同来源的DNA 建立了不同的提取纯化方法。

本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物来源的DNA 的传统提取方法及近年来诸多的改良方法进行综述。

1 动物来源的DNA 的提取1. 1 经典提取方法酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法是提取DNA 最为经典的方法,目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的,这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞。

在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质,再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。

甲酰胺法是利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA 的结合,然后利用透析来处理DNA 样品。

这些经典方法获得的DNA 纯度很高,能够满足各种试验的要求,但操作繁琐,用时长,且所用试剂具有一定的毒性。

1. 2 玻璃棒缠绕法该法用盐酸胍裂解细胞,然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上,用一个带钩的或前端为U 形的玻璃棒在这两层液体的交界面慢慢搅动,沉淀出的胶状DNA 缠绕在玻璃棒上。

玻璃棒上的DNA 经多次乙醇浸泡并于室温下蒸干乙醇,由胶状逐渐回缩,然后浸入TE中过夜,使其重新吸水膨胀进而和玻璃棒分离。

这种方法对操作技术要求较高,但简单快速。

1. 3 血细胞DNA 的快速提取法采用非离子变性剂NP40 (乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解细胞,提取细胞核,然后用酚/氯仿抽提DNA。

这样从血液中分离获得的DNA 纯度高,能够满足各种临床检验和实验的需要。

也可采用NP40 和Tween- 20 同时作用破碎细胞膜,以避免SDS对以后步骤的负面作用。

法医DNA提取方法

• 注意事项：
• 血痕要求在75～80 ℃之间保温5 min，若检
材为陈旧性，尚应适当延长保温时间5～ 10min。
一种改良方法
• 将 chelex-100 法或碱性裂解法处理的血痕，用等体积的饱和酚-氯仿（1:1）处理一次，再用冰无水乙醇沉淀，挥干后，加适量无菌水溶解。这样提取的DNA，经过PCR 扩增电泳后，显示结果会更好。
Chelex-100法：
• 优点：快速、方便，且仅在一个管内进行，减少污染 • 缺点：DNA提取的浓度小，对检材条件要求较高，对被泥土、石灰粉、染料污染的检材效果不佳，常导致扩增效率下降或失败。
Chelex-100法：
• 所取全血与DNA含量之间的关系：全血（ul）理论DNA 产量（ug） 1 0.04~0.06 10 0.2~0.4 100 2~4 200 4~6 400 8~10
Chelex-100法：
• 注意事项：
• A．核膜和其它试剂一起保留下来了，DNA纯度比有机溶剂提取法低； • B．chelex-100法将DNA双螺旋打开，不能用像EB 染料插入方法进行定量，只能用杂交方法定量； • C．由于沸水浴8min和快速振荡使DNA片段受到损害而断裂，对于大于500bp的片段扩增成功率低。 • D．chelex-100在配置数小时后螯合能力就有下降趋势，将会导致提取的DNA溶液中有各种金属离子或抑制剂，对PCR反应可能有影响。
和真菌的影响，生物检材中可能存在的病原体与FTA卡接触后也将失活。保存的DNA可以方便快捷的进行纯化和洗脱。
FTA技术
• 注意事项：
•
直接使用固定在FTA载体上的全血DNA进行 STR复合扩增，可以得到稳定的分型结果，但是相

DNA提取

DNA提取的几种方法(1)浓盐法：利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。

在提取过程中为抑制组织中的DNase 对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA 与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA. （3）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。

此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。

此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 .（4）水抽提法: 利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.真核细胞DNA的制备一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA 以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。

