1．1DNA重组技术的基本工具1．基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。
2．不同生物基因能拼接在一起的理论基础是DNA分子都是由4种脱氧核苷酸构成的规则的双螺旋结构。
3．外源DNA导入受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
4．限制性核酸内切酶的作用特点是识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割。
5．限制酶和DNA连接酶的作用部位都是两个核苷酸间的磷酸二酯键。
6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
基因工程的概念及其诞生与发展[自读教材·夯基础]1．基因工程的概念2．基因工程的诞生和发展(1)基础理论的重大突破：①DNA是遗传物质的证明；②DNA双螺旋结构和中心法则的确立；③遗传密码的破译。
(2)技术发明使基因工程的实施成为可能：①基因转移载体和工具酶相继发现；②DNA合成和测序技术的发明；③DNA体外重组得到实现及重组DNA表达实验获得成功。
(3)基因工程的发展与完善：1983年，世界第一例转基因烟草培养成功，基因工程进入迅速发展阶段。
1988年PCR 技术的发明，使基因工程进一步发展和完善。
1．通过分析基因工程的概念，讨论基因工程的原理是什么。
提示：基因重组。
2．将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内，通过大肠杆菌能大量生产人胰岛素。
请分析人胰岛素基因能在大肠杆菌体内表达的理论基础是什么。
提示：生物共用一套遗传密码。
[跟随名师·解疑难]1．对基因工程概念的理解操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因DNA分子水平剪切→连接→导入→表达定向地改造生物的遗传性状2．基因工程的原理和理论基础(1)原理：基因重组。
(2)理论基础：①拼接：不同生物DNA的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸；空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。
②表达：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。
基因工程操作的基本工具1．限制性核酸内切酶(1)来源：主要从原核生物中分离出来。
(2)2．DNA连接酶(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
(2)种类：种类比较项目E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只能“缝合”具有黏性末端的双链DNA片段既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，也可以“缝合”双链DNA片段的平末端3．运载体(1)作用：将外源基因送入细胞中。
(2)种类：质粒、λ噬菌体衍生物和动植物病毒等。
(3)1．结合DNA复制的过程，分析限制酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同。
提示：限制酶作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于两个碱基之间的氢键。
2．结合教材P5图1-3，分析黏性末端和平末端是如何形成的。
提示：限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分割开，就形成黏性末端，而从识别序列的中心轴线切开就产生平末端。
3．限制酶切割产生的黏性末端和平末端在恢复时需用什么酶？所用的该种酶是否可以不加选择？为什么？提示：DNA连接酶。
不可以，E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端。
[跟随名师·解疑难]1．DNA连接酶与限制性核酸内切酶的比较(1)区别：作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接(2)两者的关系可表示为：2．限制性核酸内切酶与解旋酶的区别(1)相同点：都是作用于DNA分子中的化学键。
(2)不同点：作用部位不同，前者作用于磷酸二酯键，后者作用于氢键。
3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质相同，都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键不同点是否需要模板不需要需要接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯键作用结果将已存在的DNA片段连接合成新的DNA分子用途基因工程DNA复制4．上述四种酶的作用部位图解(1)作用于a(磷酸二酯键)的酶有：限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶。
(2)作用于b(氢键)的酶是解旋酶。
[特别提醒](1)不同DNA 分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA 分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(2)不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对。
限制性核酸内切酶的作用[例1] 推断以下说法中，正确的是( )限制酶名称 识别序列和 切割位点限制酶名称 识别序列和 切割位点Bam H Ⅰ GG ↓ATCCKpn Ⅰ GGTACC ↓Eco R Ⅰ CA ↓ATTCSau 3A Ⅰ G ↓ATCHind Ⅱ GTYR ↓AC Sma ⅠCCCG ↓GG注：Y ＝C 或T ，R ＝A 或G 。
