下载文档原格式
一步法和两步法RT-PCR的根本区别？答：有中间产物cDNA，但稍微麻烦一点；一步法简单，但得不到cDNA。
两步法一步法同两步法RT-PCR的比较:两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。
然而一步法RT-PCR具有其他优点。
一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。
一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA 样品都被扩增。
对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。
2．10增加RT-PCR特异性第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。
随机引物法是三种方法中特异性最低的。
引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。
这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。
为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA 的比例。
随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。
因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。
它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。
因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。
因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。
建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。
oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。
ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。
负链RNA采用PLM-RACE一、样品处理收集新鲜尿囊液，差速离心4000×5min，8000×5min，12 000×5min，取上清冻存备用二、提RNA常规方法，延长作用时间。
每个样品两份（5′和3′）取400μL新鲜尿囊液，加入600μL Trizol，混匀后室温静置10min。
加入200μL氯仿，20μg糖原，振荡混匀，12 000rpm，4℃离心10min。
取500μL上清，加入500μL异丙醇，-20℃静置10min后，12 000rpm，4℃离心10min。
70%酒精漂洗两次，沉淀干燥。
三、3′RACE1、沉淀干燥的RNA，用20μL DEPC水溶解，取出4μL测浓度与纯度2、3′端连接锚定引物（25μL体系）10×T4 RNA Ligase Buffer（A TP free） 2.510mM ATP 10.1%BSA 1 (或1mg/mLBSA 2.5)50 U/μL RNasin 0.510 U/μL T4 RNA Ligase 325μmol/L CL+ 1RNA 16 (14.5)37℃2h 或10℃16~18h，75℃15min3、酒精沉淀，70%酒精洗涤，17μL DEPC水溶解4、连接产物RT-PCR (25μL体系)5×M0-MLV RTase Buffer 5RNasin 0.525μmol/L CL- 1M0-MLV RTase 110mM dNTP 1上一步RNA连接产物16.542℃作用1.5h，-20℃保存5、PCR用反向锚定引物CL-和3SR扩增四、5′RACE1、沉淀干燥的RNA，用34μL DEPC水溶解2、反转录5×M0-MLV RTase Buffer 10RNasin 125μmol/L 5LF 2M0-MLV RTase 1.510mM dNTP 2RNA 33.542℃作用2h3、cDNA纯化或用PCR纯化试剂盒Axygena、50μL（等体积）0.6 mol/L NaOH，60℃20minb、20μL NaAc，80μL DEPC水，500μL无水乙醇，-70℃2hc、12000rpm 4℃30mind、70%酒精洗涤，干燥，溶解4、RNA连接cDNA 3′端单链连接（25μL体系）10×T4 RNA Ligase Buffer（A TP free） 2.510mM ATP 10.1%BSA 1 (或1mg/mLBSA 2.5)10 U/μL T4 RNA Ligase 325μmol/L CL+ 1纯化的cDNA 16.5 (15)37℃2h 或10℃16~18h，75℃15min5、套式PCR第一轮PCR反应引物为CL -和5LF，产物100倍稀释后做第二轮反应的模板。
RACE技术第一 RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE 技术进行了改进，从而丰富了ＲＡＣＥ技术的类型。
目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、RAC-RACE和T-RACE等等，但没有一种RACE技术适合克隆所有类型的RNA。
因此，本文将通过介绍各种RACE技术的发展、原理及应用，比较认识各种RACE技术的优缺点，并对RACE的前景进行讨论。
第二RACE的原理1.经典RACERACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
①3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
我做RACE两年了，个人觉得基因特异性引物对结果的影响还是很大的。
我用的是BD SMART RACE试剂盒，一共扩出三个基因全长（用了不到一年的时间，现在快毕业了，在做后期的工作）。
我用的是师兄剩下的试剂盒，当时盒子带的DNA聚合酶已经用完了，老板当然不愿意花那么多钱买新的，我觉得只要反转录酶还有，用普通的Taq酶应该没问题，于是开始下力气作RACE，可是将近半年一无所获。
在快要开题的时候，终于云开雾散，见了晴天，三个目的基因的3’端都得到了，其中一个基因的5’也出了结果。
回头看看，发现什么都没换过，反转录产物一直用的都是同一批，不同的只有引物（试过将近20个基因特异性引物啊，之前真的都要绝望了），可见引物设计的好坏是有决定性影响的。
现在将我做RACE的一些经验和大家谈谈，也当回答楼上几位的问题：1. 作3’RACE用TaKaRa的盒子足够了，还能省点钱；5’RACE难一些，SMART RACE比较好2. RNA的质量要好，否则一切无从谈起。
3. RACE前，最好做个RT-PCR验证一下反转录产物的质量（当然是在已知序列长度允许的前提下），如果能得到预期长度的条带，要是通过测序再确定以下当然更好，这时再开始做RACE才会比较放心——自己要的鱼在水里了，才钓得出来，要不然再好的鱼竿、再好的诱饵也白搭。
4. 不要迷信各种引物设计和分析软件，那些都是辅助工具，用那些东西搞出来的引物常常不灵的，做RACE引物设计最要命的是Tm值，如果Tm足够高，退火温度就可以设的很高，那样什么发夹结构，什么在非目的位点的错配，基本上可以灰飞烟灭。
正所谓做大事不拘小节，试验试验，很多时候就是要试的，不要被这个那个软件的结果弄得缩手缩脚，在我的实验中，有几个被软件认为很糟糕的引物（错配碱基达到十个，但不在3’端，明显而稳定的发夹结构）都在实战中被证明是非常优秀的。
5. 第一轮什么都没有，或者弥散都不要害怕和灰心，一个锚定引物，一个基因特异性引物一轮就出特异条带，那才稀奇，做个二次PCR，或者巢式PCR经常会有惊喜，我的一个目的基因3’做了三轮才出来，所以千万别灰心。
cDNA末端的快速克隆(RACE技术)1.基本原理对RNA结构进行分析时，一般通过RT-PCR反应扩增目的区域，然后再将扩增后的目的DNA片段进行克隆、测序来进行。
但一般的RT-PCR反应很难扩增某一基因从mRNA得到的全长cDNA片段。
在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列又是十分重要。
RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法能有效地解决这一问题：通过已知的cDNA序列情况，进一步扩增此cDNA的5′末端或3′末端。
图1. 5′-RACE法原理图（1）以目的mRNA为模板，使用5′末端P标记的RT引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA。
（2）使用RNase H分解Hybrid DNA-RNA中的RNA链。
（3）使用T4 RNA Ligase使单链cDNA进行环化或形成首尾连接物。
（4）进行PCR扩增。
图2.各引物设计位置图2.注意事项引物设计时，设计引物的位置、结构、引物的长短等对实验结果影响很大，应注意以下几点。
1．反转录引物◇ 由于单链连接的需要，反转录引物必须进行5′末端P标记。
5′末端P标记可以在合成引物时直接进行。
◇ 反转录引物的长度以12～15 mers为宜。
◇ 设计反转录引物时，尽量选定靠近5′末端区域。
2．PCR引物◇ 引物长度以20 mers左右为宜。
◇ 引物中的GC含量应在50%左右，保证GC、AT分布均匀，避免局部富含GC或AT，特别是引物的3′末端不要富含AT。
◇ 避免引物自身形成二级结构（发夹结构等）。
◇ 1st PCR、2nd PCR用引物尽量避免形成引物二聚体，特别是3′端的3～4个碱基不要与配对引物形成互补序列。
3. 5′-RACE扩增的DNA片段的测序由于mRNA库中的每个分子的mRNA的5′端不一定全部完整，往往是参差不齐，特别是提取的RNA的状态不佳时，这种情况将更为严重。
所以在进行5′-RACE 实验时，扩增的PCR产物往往是长短不一的DNA片段混合物（相差数个至数十个碱基）。