全血中DNA 6种提取方法的比较

全血中DNA 6种提取方法的比较畅晶晶;张素华;李莉【期刊名称】《法医学杂志》【年(卷),期】2009(025)002【摘要】目的比较经典有机法、改良有机法、常规Chelex-100法、IQ法、Qiagen法及SP法6种方法在提取DNA纯度和得率上的差异.方法收集10名健康志愿者的静脉全血各5mL,分别采用6种方法提取基因组DNA,通过紫外分光光度仪和荧光定量分析技术检测产物的纯度和浓度,计算得率,并使用统计软件对结果进行分析.结果常规Chelex-100法所得DNA的纯度明显低于其他方法,而另外5种方法所得DNA纯度的差异不具有统计学意义.改良有机法得率最低,IQ法得率最高.统计结果表明试剂盒方法抽提全血DNA的得率明显高于经典有机法、常规Chelex-100法和改良有机法,其差异具有统计学意义.结论与有机法和常规Chelex-100法相比,高质量试剂盒类方法更有利于法医学检材的DNA抽提.【总页数】4页(P109-111,114)【作者】畅晶晶;张素华;李莉【作者单位】复旦大学上海医学院法医学系,上海200032;司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室,上海200063;司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室,上海200063;苏州大学医学部法医学系,江苏苏州215123;司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室,上海200063【正文语种】中文【中图分类】DF795.2【相关文献】1.高质量竹黄菌全基因组DNA的提取方法比较 [J], 黄青青;乙引;魏洪美;任锡毅;刘永翔2.烟粉虱全基因组DNA四种提取方法的比较 [J], 戴恬美;吕志创;万方浩3.全血中DNA的5种不同提取方法比较研究 [J], 黄大鹏;陈建华4.黑曲霉Aspergillus niger全基因组DNA提取方法的改良与比较 [J], 蔡程山; 王雨; 白飞荣; 翟磊; 张天赐; 胡海蓉; 姚粟5.三种全血基因组DNA提取方法的比较 [J], 周红伟;田存章;张少恒;缑小曼;张艺丹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

各种检材DNA的提取

酚-氯仿法——注意事项

酚-氯仿法是目前最常用、最可靠的方法之一，无论是血液还是血痕标本均适用所提取的DNA纯度高，可满足各种分子生物学检测技术的需要
但该法操作较为繁琐、耗时长，影响了其在实践工作中的广泛应用。

（三）碱性裂解法

碱性裂解法是指在强碱作用下，使构成细胞的蛋白质成分谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸残基等迅速发生电离，从而快速破坏蛋白质的一级结构。检材在强碱性pH条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞膜及核膜，使核酸酶变性及DNA释放。

Chelex-100法——步骤

取适量血痕检材置1.5ml EP管中，加入1ml 灭菌无菌水浸泡20min，>10000rpm离心3min，用1000ul进样器小心地吸去上清液。加5％chelex-100 200u1，于水浴锅中56℃水浴30min，振荡混匀。沸水中煮10min，取出后立即置于冰上3min，>10000 rpm离心1min。上清液即为DNA提取液，可在2-6℃保存1个月，在-20℃长期保存。

酚-氯仿法——步骤

取适量血痕检材置于1.5ml EP管中，加入1ml 无菌水浸泡20min，>10000rpm离心3min，弃去上清。加入500μ l STE液悬浮沉淀物，加入20μ l 10 % SDS 及10 mg/ ml 蛋白酶K 4 μ l ，54℃水浴消化3小时
离心取上清液至另一EP管中，加入500μ l苯酚/氯仿/ 异戊醇混合物，振荡到出现絮状物，>10000rpm离心 3min。
各种检材DNA的提取
夏
水
秀
一、DNA的提取方法

3种方法联合运用提取人体脱落上皮细胞DNA

3种方法联合运用提取人体脱落上皮细胞DNA郭燕霞;陈松;刘开会【摘要】目的寻求提高法医物证检验中附有人体脱落细胞载体检材的DNA检出率的方法. 方法根据案件检材的具体条件,选择3种提取方法即Chelex-100法、Chelex-100联合有机法和Chelex-100联合磁珠法. 结果采用了分步提取DNA法,可充分、有效地提取微量DNA,提高了人体脱落上皮细胞有效DNA的检出率. 结论根据第一步提取方法的检测结果,来调整下一步的提取策略,如是否加以纯化浓缩,可增加人体脱落上皮细胞有效DNA的检出率.【期刊名称】《法医学杂志》【年(卷),期】2009(025)001【总页数】2页(P42-43)【关键词】法医遗传学;提取法;脱落上皮细胞【作者】郭燕霞;陈松;刘开会【作者单位】公安部物证鉴定中心,北京,100038;公安部物证鉴定中心,北京,100038;公安部物证鉴定中心,北京,100038【正文语种】中文【中图分类】DF795.2在法医物证的实际检案中，越来越多的案件由于案件本身性质、作案过程及犯罪嫌疑人的反侦察意识增强等原因，在一些现场勘查中，很难发现血斑、精斑、毛发、烟头等常规生物检材。