A ．限制酶切割后不一定形成黏性末端 B ．限制酶的切割位点一定在识别序列的内部 C ．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端 D ．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列 [思路点拨][精讲精析] 由表中信息可知，Hind Ⅱ能识别4种不同的核苷酸序列，选项D 错误；Sau 3A Ⅰ酶的切割位点在识别序列的外部，选项B 错误；Bam H Ⅰ酶与Sau 3A Ⅰ酶切割后能形成相同的黏性末端，选项C 错误；Sma Ⅰ酶切割后产生的是平末端，选项A 正确。
[答案] A规律方法 限制酶的识别序列和切割末端的判断(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。
如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGG GGTCC 以AT 为轴，两侧碱基互补对称。
(2)判断黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是：将黏性末端或平末端之一旋转180°后，看它们是否是完全相同的结构。
下列四条DNA 片段，可能是由同一种限制酶切割而成的是( )A ．①②B ．②③C ．③④D ．②④解析：只有②和④的黏性末端的碱基都是互补的，它们可能是由同一种限制酶切割而成的。
答案：D酶作用部位分析[例2] 下图为DNA 分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )A ．①②③④B ．①②④③C ．①④②③D ．①④③②[思路点拨][精讲精析] 本题考查不同工具酶的作用及作用特点。
图示中①表示该酶切割DNA 分子双链产生黏性末端的过程，用到的酶是限制性核酸内切酶；②是黏性末端连接的过程，用到的酶是DNA 连接酶；③是DNA 分子解旋的过程，要用解旋酶；④是DNA 复制过程，需要DNA 聚合酶。
[答案] C 易错提醒(1)DNA 连接酶的作用不是连接互补的碱基之间的氢键，而是脱氧核糖和磷酸间的磷酸二酯键。
(2)限制酶切割一次，会产生2个黏性末端或平末端，水解2个磷酸二酯键。
(3)限制酶的作用并非只是切取目的基因，还用于切割运载体。
运载体及其必备条件[例3]amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点。
若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是()[思路点拨][精讲精析]A项破坏了复制必需的序列，不能复制。
B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。
C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。
D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。
[答案] C归纳拓展对限制酶和载体切割位点的说明(1)若用于切割载体的限制酶有多个切点，则切割后载体可能丢失含有复制起始点的片段，重组DNA分子进入受体细胞后便不能进行自主复制。
(2)切点所处位置必须在载体本身需要的基因片段之外，以避免载体因目的基因的插入而失活。
[随堂基础巩固]1．实施基因工程的最终目的是()A．提取生物体的DNA分子B．对DNA分子进行人工剪切C．在生物体外对DNA分子进行改造D．创造符合人们需要的新的生物类型和生物产品解析：A、B、C三项均为基因工程操作的具体内容，但不是基因工程的目的。
实施基因工程的最终目的是通过基因操作定向改造生物的遗传物质，创造符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
答案：D2．下列关于限制性核酸内切酶的叙述，错误的是()A．限制性核酸内切酶可从原核生物中提取B．同一种限制酶切割不同的DNA分子产生的末端能够进行碱基互补配对C．限制酶能任意切割DNA分子，从而产生大量的DNA片段D．每一种限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列解析：限制酶存在于许多原核生物中，可以从中提取。
每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。
同一种限制酶切割不同的DNA产生的末端能够进行碱基互补配对。
答案：C3．下列有关DNA连接酶的叙述正确的是()①催化具有相同的黏性末端的DNA片段之间连接②催化具有不同的黏性末端的DNA片段之间连接③催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成④催化脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的形成A．①②B．③④C．①④D．②③解析：DNA连接酶催化相同(即互补)的黏性末端进行连接，而不是不同的黏性末端的任意连接。
DNA连接酶作用的部位是磷酸二酯键，不是氢键。
答案：C4．作为基因工程中的“分子运输车”，载体应具备的条件是()①必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上②载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制③必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选④必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去⑤大小应合适，太大则不易操作A．①②③④B．①②③⑤C．①②④⑤D．①②③④⑤解析：作为运载体应具备限制酶切点，标记基因，除此之外，还应具有自我复制能力，以及无毒害作用等特点。
答案：D5．下面是大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同，都是________，二者还具有其他共同点，如：①______________________，②________________(写出两条即可)。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为—A—TGCGC，则与之连接的目的基因切割末端应为__________________；可使用________________把质粒和目的基因连接在一起。