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
RT-PCR技术RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。
使用天为时代公司的总RNA提取系统（如目录号 DP405和DP406），所获得的RNA的纯度高，基因组DNA污染少，用于RT-PCR 系统可得到满意结果。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
RT-PCR引物的选择随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。
适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。
主要用于单一模板的RT-PCR反应。
Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA。
（原核生物的RNA、真核生物的Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。
）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
基因特异性引物：与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。
天为时性引物代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性引物连用。
RT-PCR影响因素RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。
◇建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。
◇对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。
较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。
◇大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。
但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。
RACERACE(rapid-amplification ofcDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多新基因的方法和手段，如图谱技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二减法技术以及cDNA文库筛选技术等。
但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。
cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR 技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PC R。
该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz 等11999)。
对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly (A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h (60 度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。
随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTE CH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术术。
邢桂春等(2001)先后使用上述两种盒进行RACE反应，结果发现使用Marathon TM所得到的片断总是比采用SM ARTsup]TMRACE盒到所得到的片断短。
其原因在于Marathon TM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。
所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTT M RACE盒。
以下就国内目前应用最广的SMART TM RACE盒为例，简要概述RA CE技术的原理和操作过程。
SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。
RACE的优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。
此方法会产生较少的错误条带。
此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
RACE引物的设计：基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GS P1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。
重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。
另外，避免使用与A P1互补的引物，尤其是在3‘末端。
如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。
只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。
在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。
随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。
验证基因特异性引物的对照：单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。
这样不应该产生任何的条带。
如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。
利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。
）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的c DNA来产生阳性对照。
可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。
如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。
纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。
哺乳动物的mR NA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。
非哺乳动物的mRNA应略小具体的实验步骤cDNA第一条链的合成：我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。
加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。
注意：在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。
将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。
直接进行第二链的合成。
cDNA第二链的合成：第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。
T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。
我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mR NA。
建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。
非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。
通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。
接头的连接及连接产物的稀释按照程序进行连接反应。
如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTA buffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。
RACE RACE－－PCRPCR扩增扩增•进行5’和3’的RACE－PCR扩增。
•利用以下的程序进行降落PCR反应：94度30秒5个循环：94度5秒72度4分5个循环：94度5秒70度4分钟20－25个循环：94度5秒68度4分钟注意：我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。
当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。
•可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。
如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。
最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。
如果片断的长度在2－5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3m in，对于5－10kb的条带，延伸时间增加到10min。