随着DNA技术的不断发展，附有人体脱落细胞的载体检材成为当前法医界一个令人关注的热点，是许多案件侦破的关键证据[1-2]。

笔者结合日常办案时对人体脱落细胞检材的检验经验，根据案件检材的具体条件，分别采用了三种阶梯式提取方法。

1.1 材料1、2、3a和3b号检材均选自日常检案中疑载有人体脱落上皮细胞的案件检材。

其中1号检材为犯罪嫌疑人在凶杀案现场遗留的一只旧拖鞋，脚底部可见大量脱落上皮细胞。

2号检材提取于一火车上无人认领的行李包中的一件衬衣，包内藏有毒品。

3号检材为某杀人灭尸案嫌疑人家中搜到的疑为受害人（一老年妇女）的手表及戒指，其上无明显肉眼可见的可疑物质。

1.2 DNA提取1号检材取纱线反复擦拭转移拖鞋上脚底接触面的可疑人体脱落上皮细胞；2号检材取其领部与人体皮肤经常接触部位的适量布片（若领部有小毛球优先选用）；3号检材分别对可能较经常接触人体皮肤的部位，用纱线反复擦拭转移，手表擦拭物编号为3a，戒指擦拭物编号为3b。

DNA提取方法原理简介

DNA提取方法原理简介DNA是脱氧核糖核酸，是绝大多数生物的最主要的遗传物质。

随着生命科学技术的发展，从生物样本中提取DNA的方法也日益多样、成熟。

下面就几种常见的DNA提取方法的原理作个简介。

1 酚氯仿法酚氯仿法为DNA提取的经典方法，价格较低。

加入Tris饱和酚能使蛋白质变性，令DNA与组织蛋白质分开，同时抑制DNase的作用，保护DNA免于降解。

随后加入的氯仿/异戊醇经过混匀和离心后，能使溶液分为上层水相和下层有机相。

由于DNA存在于水相，蛋白质等杂质存在于有机相，这样就能使DNA与其他杂质分开。

吸取上层水相后，加入无水乙醇能使DNA从溶液中沉淀下来，经过离心去除上清液就能得到DNA沉淀了。

可以再使用75%乙醇洗涤一次，去除残留的一些有机物，使DNA更纯。

最后等乙醇挥发干燥后，加入TE缓冲液就能得到理想的DNA样本。

2 Chelex-100法Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学树脂，可以螯合多价离子。

Chelex-100法提取DNA是一种快速方便的方法，但DNA模板的纯度比较低，不适合长期保存。

Chelex-100溶液与血液样品等混匀后，通过煮沸、离心等步骤，可以使样品中大部分蛋白质变性，金属离子被Chelex-100螯合，从而使样品上清液的DNA模板能用于后续反应。

3 膜吸附法常用硅胶膜作为吸附DNA的载体。

部分的商品化DNA提取试剂盒会采用这种方法。

提取的DNA纯度高，效果好，但试剂盒成本较高。

其原理是在高盐缓冲液条件下，硅胶膜会吸附DNA，经过数次缓冲液洗涤离心后，吸附在膜上的DNA已经很纯，这时再用适当体积的低盐TE缓冲液进行洗脱。

4 磁珠法经过特殊表面处理的磁珠，在缓冲液条件下对DNA有很强的吸附力。

部分的商品化DNA提取试剂盒会采用这种方法。

提取的DNA纯度高，效果好，但试剂盒成本较高。

其原理是在缓冲液条件下，磁珠能吸附DNA，通过使用磁力棒能使磁珠聚集，去除含杂质的上清液。

法医实验室几种常用DNA提取方法及比较

法医实验室几种常用DNA提取方法及比较法医实验室几种常用DNA提取方法及比较(一)Chelex100法原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。

在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。

检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。

方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于0.5ml离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,000rpm离心5min，上清丢弃，管底留约20μl左右液体及检材基质，加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15mi n至数10小时不等，100℃8min，13,000rpm离心5mim，上清备用。

评述：1、Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法，Chelex100法是万能的。

目前，我们一切纯化方法都在Chelex100法的基础上进行，Chelex100法又不是万能的。

2、Chelex100法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制PCR反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。

所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。

特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。

DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜一个坑”，防止混乱检材。

肝素抑制PCR反应，血红素抑制PCR反应，所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。

在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下，多洗是检验成功所必须的。

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基因座遗传多态性研究. 洛阳医专学报, 2001, 19( 1) : 34 8 薛小琦, 莫耀南, 艾红伟. STR FGA 基因座变异 1 例. 法医
学杂志, 2001, 17( 2) : 121 9 刘秋玲, 任新尧, 吕德坚, 等. 亲子鉴定中 2 个 STR 基因座
突变 1 例. 中国法医学杂志, 2001, 16( 4) : 238 ( 2004- 04- 13 收稿责任编辑赵秋民)
1 材料与方法
1. 1 材料 4 例脐带血、羊水、胎盘、母血为胎儿出生时收集样本; 4 例绒毛样本与孕母血为孕 2 个月左右行刮宫术收集的绒毛与宫腔出血。抽取 1 例父子的静脉血并制成血纸片、血纱布, 同时收集其口腔拭子、发根毛囊。静脉血样、脐带血用 1/ 10 体积 20 g/ L 的 EDTA 抗凝, - 20 保存备用; 胎盘、绒毛用生理盐水冲洗数次后, - 20 保存备用。 1. 2 DNA 制备 1. 2. 1 有机酚法提取 DNA: 血样、羊水、血纸片或血纱布、口腔拭子、毛囊的 DNA 提取: 取 100 l 血样、100 l 羊水于1. 5 ml Ependorf 管中, 血纸片或血纱布( 血斑约 0. 5 cm) 、口腔拭子、带毛囊发根( 5 根) 置于 500 l 生理盐水中, 室温 10 min 后放入1. 5 ml Ependorf 管中, 加入等体积 2 蔗糖- Triton X- 100 溶液 ( 0. 64 mmol/ L 蔗糖, 0. 01 mol/ L MgCl2, 0. 02 mol/ L Tris- HCl, 体积分数为 2% 的 Triton X- 100
溶液) , 混匀后 12 000 r min- 1离心 5 min, 小心去上清, 留底部血膜, 加入 EDTA- Na2( 75 mmol/ L NaCl, 24 mmol/ L EDTA- Na2, pH= 8. 0 ) 溶液 200 l、SDS ( 100 g/ L) 20 l、蛋白酶 K( 10 g/ L) 5 l, 混匀, 37 水浴 4 h 以上。加入等体积的酚、酚和氯仿 ( 1: 1) 、氯仿各抽提 1 次, 加 1/ 10 体积的 3 mol/ L NaCl 和 2. 5 倍体积的冷无水乙醇混匀。12 000 r min- 1离心 5 min, 弃上清, DNA 沉淀晾干后, 溶于15~ 20 l 无菌双蒸水中, 取 1. 5 l 用于 DNA 扩增。胎盘、绒毛 DNA 的提取: 将胎盘、绒毛用生理盐水冲洗数次后取约 0. 1 g 于 1. 5 ml EDTA- Na2 缓冲液中研磨匀浆。取 50 l 匀浆液, 加入 500 l EDTA- Na2、1/ 10 体积的 SDS( 100 g/ L) 和 15 l 蛋白酶 K( 10 g/ L) , 于 37 水浴 4 h 以上。酚抽提及 DNA 沉淀同血样抽提。 1. 2. 2 Chelex - 100 法提取 DNA[ 5] : 将新鲜血样 ( 100 l) 、羊水( 100 l ) 、胎盘或绒毛组织匀浆液( 50
女, 36 岁 , 硕士, 讲师, 研究方向: 遗传病的基因诊断, E- mail: chenhhn@ tom. com
关键词微量组织; DNA 提取; STR 位点中图分类号 R394- 33 摘要目的: 比较有机酚法和 Chelex- 100 法提取不同组织微量 DNA 的效果。方法: 分别用有机酚法和 Chelex - 100 法从外周血、脐带血、绒毛、羊水、胎盘、血斑、口腔分泌物、发根毛囊中提取微量基因组 DNA, 进行 D12S391、 D5S818 基因座扩增, 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析。结果: 外周血、脐带血、绒毛、胎盘、口腔分泌物、发根毛囊均适于用 Chelex- 100 法提取 DNA, 效果与有机酚法相似。结论: Chelex 法是一种高效而快速的微量 DNA 提取方法, 适用于产前诊断和法医鉴定微量组织的检测。
Comparison the effect of phenol/ chloroform method and Chelex - 100 method on micro DNA extraction using different tissues
CHEN H ui1) , LIU Yongbo1 ) , XIE Qingrui2) , LI Xiaowen1 ) , ZHANG Qingxian3 )
l) 、血纸片或血纱布、口腔拭子、发根( 5 根) 置于 500 l 去离子水中, 室温下 10 min, 12 000 r min- 1离心 5 min, 弃上清, 重复 2 次。加入 200 l Chelex 100( 50 g/ L) , 置 56 30 min 以上, 震荡15~ 30 s。置 100 10 min, 震荡15~ 30 s, 于12 000 r min- 1离心 5 min, 取 5 l 用于 PCR 扩增。 1. 3 PCR 反应体系在反应管中加入 10 STR buffer 2. 5 l, D5S818、D12S391 左右侧引物各 1 l( 25 mol/ L) , Taq DNA 聚合酶 1. 5 U/ 管, 有机酚法提取 DNA 1. 5 l 或 Chelex 法提取 DNA 5 l, 补充水至 25
Key words micro tissue; DNA extraction; short tandem repeats ( STR) Abstract Aim: To compare the effect of phenol/ chloroform method and Chelex- 100 method on micro DNA extraction us ing different tissues. Methods: The genome DNA was extracted by phenol/ chloroform method and Chelex- 100 method from pe ripheral blood, fetal umbilical cord blood, villi, amniotic fluid, placental tissue hair, blood blot, hair, and oral secretion, re spectively. With STR D12S391and D5S818 amplification and electrophoresis on denaturation polyacrylamid gel, the extracted DNA was analyzed. Results: T he Chelex- 100 DNA extracting method was adept to the different tissues, such as peripheral blood, fe tal umbilical cord blood, villi, placental tissue, hair, and oral secretion with similar efficiency to phenol/ chloroform method. Concl usion: The Chelex- 100 DNA extracting method is efficient and quick, which is useful to forensic identification and prena tal diagnosis.
1 Brenner CH. A note on paternity computation in cases lacking a
有机酚法和 Chelex- 100 法提取不同组织微量 DNA 效果比较*
陈辉1) 刘永波1) 谢庆瑞2) 李晓雯1) 张钦宪3)
1) 郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室郑州 450052 2) 漯河市第一人民医院妇产科漯河 460000 3) 郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室郑州 450052
参考文献
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在法医鉴定和产前诊断中, 用于限制性片断长度多态性 ( restriction fragment length polymorphism, RFLP) 分析和 PCR 扩增分型或 STR 研究的 DNA 样本来源多样, 如新鲜全血、精斑、毛发、烟头、案发现场微量血迹、绒毛、胎儿羊水细胞等, 同时取材部位、取材量和取材时间都受到限制, 因此建立稳定、高效而快速的 DNA 提取方法对法医鉴定和产前诊断具有十分重要的作用。作者比较有机酚法和 Chelex 100 法提取不同检材中的 DNA, 以期寻求从微量检材中快速提取 DNA 的简便方法, 为应用 STR 位点多态性进行准确快速的法医鉴定以及连锁分析检出携带者, 并对高危胎儿进行产前基因诊断奠定基础[ 1~ 4] 。
* 河南省自然科学基金资助项目 0111022300